Muutused inimese erütrotsüütide membraanis, mis on kokku puutunud Uncaria Tomentosa vesi- ja etanooliekstraktidega

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: Uncaria tomentosa (Willd.)DC on Lõuna- ja Kesk-Ameerikast pärit puitunud ronijaliik, mida on kasutatud astma, reuma, hüpertensiooni ja vere puhastamise ravis. Meie eelmine uuring näitas, et U.tomentosaväljavõttedinimese erütrotsüütide kuju muutus, mis võib olla tingitud ekstraktides sisalduvate ühendite sattumisest erütrotsüütide membraani. Käesoleva uuringu eesmärk oli kindlaks teha, kuidas UI.tomentosa ekstraktides sisalduvad ühendid inkorporeerivad inimese erütrotsüütide membraani. Uuringus on hinnatud U. tomentose lehtedest ja koorest saadud vesi- ja etanooliekstraktide mõju inimese erütrotsüütide osmootsele resistentsusele, erütrotsüütide sisemuse viskoossusele ja erütrotsüütide plasmamembraani voolavusele. Inimeneerütrotsüüdidinkubeeriti uuritud ekstraktidega kontsentratsioonides 100 250 ja 500 ug/ml 2,5 ja 24 tundi. Kõik testitud ekstraktid põhjustasid erütrotsüütide membraani voolavuse vähenemise ja erütrotsüütide osmootse tundlikkuse suurenemise. Koorest ja lehtedest saadud etanooliekstraktid suurendasid erütrotsüütide viskoossust. Suurimaid muutusi uuritud parameetrites täheldati koore etanooliekstraktiga inkubeeritud rakkudes. Arvame, et U. tomentosa ekstraktist pärinevad ühendid ladestuvad peamiselt erütrotsüütide membraani välimisse hüdrofiilsesse monokihti, kaitstes seega erütrotsüüte oksüdatiivse stressi kahjulike mõjude eest.

Märksõnad: erütrotsüüdid; membraani voolavus; osmootne vastupidavus; Uncaria tomentosa; väljavõtted

Lisateabe saamiseks klõpsake

1. Sissejuhatus

Uncaria tomentosaväljavõttedkasutatakse tavaliselt mitmesuguste haiguste ravi toetamiseks nende tõttuantioksüdant[1-4] ja immunostimuleerivad [5,6] toimed. Samuti on näidatud, et U.tomentosa ekstraktidel on vähivastane [7-9], mutageenne [10,11] ja antiherpeetiline toime [11].

Etnomeditsiinilised uuringud ja muud uuringud on näidanud selle taime arvukalt rakendusi erinevate kultuuride traditsioonilises meditsiinis, nt põletike, artriidi, astma, vähi, maohaavandite, kuseteede haiguste ja hemorraagiate ravis [12,13]. Sellised mitmekesised omadused on tingitud U. tomentosa keerulisest keemilisest koostisest, mis on peamiselt seotud erinevate bioloogiliselt aktiivsete sekundaarsete metaboliitide, peamiselt fenoolsete ja alkaloidide suure sisaldusega [14].

Paljud paberid on näidanud ka UI.tomentosa ekstraktide (kasutatakse terapeutilistes annustes) kasulikku toimet (ilma kõrvaltoimeteta) vererakkudes nii in vivo[15,16] kui ka in vitro uuringutes [17-19]. Sheng et al. [20] ei täheldanud mingeid muutusi verepildis pärast U. tomentosa ekstrakti C-MED-100TM kõrge kontsentratsiooni manustamist tervetele vabatahtlikele. Nad ei täheldanud statistiliselt olulisi muutusi, sealhulgas hemoglobiini taset, hematokriti väärtust ja punaste vereliblede (RBC) keskmist mahtu, mis pigem välistas U. tomentosa ekstraktidega kokkupuutuvate punaste vereliblede võimaliku enneaegse eliminatsiooni.

Samamoodi on Piscoya jt poolt läbi viidud kliinilised uuringud. [21] põlve osteoartriidiga patsientidel, mis puudutab Uncaria gujanensis'e efektiivsuse hindamist selle haiguse ravis, ei näidanud hematokriti, hemoglobiini taseme ega erütrotsüütide settimise kiiruse (ESR) muutusi võrreldes rühmaga. platseebot saanud patsientidest. Sellegipoolest on vaja täiendavaid uuringuid suuremate inimrühmade kohta, et välistada enneaegsete kõrvaldamise võimaluserütrotsüüdidUncaria liikidega kokkupuutuvate inimeste vereringest. Meie varasemad uuringud on näidanud, et U. tomentosa lehtedest ja koorest saadud etanooli- ja vesiekstraktid ei olnud isegi väga kõrgel kontsentratsioonil 500 ug/ml erütrotsüütidele toksilised. Samuti oleme täheldanud, et uuritud ekstraktid leevendasid hemoglobiini oksüdatsiooni ja lipiidide peroksüdatsiooni, samuti vähendasid toksilise aine 24-diklorofenooli (2,4-DCP)[17] põhjustatud ROS-i moodustumist ja hemolüüsi. Lisaks avastasime U. tomentosa ekstraktidel kaitsva toime katalaasi aktiivsusele inimese erütrotsüütides, mida inkubeeriti 2,4-DCP ja katehhooliga [22].

Taimsete polüfenoolide füsioloogilist kontsentratsiooni on raske hinnata. Kirjanduses on tavaliselt antud teave preparaatide soovitatavate annuste või testitud ühendite kontsentratsioonide kohta (inimestel 210-500 mg/päevas või loomadel 350-500 mg/kg kehamassi kohta) [23,24 ].

Mõned ühendid imenduvad oma vormi muutmata, teised aga, eriti glükosiidide kujul, jäävad imendumise käigus ilma täielikult või osaliselt suhkrujääkidest. Taimsete polüfenoolide muundumisel osaleb ka soolefloora.

Suurem osa imendunud annusest eritub organismist uriini ja väljaheitega. Hinnanguliselt ei tuvastata pärast 1-3 h manustamist plasmas rohkem kui 10-20 protsenti kvertsetiini ja isoflavoonide (genisteiini ja daidzeiini) allaneelatud annusest. Antotsüaniine peetakse vähem tõhusaks imenduvaks – nende imendumine on hinnanguliselt 1-2 protsenti algannusest [25]

Oksüdatiivne stress tekib siis, kui ROS-i tase rakus ületab raku tasemeantioksüdantkaitsesüsteem. Punased verelibled on eriti vastuvõtlikud oksüdatiivsele stressile nende membraanis leiduvate polüküllastumata rasvhapete suure sisalduse ja hemoglobiini autooksüdatsiooni tõttu. Inimese erütrotsüütide membraan koosneb küllastunud rasvhapetest, monoküllastumata rasvhapetest, polüküllastumata rasvhapetest ja pika ahelaga N-3 polüküllastumata rasvhapetest [26]. Oksüdeerivad ained muudavad membraani jäikust, muudavad membraani dipoolipotentsiaali ja põhjustavad spektriini-hemoglobiini komplekside moodustumist [27]. Oksüdatiivse stressiga toimetulemiseks on erütrotsüüdid varustatud spetsiaalse tsütoskeletiga, mis tagab mehaanilise stabiilsuse ja paindlikkuse, mis on vajalik tsirkulatsiooni ajal tekkivatele jõududele vastu seista. Erütrotsüütide membraan koosneb lipiidide kaksikkihist, transmembraansetest valkudest ja valkude filamentsest võrgust (nagu spektriin, F-aktiin, valk 4.1 ja aktiini siduvate valkude domeen, adutsiin, tropomüosiin ja tropomoduliin), mis moodustavad koos membraani skeleti. kogu nende membraani tsütoplasmaatiline pind [28]. ROS-id on samuti võimelised indutseerima erüptoosi membraani fosfatidüülseriini (PS) translokatsiooni muutuste kaudu [29]. Oksüdatiivne stress võib viia ka raku redutseerivate komponentide ammendumiseni ning põhjustada punaliblede membraanis struktuurseid ja funktsionaalseid muutusi: fosfatidüülseriini ja siaalhappe lagunemist, mis on peamised komponendid, mis tekitavad negatiivse laengu membraani välisküljel [30].

On tõestatud, et U.tomentosast eraldatud polüfenoolidel on väga tugevad antioksüdatiivsed omadused. Mitmed aruanded on näidanud, et U. tomentosa erinevatest osadest saadud vesi- ja metanooliekstraktid kaitsesid rakke vabade radikaalide tekke ja lipiidide peroksüdatsiooni eest in vitro, samuti inhibeerisid vabade radikaalide põhjustatud DNA kahjustusi ja rakusurma [2,3,31]. Meie eelmises uuringus näitasime ka, et UI.tomentosa ekstraktid kaitsesid füsioloogilistes tingimustes erütrotsüüte ROS-i moodustumise ja hemolüüsi eest. Lisaks näitasime, et tomentosa etanooliekstraktidel oli tugevaim kaitsev toime [17].

Et teada saada, kas testitud ühendid suudavad läbi membraani tungida (ja millisel sügavusel need asuvad), hinnati erütrotsüütide membraani voolavust. Paljud füüsikalised ja keemilised tegurid mõjutavad membraani voolavust[32,33]. Keemiliste ainete hulka kuuluvad ksenobiootikumid, mis põhjustavad lipiidide ja valkude oksüdatsiooni ning ühendid, mis interkaleeruvad.

membraani [34,35]. Võõrühendite sattumine membraanistruktuuri võib häirida selle elementide paigutust, mille tulemuseks on tavaliselt membraani voolavuse muutumine. Muutused membraani voolavuses võivad põhjustada erütrotsüütide talitlushäireid ja muutusi erütrotsüütide reoloogilistes omadustes [36]. Teisest küljest võivad antioksüdantsete omadustega ained, millel on võime tungida läbi membraani, omada rakku kaitsvat rolli [37]. Seetõttu, et selgitada välja, kas U. tomentosa ekstraktides sisalduvad ühendid võivad siseneda sise- ja/või välismembraani infolehele, hindasime membraani voolavuse muutusi selle erinevatel tasemetel, samuti erütrotsüütide osmootilist vastupidavust ja sisemist viskoossust. Valisime uuritud ekstraktide suhteliselt kõrge kontsentratsiooni (kuid mitte toksilised, nagu on näidatud varasemates uuringutes), et jälgida võimalikke muutusi uuritud parameetrites ning määrata ekstrakti komponentide asukohta erütrotsüütide membraanis.

2. Tulemused

2.1.Membraanide voolavus

2.1.1. Tellimuse parameeter S

Pärast 2- ja 24-tunnist erütrotsüütide inkubeerimist koore ja lehtede vesi- ja etanooliekstraktidega täheldati statistiliselt olulisi muutusi järjestusparameetris S Joonis 1 näitab nelja (2-tunnise inkubatsiooni) ja viie 24 h inkubeerimine) sõltumatud katsed. Pärast 2-tunnist inkubeerimist põhjustasid kõik 500 ug/ml juures uuritud ekstraktid inimese punaste vereliblede järjestusparameetri S tõusu. Pärast 24-tunnist inkubeerimist täheldati statistiliselt olulisi muutusi uuritavas parameetris nii 250 ug/ml kui ka 500 ug juures. /mL kõigist uuritud ekstraktidest.

2.1.2. Korrelatsiooniaeg TB ja aeg TC

Pärast 2-tunnist inkubeerimist täheldati statistiliselt olulisi muutusi korrelatsiooniaja TB ja aja tc osas erütrotsüütide puhul, mida töödeldi ainult etanooliekstraktiga 500 ug/ml. Pärast 24-tunnist inkubeerimist ei täheldatud mis tahes testitud ekstraktiga töödeldud RBC-des statistiliselt olulisi muutusi ajas ja ajas Tc (tabel 1).

2.2. Punaste vereliblede sisemine viskoossus

Pärast 2- ja 24-tunnist erütrotsüütide inkubeerimist vee ja koore ja lehtede etanooliekstraktidega kontsentratsioonides 100–500 ug/ml ei täheldatud erütrotsüütide sisemuse suhtelises viskoossuses statistiliselt olulisi muutusi (joonis 2). . Graafikud näitavad nelja (2 h) ja viie (24 h) sõltumatu katse keskmisi ja standardhälbeid.

Tuleb märkida, et pärast 2-tunnist ja eriti pärast 24-tunnist erütrotsüütide inkubeerimist koore etanooliekstraktidega võis täheldada tendentsi erütrotsüütide internumi viskoossuse suurenemisele (tulemused ei olnud statistiliselt olulised) (joonis 2). .

2.3. Osmootne haprus

Erütrotsüütide inkubeerimine koore ja lehtede vesi- ja etanooliekstraktidega kontsentratsioonil 100 ug/l viidi läbi 2 tundi, 5 tundi ja 24 tundi. Osmootse takistuse diagramm (joonis 3) esitab 5 sõltumatu katse keskmised tulemused iga inkubatsiooniaja kohta. Diagrammi loetavuse huvides standardhälbeid ei joonistatud. IC5o graafikud (joonis 4) näitavad 5 sõltumatu katse arvutatud keskmisi ja standardhälbe väärtusi iga inkubatsiooniaja kohta.

Pärast erütrotsüütide 2-tunnist inkubeerimist testitud ekstraktidega ei täheldatud muutusi nende rakkude osmootses tundlikkuses ja seega muutusi parameetrite ICs0 väärtustes (joonised 3 ja 4). Samuti märgiti, et testitud ekstraktid suurendasid pärast 5-tunnist inkubeerimist inimese erütrotsüütide osmootset tundlikkust. Muud ekstraktid, välja arvatud lehtede vesiekstrakt, sensibiliseerisid RBC-sid osmootse stressi põhjustatud kahjustuste suhtes. Uuritud ekstraktidega inkubeeritud erütrotsüüdid läbisid hemolüüsi kõrgemal NaCl kontsentratsioonil võrreldes kontroll-erütrotsüütidega (joonis 3). IC50 parameetrite väärtuste tõus oli statistiliselt oluline ka erütrotsüütide puhul, mida inkubeeriti 5 tundi koore vesi- ja etanooliekstraktide ning etanoolse leheekstraktiga (joonis 4). Pärast 24-tunnist inkubeerimist täheldati kõigi testitud ekstraktidega töödeldud erütrotsüütide suuremat tundlikkust osmootse stressi suhtes võrreldes

kontrollivad RBC-sid (joonis 3). Samamoodi täheldati statistiliselt olulist IC väärtuste suurenemist erütrotsüütides, mida inkubeeriti kõigi uuritud U.tomentosa ekstraktidega (joonis 4).

3. Arutelu

Varasem uuring näitas, et U.tomentosa ekstraktid muutsid inimese erütrotsüütide morfoloogiat [19]. Leiti skistotsüütide moodustumine, mis viitas ekstraktide komponentide inkorporeerimisele erütrotsüütide membraani välisesse monokihti[38,39]. Teine uuring näitas, et U. tomentosa ekstraktides sisalduvad ühendid inhibeerisid hemoglobiini leket (hemolüüsi) tõenäoliselt rakumembraani sulgemise kaudu [17]. Üks bioloogilise membraani omadusi, mis tuleneb selle struktuurist ja komponentide vastastikusest mõjust, on membraani voolavus. Membraani voolavus on pöördvõrdeline selle viskoossusega.

Paramagnetilise resonantsspektroskoopia (EPR) abil määrati etanooli ning koore ja lehtede vesiekstraktidega inkubeeritud erütrotsüütide membraani voolavus rasvhappejäägi 5 ja 16 süsinikuaatomi kahel tasemel.

5-doksüsteariinhappe spin-märgise (5-DSA) jaoks saadud EPR spektrite põhjal arvutati välja S-järjestuse parameeter, mis andis teavet voolavuse muutuste kohta 5 süsinikuaatomi tasemel. rasvhapete jäägist. Järjestusparameetri S puhul täheldati selle väärtuse statistiliselt olulist tõusu pärast erütrotsüütide inkubeerimist U. tomentosa koore ja lehtede etanooli- ja veeekstraktidega, mis näitas

membraani voolavuse vähenemine rasvhappejäägi 5 süsinikuaatomi tasemel. Parameetri S statistiliselt olulist suurenemist täheldati pärast 2-h erütrotsüütide inkubeerimist koore etanooliekstraktidega, samuti veega ja lehtede etanooliekstraktiga kontsentratsioonidel 250 ug/ml ja 500 ug/mL, samal ajal kui erütrotsüütide inkubeerimist koor ainult 500 ug/ml juures põhjustas muutusi arutlevas parameetris (joonis 1A). Inkubatsiooniaja pikenemine kuni 24 tunnini põhjustas kõigi uuritud ekstraktidega inkubeeritud erütrotsüütide S-parameetri statistiliselt olulise tõusu alates nende kontsentratsioonist 250 ug/ml (joonis 1B). Membraani voolavuse vähenemine rasvhappejäägi 5 süsinikuaatomi tasemel võis olla seotud polüfenoolide mõjuga plasmamembraani struktuurile, nagu on kirjeldanud Duchnowicz jt.[40] Koreni jt[37] uuringud viitasid polüfenoolide kasulikule mõjule vere, eriti erütrotsüütide antioksüdantide koguvõimele. Nad oletasid, et tsirkuleerivad erütrotsüüdid ja võib-olla ka teised vererakud võivad olla pidevalt kaetud täiendatud toitainete polüfenoolidega, mis toimivad antioksüdantide depoodena ja võivad seega käituda kaitsjana oksüdatiivse stressi kahjulike tagajärgede eest. U. tomentosas määratud polüfenoolsed ühendid liigitatakse sekundaarseteks metaboliitideks, millel on positiivne mõju inimorganismile. Neil on antioksüdantne toime, nad kelaavad metalliioone (raud, vask) ja toetavad antioksüdatiivsete ensüümide aktiivsust. Polüfenoolide kaitsvat toimet inimorganismile seostatakse eelkõige rakkude kaitsega oksüdatiivse stressi eest, mis võib olla seotud erinevate haiguste, sh ateroskleroosi või vähi tekke ennetamisega [41,42]. Heitzmani et al. [43] ja ka meie uuring[17] näitasid polüfenoolide esinemist U.tomentosa ekstraktides. Autorid määrasid erinevaid ekstrakte analüüsides kõrgeima polüfenoolide sisalduse koore etanooliekstraktis ja madalaima lehtede vesiekstraktis. Ul. tomentosat esindavad enamasti tanniinid, flavonooli derivaadid, katehhiinid, tanniinid (sh katehhiinid ja epikatehhiinid) ja protsüanidiinid. Polüfenoolid on oma struktuuri tõttu erineva lahustuvusega vees, kuid kõik lahustuvad hästi orgaanilistes lahustites. Seetõttu on taimede etanooliekstraktid tavaliselt mitmekesisema koostisega ja suurema polüfenoolide kontsentratsiooniga kui vesiekstraktid.

16-doksüülsteariinhappe spin-märgise (16-DSA) puhul määrati kaks korrelatsiooniaega T ja tc. Pärast erütrotsüütide 2-tunnist inkubeerimist koorest saadud etanooliekstraktiga kontsentratsioonil 500 ug/ml täheldati korrelatsiooniaja tp ja aja Tc pikenemist. Siiski ei täheldatud pärast 24-tunnist inkubeerimist nendes parameetrites statistiliselt olulisi muutusi. Teised testitud ekstraktid ei põhjustanud statistiliselt olulisi muutusi TB korrelatsiooniajas nii pärast 2-tunnist kui ka 24-tunnist inkubeerimist. Selle parameetri kasvutendents ilmnes erütrotsüütides, mida inkubeeriti (eriti 24 tundi) kõigi uuritud ekstraktidega 500 ug/ml (tabel 1). Korrelatsiooniaegade tB ja tc suurenemine näitab kile jäigastumist rasvhappejäägi 16 süsinikuaatomi tasemel. Kuid 24-tunnise inkubeerimise järel ei ilmnenud muutusi, mis viitavad sellele, et tegemist on ajutise toimega, mille põhjustavad ekstrakti komponendid, mis algul lülitatakse membraani, kuid pärast pikemat inkubatsiooniaega eemaldatakse need rakust väljastpoolt. Selliseid polüfenoolide mõjusid kirjeldasid Tarahovsky et al. [44]. Need autorid väitsid, et flavonoidid tungisid lipiidide kaksikkihi hüdrofoobsesse kohta, eriti lipiidiparvedena tuntud sektsioonidesse või hüdrofoobsetesse valgutaskutesse. Flavonoididel on pärast metallidega kompleksi moodustumist endiselt antioksüdatiivne potentsiaal, samas kui nende lipofiilsus võib suureneda, hõlbustades seega membraanilipiidide kaitset oksüdatsiooni eest.

Soovitame, et U. tomentosa kooreekstraktist pärinevad polüfenoolid ei tunginud mitte ainult erütrotsüütide membraani sügavamale tasemele, vaid kandusid ka rakku, mida kinnitas punaste vereliblede sisemise viskoossuse suurenemine. Üks peamisi parameetreid, mis mõjutab erütrotsüütide deformeeritavust, on nende sisemine viskoossus [45]. Selles uuringus hinnati erütrotsüütide viskoossuse muutusi spin-markerite abil. U.tomentosa vesiekstraktidega töödeldud erütrotsüütide suhtelises viskoossuses ei ilmnenud statistiliselt olulisi muutusi nii pärast 2-h kui ka 24-h inkubeerimist, samas kui etanooliekstraktid kutsusid esile muutused arutlevas parameetris (joonis 2). See võib viidata sellele, et polüfenoolid sisalduvad palju

etanooliekstraktide suuremad kontsentratsioonid tungisid intensiivselt läbi RBC membraani, põhjustades muutusi erütrotsüütide sisemuse viskoossuses. Veeekstraktidega inkubeeritud erütrotsüüdid suudavad kergesti kompenseerida viskoossuse muutusi, mis on põhjustatud polüfenoolsete ainete madalamast kontsentratsioonist (joonis 6).

Tuleb aga rõhutada, et polüfenoolide paiknemine rakumembraani sügavamates kihtides ja järelikult ka nende tungimine rakku koos erütrotsüütide viskoossuse samaaegse häirimisega võib toimuda ainult nende ainete väga suure kontsentratsiooni korral, mida ei leidu. inimkehas isegi pärast ravi U. tomentosa ekstraktidega. Madalatel kontsentratsioonidel paiknevad polüfenoolid peamiselt välimises monokihis, mida näitavad muutused parameetri S väärtuses. Erütrotsüütide sisemuse viskoossuse muutused võivad olla seotud erütrotsüütide kuju muutumisega. Seda näitasid voolutsütomeetrilise analüüsi ja faasikontrastmikroskoopilise uuringu käigus saadud fotode muutused edasisuunalise hajumise kanali (FSC) parameetris [19]. Skistotsüütide moodustumine võib tuleneda U.tomentosa ekstraktides esinevate polüfenoolide paigutamisest nii raku välismembraani monokihi hüdrofiilsesse piirkonda kui ka hüdrofoobsesse piirkonda, nagu viitavad muutused järjestusparameetris S ning korrelatsiooniaegades tB ja Tc. Punaste vereliblede kuju muutused võivad olla seotud veekaotuse ja viskoossuse suurenemisega rakkudes. Lisaks võivad need olla tingitud erütrotsüütide osmootse resistentsuse vähenemisest. Muutunud erütrotsüütide paigutamine isotoonilisse NaCl lahusesse võib viia rakkude kiirema lüüsini (võrreldes kontrollrakkudega), kuna vee toime on suurenenud ja erütrotsüütide membraani deformatsioonivõimalus on piiratud ning seetõttu muutub raku kuju.

Tulemused näitasid, et sõltuvalt inkubatsiooniajast võib U, tomentosa ekstraktidel olla erinev mõju plasmamembraani voolavusele ja erütrotsüütide osmootsele resistentsusele.

Erütrotsüütide osmootne resistentsus on parameeter, mis näitab punaste vereliblede tundlikkust hüpotoonilise keskkonna toimele. Erütrotsüütide kokkupuutel isotoonilise keskkonnaga on täheldatav vee väike osmootne liikumine rakumembraanis, mis ei muuda raku mahtu ega kuju. Hüpotoonilise keskkonna korral siseneb rakku vesi, mis põhjustab selle mahu suurenemise, samuti muudab kuju kahe nõgusa ketta kujult kerakujuliseks. Rakud saavad oma mahtu suurendada vaid teatud piirini. Mahu edasine suurendamine põhjustab rakumembraani terviklikkuse häireid ja rakusisalduse vabanemist osmootse Ivsise toimel. Pärast 2-h erütrotsüütide inkubeerimist U.tomentosa ekstraktidega ei muutunud punaste vereliblede osmootne tundlikkus (joonised). 3 ja 4), samuti muutusi IC50 parameetris. Kuid pärast 24- h inkubeerimist täheldati erütrotsüütide suuremat osmootset tundlikkust ja seega täheldati ICso väärtuse suurenemist võrreldes kontrolliga (joonised 3 ja 4). Pärast erütrotsüütide inkubeerimist etanooliekstraktidega täheldati tugevamat toimet kui vesiekstraktidega. Tõenäoliselt on see tingitud sellest, et etanooliekstraktides on rohkem polüfenooliühendeid ja tanniine [17]. Sarnaseid muutusi (IC50 väärtuse suurenemine) pärast pikemat inkubatsiooniaega (90 min 37 kraadi juures) erütrotsüütides katehhiinidega täheldasid Naparlo et al. [46]. Need autorid väitsid, et tõenäoliselt võtavad pikaajalise inkubeerimise ajal erütrotsüüdid omaks katehhiine, mis võib kaasa tuua raku sisemuse osmolaarsuse suurenemise ja seega kergema hemolüüsi hüpotoonilistes lahustes, kuna raku sisemise ja välise osmolaarsuse erinevus on suurem. Teine selgitus sellistele muutustele oli soovitus, et katehhiinid tekitavad pikaajalise inkubeerimise ajal ROS-i, nt vesinikperoksiidi, mis võib kahjustada erütrotsüütide membraani ja suurendada selle haprust, sealhulgas osmootset haprust.

Ühendite paiknemine erütrotsüütide rasvhappeahela 5. süsiniku tasemel põhjustas nende rakkude suurenenud osmootse tundlikkuse (osmootse resistentsuse kõverate nihkumine kõrgemate NaCl kontsentratsiooni väärtuste suunas, IC50 väärtuste suurenemine). Kuid varasemates Borsi jt katsetes. [17] isotoonilistes tingimustes (0,9 protsenti NaCl) inhibeerisid U.tomentosa ekstraktid toksiliste ainete, nagu 2,4-DCP ja katehhool, põhjustatud hemolüüsi. Need teadlased näitasid ka U. tomentosa ekstraktide kaitsvat rolli 2,4-DCP oksüdatiivse toime eest inimese erütrotsüütides, mis väljendub methemoglobiini ja ROS taseme vähendamises. Seega on ekstraktide lõplik mõju organismile ilmselt positiivne. In vivo süsteemis inkorporeeritakse U. tomentosa ekstraktid (madalates kontsentratsioonides) membraani (ilma selle struktuuri häirimata) ja neil on antioksüdantsed kaitseomadused [12,47]. Rottidel ja tervetel vabatahtlikel, kellele manustati U.tomentosa, tehtud uuringute tulemused ei näidanud mingeid muutusi punaste vereliblede membraanis ega muid muutusi erütrotsüütides, mis välistas nende rakkude enneaegse eemaldamise vereringest. 20,48].

Väidame, et polüfenoolide seondumine erütrotsüütide pinnaga võib olla vastutav nende kaitsvate omaduste eest (täheldatud varasemates uuringutes). Polüfenoolid, mis on kõige sagedamini esindatud U.tomentosa ekstraktides, võivad interakteeruda otse bioloogiliste membraanidega, samuti toimivad nad vabade radikaalide püüdjatena ja lipiidide peroksüdatsiooni inhibiitoritena, suurendades rakkude vastupanuvõimet oksüdatiivsetele kahjustustele. Seda kinnitasid viimased bioaktiivsete membraanide uuringud. Kim jt.[49] lisatud U. tomentosa ekstrakti nanostruktureeritud alginaatmembraani valmistamise protsessis, et parandada selle bioloogilist aktiivsust. Autorid näitasid, et U. tomentosa membraani sisaldavatel komponentidel oli suurepärane antioksüdantne toime, mis näitab peaaegu 100 protsenti vabade radikaalide redutseerimisvõimet 15 minutiga.

Selle uuringu piirang on testitud ekstraktide mõju hindamise puudumine rasvhapete koostisele erütrotsüütide membraanis. Inimese erütrotsüütide membraan koosneb küllastunud rasvhapetest (palmitiin-, steariinhape), monoküllastumata rasvhapetest (palmitoleiin-, vaktsiin-, cis-oleiin-, trans-oleiinhape), polüküllastumata rasvhapped (cis-linool-, transinool-, linoleen-, eikosanoid-, arahosatrienoiin-, eikosatriinhape) , ja pika ahelaga N-3 polüküllastumata rasvhapped (eikosapentaeen, dokosaheksaeen).

Kuid selles uuringus kasutati ekstrakte tervetelt doonoritelt saadud erütrotsüütidele. Seega võib eeldada, et erütrotsüütide membraani lipiidide koostis on tüüpiline normaalsetele rakkudele [26]. Kuna inimese küpsetel erütrotsüütidel puudub tuum, ei sünteesi nad rakulisi komponente, sealhulgas rasvhappeid. Sel põhjusel ei tohiks lipiidide koostis muutuda erinevalt in vivo uuringutest: naha lamerakulise kartsinoomi korral [26] või toidulisandite manustamise ajal [50,51]. Flip-flop protsess, lipiidide oksüdatsioon, interaktsioonide muutumine lipiididomeenides ja nende jaotumine on võimalikud, kuid kuna lipiidide biosüntees erütrotsüütides ei toimu, lisatakse erütrotsüütide membraani lipiidide kvalitatiivne ja kvantitatiivne koostis testitud ekstraktide mõjul. in vitro on väga ebatõenäoline.

Kokkuvõttes on U. tomentosa ekstraktid peamiselt ajutiselt lisatud membraani ja täpselt selle välimisse monokihti. Kuid väga kõrge kontsentratsiooniga võivad nad tungida sügavamale membraani ja lõpuks muuta erütrotsüütide viskoossust. Saadud tulemuste ja kirjanduse andmete põhjal arvame, et U.tomentosa ekstraktides sisalduvate ühendite füsioloogiliselt madalad kontsentratsioonid jäävad rakumembraani välimisse monokihti ning kaitsevad erütrotsüüte oksüdatiivse stressi ja kahjustuste eest.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Kemikaalid

5-Doksüülsteariinhape (5-DSA), 16-doksüülsteariinhape (16-DSA), 4-hüdroksü-2,2,6,{{ 8}}tetrametüülpiperidiin-1-oksüül(TEMPOL) osteti ettevõttest Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI, USA. Muud kemikaalid saadi Rothist, Karlsruhest, Saksamaalt ja Avantor Performance Materials Poolast, Gliwice'ist, Poolast.

4.2.Bioloogiline materjal

4.2.1.Taim

U. fomentosa tooraine (koor ja lehed) pärines Peruus Limas asuvast Instituto Peruano de Investigaciones Fitoterapia Andinast, mille tarnis lahkelt Wilcaccora.

Lomianki keskus, Poola. Selle materjali üldisi omadusi kirjeldasid varem Pilarski et al. [3].

Voucheri materjalid deponeeriti Poola Teaduste Akadeemia Bioorgaanilise Keemia Instituudi fütokeemia laboratooriumis Poznanis, Poolas.

Proovide ettevalmistamine: üks gramm U.tomentosa toorainet (koor ja lehed) ekstraheeriti 10 ml vee või 96% etanooliga 37 kraadi juures 8 tundi. Seejärel tsentrifuugiti ekstrakte kiirusel 4000 p/min 15 minutit. Supernatandid aurustati Speed-Vac-ga kuivaks massiks ja seejärel kuivatati P2O5-ga. Nendel tingimustel kaeti umbes 111 mg preparaati koore grammi kohta ja umbes 158 mg preparaati lehtede grammi kohta vesiekstraktsiooni korral. 96-protsendilise etanooliga ekstraheerimisel saadi 123 mg preparaati koore grammi kohta ja 158 mg preparaati lehtede grammi kohta. Saadi neli ekstrakti, st etanooliekstrakt koorest (Bet), vesiekstrakt koorest (Bag), etanooliekstrakt lehtedest (Let), vesiekstrakt lehtedest (Lag). Pulbrilisi preparaate hoiti külmkapis tihedalt suletud anumates, millest valmistati iga katse jaoks põhilahused [19].

U. tomentosa ekstraktides sisalduvate oksindoolalkaloidide kvalitatiivne ja kvantitatiivne koostis määrati HPLC sõrmejälgede analüüsi abil. Selle materjali kvantitatiivsete alkaloidide üldisi omadusi kirjeldasime varem Borsi et al. [18].

U. tomentosa ekstraktides tuvastati unkariin F, spetsiofülliin, mitrafülliin, pteropodiin/isomitrafülliin ja isopteropodiin. Mitrafülliin ja pteropodiin/isomitrafülliin on alkaloidid, mis domineerivad leheekstraktides, pteropodiin/isomitrafülliin aga kooreekstraktides. Etanooliekstrakte iseloomustas suurem alkaloidide sisaldus kui vesiekstrakte (joonis 5).

U. tomentosa ekstraktides sisalduvate polüfenoolide kvantitatiivse määramise üldisi omadusi kirjeldasime varem [17]. HPLC/DAD analüüs näitas, et koore etanooli- ja vesiekstraktid sisaldasid peamiselt protsüanidiin B2 ja C1 ning (-)-epikatehiini. Kofeiinhappe derivaadid määrati ainult lehtede vesiekstraktides, samas kui klorogeenhape, flavonoolid ja polümeersed proantotsüaniidid sisaldusid kõigis uuritud ekstraktides. Suurimad vabade fenoolide üldkontsentratsioonid määrati koore etanooliekstraktides. Kõrge fenoolsete ühendite sisaldus tuvastati ka lehtede etanooliekstraktis, madalam fenoolisisaldus aga koore vesiekstraktis ja lehtede etanooliekstraktis (joonis 6).

Lõpuks lahustati kõik ekstraktid dimetüülsulfoksiidis (DMSO). Saadud lahus lisati väikeses mahus 1 μL 1 ml erütrotsüütide suspensioonile (DMSO kontsentratsioon ei mõjutanud rakumembraani). Kontrollidena kasutati erütrotsüüte, millele oli lisatud ainult DMSO-d.

4.2.2.Erütrotsüütide isoleerimine

Leukotsüütide-buffy kate saadi verest, mis koguti Poolas Lodzis asuvas verepangas. Leukotsüütide-puhverkihti tsentrifuugiti (3000 p/min 10 minutit 4 kraadi juures) ja pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (pH 7,4).

PBS-is suspendeeritud isoleeritud erütrotsüüte inkubeeriti 2, 5 ja 24 tundi nelja tüüpi ekstraktidega (etanooli- ja vesiekstraktid koorest ning etanooli- ja vesiekstraktid lehtedest) kontsentratsioonides 100 ug/ml, 250 ug/mL. ja 500 ug/mL Varasemad uuringud on näidanud, et nendes kontsentratsioonides uuritud ekstraktid ei kahjustanud erütrotsüüte, samas kui neil oli punaste vereliblede kaitsev toime [17,19,22].

4.3. Membraani voolavus

Erütrotsüütide membraani voolavus määrati elektronparamagnetilise resonantsi (EPR) spektroskoopia abil (Brucker 300 Spectrometer, Saksamaa), kasutades 5-doksülsteariinhapet (5-DSA) ja 16-doksülsteariinhapet ( 16-DSA)spin sildid. EPR-spektritest, mis saadi 5-DSA spin-märgise jaoks, arvutati järjestusparameeter S. Korrelatsiooniajad TB ja TC arvutati 16-DSA spin-märgise EPR spektri põhjal. Järjestusparameeter Sas ning korrelatsiooniajad TB ja tc näitavad pöördkorrelatsiooni membraani voolavusega. Järjeparameeter S ning korrelatsiooniajad tB ja tc arvutati Koteri jt uuringus kirjeldatud viisil. [52].

4.4. Punaste vereliblede sisemine viskoossus

Erütrotsüütide sisemise viskoossuse määramiseks kasutati TEMPOLi spin-märgist [53]. 50% hematokritiga erütrotsüütide suspensioonile lisati puhverdatud soolalahuses (PBS) lahustatud TEMPOLi lahus (20 mM). Pärast 30-minutilist inkubeerimist pesti erütrotsüüte kolm korda 80 mM K3Fe (CN6 lahusega), et vähendada rakkudevahelises ruumis paikneva spin-märgise signaali. TEMPOLi vees ja erütrotsüütides saadud spektri põhjal , määrati pöörlemise korrelatsiooniaeg järgmise valemi järgi:

-(2)"-1

(1)

kus: k – nitroksiidi pöörlemismärgise konstant, k=6.5×10-9s mT-l, ho – keskjoone kõrgus, h_1 – kõrgjoone kõrgus väljajoon, Wo – keskjoone laius.

Suhteline viskoossus määrati järgmise valemi järgi:

TR

_C

(2)"1 B

kus: TR – markeri pöörlemiskorrelatsiooni aeg erütrotsüütides, TB – markeri pöörlemiskorrelatsiooni aeg PBS-is, c – erütrotsüütide siseviskoossus, 1B – PBS viskoossus (väärtus 1 eeldati).

4.5. Osmootne haprus

Pärast erütrotsüütide inkubeerimist U. tomentosa ekstraktidega tsentrifuugiti rakke kiirusel 3000rpm 10 minutit 4 kraadi juures. Seejärel pesti rakke 0,9% NaCl lahusega. Seda sammu korrati kaks korda. Pärast supernatandi eemaldamist suspendeeriti RBC-d NaCl lahuses kontsentratsioonivahemikus 0,2–0,9 protsenti (valiti 15 punkti). Rakke inkubeeriti 30 minutit 37 kraadi juures ja seejärel tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min 10 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatandi optilist tihedust mõõdeti lainepikkusel 540 nm (Adobe), kasutades mikroplaadi neeldumislugejat (BioTek Elx808, BIOTEK).

Hemolüüs igas katseklaasis väljendati protsentides, võttes destilleeritud vees hemolüüsi 100 protsendina (A100 protsenti):

×100 (3)

Hemolüüsi protsent (protsent o)= Aole

A100

4.6. Statistiline analüüs

Tulemused esitati 4–6 individuaalse katse (4-6 veredoonorit) saavutatud keskmisena ± SD, samas kui iga indiviidi (doonori) katsepunktiks oli 2-3 korduste keskmine väärtus. Rühmade keskmiste erinevuste mitut võrdlust analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey post hoc test. Erinevusi peeti statistiliselt olulisteks p<0.05. all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" statistica="" software(statsoft,="" inc,="" tulsa,="" va,="">

Viited

1. de Azevedo, eKr; Roxo, M.; Borges, MC; Peixoto, H.; Crevelin, EJ; Bertoni, BW; Contini, SH; Lopes, AA; França, SC; Pereira, AM; et al. Uncaria tomentosa ja selle peamiste alkaloidide Mitra fülliin ja isomitrafülliini vesipõhise leheekstrakti antioksüdantne toime Caenorhabditis elegansis. Molecules 2019, 24, 3299. [CrossRef]

2. Navarro, M.; Arnaez, E.; Moreira, I.; Hurtado, A.; Monge, D.; Monagas, M. Uncaria tomentosa kaubanduslike kooretoodete polüfenoolne koostis ja antioksüdantne aktiivsus. Antioksüdandid 2019, 8, 339. [CrossRef]

3. Pilarski, R.; Zieli ´nski, H.; Ciesiołka, D.; Gulewicz, K. Uncaria tomentosa (Willd.) DC etanooli- ja vesiekstraktide antioksüdantne aktiivsus. J. Ethnopharmacol. 2006, 104, 18–23. [CrossRef]

4. Santo, GD; Grotto, A.; Boligon, AA; Da Costa, B.; Rambo, CL; Fantini, EA; Sauer, E.; Lazzarotto, LMV; Bertoncello, KT; Júnior, OT; et al. Uncaria tomentosa ekstrakti kaitsev toime glüfosaadi Roundupi poolt indutseeritud oksüdatiivse stressi ja genotoksilisuse vastu, kasutades mudelina sebrakala (Danio rerio). Keskkond. Sci. Saasta. Res. Int. 2018, 25, 11703–11715. [CrossRef]

5. Allen-Hall, L.; Arnason, JT; Cano, P.; Lafrenie, RM Uncaria tomentosa toimib NF-kappaB kaudu tugeva TNF-alfa inhibiitorina. J. Ethnopharmacol. 2010, 127, 685–693. [CrossRef]

6. Elgawish, RA; Abdelrazek, HMA; Ismail, SAA; Loutfy, NM; Soliman, MTA Uncaria tomentosa ekstrakti hepatoprotektiivne toime fiproniili subkroonilise kokkupuute vastu isastel rottidel. Keskkond. Sci. Saasta. Res. Int. 2019, 26, 199–207. [CrossRef]

7. Ciani, F.; Tafuri, S.; Troiano, A.; Cimmino, A.; Fioretto, BS; Guarino, AM; Politsei, A.; Vivo, M.; Evidente, A.; Carotenuto, D.; et al. Uncaria tomentosa vesiekstrakti proliferatsioonivastane ja pro-apoptootiline toime lamerakk-kartsinoomirakkudes. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 285–294. [CrossRef]

8. Zari, A.; Alfarteesh, H.; Buckner, C.; Lafreniere, RM Ravi Uncaria tomentosaga soodustab apoptoosi B16-BL6 hiire melanoomirakkudes ja pärsib B16-BL6 kasvajate kasvu. Molecules 2021, 26, 1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Ko´smider, A.; Czepielewska, E.; Kura´s, M.; Gulewicz, K.; Pietrzak, W.; Nowak, R.; Nowicka, G. Uncaria tomentosa lehtede keetmine moduleerib erinevalt ROS-i tootmist vähi- ja normaalsetes rakkudes ning mõju Tsisplatiini tsütotoksilisus. Molecules 2017, 22, 620. [CrossRef] [PubMed]

10. Almeida, IV; Soares, LC; Lucio, FT; Cantagalli, LB; Taaskasutamine, AF; Vicentini, VEP Taimse ravimi Uncaria tomentosa (Willd.) DC kemoterapeutilised toimed. Genet. Mol. Res. 2017, 16. [CrossRef] [PubMed]

11. Caon, T.; Kaiser, S.; Feltrin, C.; de Carvalho, A.; Sincero, TCM; Ortega, GG; Simões, CMO Uncaria tomentosa (kassiküüs) erinevate preparaatide antimutageenne ja antiherpeetiline toime. Food Chem. Toksikool. 2014, 66, 30–35. [CrossRef] [PubMed]

12. Batiha, GE-S.; Magdy Beshbishy, ​​A.; Wasef, L.; Elewa, YHA; Abd El-Hack, ME; Taha, AE; Al-Sagheer, AA; Devkota, HP; Tufarelli, V. Uncaria tomentosa (Willd. ex Schult.) DC.: Ülevaade keemilistest koostisosadest ja bioloogilisest tegevusest. Rakendus Sci. 2020, 10, 2668. [CrossRef]

13. Santos Araújo, MdC; Farias, IL; Gutierres, J.; Dalmora, SL; Flores, N.; Farias, J.; de Cruz, I.; Chiesa, J.; Morsch, VM; Chitolina Schetinger, MR Uncaria tomentosa – rinnavähi adjuvantravi: kliiniline uuring. Evid. Põhinev komplement. Alternatiiv. Med. 2012, 2012, 676984. [CrossRef]

14. Navarro Hoyos, M.; Sánchez-Patán, F.; Murillo Masis, R.; Martín-Álvarez, PJ; Zamora Ramirez, W.; Monagas, MJ; Bartolomé, B. Uncaria tomentosa L. (kassiküüs) fenoolsuse hindamine: lehed, vars, koor ja puiduekstraktid. Molekulid 2015, 20, 22703–22717. [CrossRef]

15. Farias, I.; do Carmo Araújo, M.; Zimmermann, ES; Dalmora, SL; Benedetti, AL; Alvarez-Silva, M.; Asbahr, ACC; Bertol, G.; Farias, J.; Schetinger, MRC Uncaria tomentosa stimuleerib müeloidsete eellasrakkude proliferatsiooni. J. Ethnopharmacol. 2011, 137, 856–863. [CrossRef] [PubMed]

16. Yunis-Aguinaga, J.; Claudiano, GS; Marcusso, PF; Manrique, töörühm; de Moraes, JRE; de Moraes, FR; Fernandes, JBK Uncaria tomentosa suurendab Streptococcus agalactiae poolt nakatatud Oreochromis niloticuse kasvu ja immuunaktiivsust. Kala. Karpide immunol. 2015, 47, 630–638. [CrossRef] [PubMed]

17. Bors, M.; Bukowska, B.; Pilarski, R.; Gulewicz, K.; Oszmia ´nski, J.; Michałowicz, J.; Koter-Michalak, M. Uncaria tomentosa ekstraktide kaitsev toime inimese erütrotsüütidele 2,4-diklorofenooli (2,4-DCP) ja katehhooli poolt indutseeritud oksüdatiivse stressi korral. Food Chem. Toksikool. 2011, 49, 2202–2211. [CrossRef]

18. Bors, M.; Michałowicz, J.; Pilarski, R.; Sici ´nska, P.; Gulewicz, K.; Bukowska, B. Uncaria tomentosa ekstraktide bioloogiliste omaduste uuringud inimese vere mononukleaarsetel rakkudel. J. Ethnopharmacol. 2012, 142, 669–678. [CrossRef]

19. Bors, M.; Sici ´nska, P.; Michałowicz, J.; Wieteska, P.; Gulewicz, K.; Bukowska, B. Uncaria tomentosa ekstraktide mõju hindamine inimese erütrotsüütide suurusele ja kujule (in vitro). Keskkond. Toksikool. Pharmacol. 2012, 33, 127–134. [CrossRef] [PubMed]