Proteaas Calpain2a piirab kaasasündinud immuunsust, sihites TRAF6 Teleost Fishis

TNF retseptoriga seotud faktor 6 (TRAF6) mängib nii antibakteriaalsetes kui ka viirusevastastes signaaliülekande radades võtmerolli signaaliülekandes. TRAF6 regulatiivsetest mehhanismidest madalamatel selgroogsetel on aga vähem teatatud. Selles uuringus tuvastame calpain2a, mis on kaltsiumist sõltuva proteaaside perekonna liige, millel on ainulaadne hüdrolüütilise ensüümi aktiivsus ja mis toimib teleostkalade antibakteriaalse ja viirusevastase immuunsuse võtmeregulaatorina. Lipopolüsahhariidi (LPS) stimuleerimisel soodustab calpain2a pärssimine põletikuliste tsütokiinide ülesreguleerimist. Mehhaaniliselt interakteerub calpain2a TRAF6-ga ja vähendab hüdrolüüsimise teel TRAF6 valgu taset. Pärast ensümaatilise aktiivsuse kaotamist inhibeerib mutantne calpain2a konkureerivalt TRAF6 dimeeri moodustumist ja auto-ubikvitinatsiooni. Calpain2a hävitamine soodustab ka raku viirusevastast vastust. Mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, pärsib IFN-i regulatoorse faktori (IRF) ubikvitineerimist 3/7 TRAF6-st. Kokkuvõttes klassifitseerivad need leiud calpain2a kaasasündinud immuunvastuste negatiivseks regulaatoriks, suunates TRAF6 teleost-kaladele.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Esimese kaitseliinina sissetungivate patogeenide vastu on kaasasündinud immuunsusel oluline roll keha kaitsmisel bakterite invasiooni ja viirusnakkuste eest. Membraani mustrite tuvastamise retseptorid (PRR-id) tunnevad kohe ära patogeeniga seotud molekulaarsed mustrid (PAMP) 1–3. Kolm enim uuritud PRR-i kaasasündinud immuunsuses on Toll-like retseptorid (TLR), RIG-I-sarnased retseptorid (RLR) ja NOD-sarnased retseptorid (NLR), mis tunnevad ära erinevad PAMP-id ja käivitavad signaalikaskaade, et aktiveerida põletikueelseid tsütokiine ja viirusevastane tegur 4–6. TNF retseptoriga seotud faktor (TRAF) 6 on bakteriaalse invasiooni ja viirusnakkuste vastase võitluse asendamatu osa. Olulise lipopolüsahhariidi (LPS) poolt aktiveeritud signaalirajana on tuuma transkriptsioonifaktori-κB (NF-κB) rada üksikasjalikult kaardistatud. Enamikku valgu funktsioone NF-κB signaaliülekande rajal on põhjalikult uuritud 1, 7. Müeloidse diferentseerumisfaktori 88 (MyD88) aktiveerivad esmalt TLR-id vastuseks LPS-ile ja IRAK4 toimib vahendajana, aktiveerides IRAK1 ja IRAK2, mis seovad MyD88 TRAF68–11-ga. Ubc13 ja Uev1A katalüüsivad TRAF6 K63--seotud ubikvitineerimist, mis kannab K63 ubikvitiini ahela üle TAB2-le ja TAB3-le, mis viib TAK112–16 aktiveerimiseni. TRAF6-reguleeritud IKK aktivaator 2 (TRIKA2), mis koosneb TAK1-st, TAB1-st ja TAB2-st, aktiveerib IκB kinaasi (IKK) / fosforüülimise inhibiitori17–19. Transkriptsioonifaktor NF-κB siseneb tuuma ja soodustab põletikuliste tsütokiinide tootmist20. Kui TLR7/9 tunneb viiruse ära, edastab MyD88- IRAKs-TRAF6 kompleks signaale IFN-i regulaatorfaktorile (IRF) 7, soodustab IRF7 ubikvitineerimist ja aktiveerib selle fosforüülimise tuumaks21,22. RLR signaalirajas aktiveerivad RIG I ja melanoomi diferentseerumisega seotud geen 5 (MDA5) mitokondriaalse viirusevastase signaalvalgu (MAVS) 23, 24. MAVS-i liitmine on RLR-signaali edastamise alguse oluline tunnusjoon23,25,26. TRAF2/3/6 on esimesed tegurid, mille MAVS27,28 aktiveerib. TRAF3 aktiveerib TBK1-IRF3 signaaliülekande ja MAVS-TRAF6 kompleks aktiveerib NF-κB signaaliülekande, mis soodustab IFN-1 ekspressiooni27,29.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

TRAF6 aktiveerimise molekulaarne mehhanism on juba tõestatud. Dimeeri kujul olev TRAF6 läbib autoubikvitinatsiooni Ubc13 ja Uev1A katalüüsi all, mis on seotud sõrmusesõrme domeeni ja ZF sõrmede domeeniga. TRAF6 / Ubc13 ~ UB mudel kinnitab TRAF6 dimeeri olulist rolli K63 ubikvitiini ahela agregeerimisel ja edastamisel30. Lisaks on teatatud, et sõrmusesõrme ja ZF-sõrmede domeen värbab sebrakala TRAF6 kristallimudelis E2 ~ ub konjugaate ning avastati, et TRAF6 võib esimest korda moodustada heterodimeeri TRAF5-ga samast TRAF-perekonnast16. Deubikvitineerimise perekonna valgud: A20, CYLD, USP2a, USP4 ja USP20 on suunatud TRAF6-le, et eemaldada K63--seotud ubikvitinatsioon ja vähendada allavoolu signaaliülekannet31–35. Pärmi kahe hübriidsüsteem sõelub välja UBE2O ja TRAF6 vahelise interaktsiooni ja kinnitab, et see interaktsioon mõjutab otseselt TRAF6 aktiveerimist MyD8836 poolt. TRAF6 allavoolu signaaliülekande protsessis interakteerub ECSIT vahevalguna vastavalt TRAF6 ja TAK1-ga ning see interaktsioon tugevdab TRAF6 ja TAK137 seondumist. LPS-indutseeritud TLR4 signaalimise korral takistavad PRDX-id TRAF6-l värbamast ECSIT-i K63 ubikvitiini ahela kohaletoimetamiseks ja inhibeerivad ka TRAF6 poolt aktiveeritud BECN1 autofagia rajal38. MST4 aktiveerib TRAF6 fosforüülimise Thr463 ja Thr486 juures ning inhibeerib TRAF6 dimerisatsiooni ja ubikvitineerimist39. Imetajatel on TRAF6 valgu reguleerimise mehhanismi antibakteriaalse ja viirusevastase immuunsuse osas laialdaselt uuritud. TRAF6 uuringuid madalamatel selgroogsetel on aga vähem uuritud. Immuunvastus teleostkalades tugineb peamiselt TLR- ja RLR-radadele immuunvastuse läbiviimiseks pärast patogeeniga nakatumist. Seetõttu on ülioluline uurida TRAF{47}}vahendatud signaaliradade regulatiivset mehhanismi. calpain2 (m-calpain) on kaltsiumist sõltuvate proteaaside perekond, mis koosneb enam kui 16 liikmest imetajatel ja paljudel teistel organismidel40. Kalpaiini valgu perekonna varaseim uuring on seotud rakkude liikumisega41. kalpaiin soodustab rakkude migratsiooni ja leiti, et see pärsib neutrofiilide migratsiooni ning p38 MAPK ja ERK MAPK42 aktiveerimist. Hüdrolaasi aktiivsus on kalpaiini üks olulisi funktsioone. Immuunsüsteemi reguleerimisel soodustab kalpaiin{56}} NF-κB vabanemist, hüdrolüüsides IkB ja aktiveerib signaaliülekanderaja43. Selles uuringus tegime kindlaks, et calpain2a interakteerub TRAF6-ga ja toimib negatiivse regulaatorina antibakteriaalsete ja viirusevastaste vastuste korral teleostkaladel, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpain2a soodustab hüdrolaasi aktiivsuse kaudu TRAF6 valgu taseme lagunemist. Vahepeal inhibeerib mutantne kalpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, K63 ubikvitiini ahela moodustumist, inhibeerides TRAF6 dimeeri. Peegeldub, et nii calpain2a kui ka mutantne calpain2a lõpetavad TRAF6 ubikvitineerimise ECSIT / BENC1 / IRF3 / IRF7-ks. calpain2a peatab NF-κB ja IFN signaalimisprotsessi, sihites TRAF6. Meie tulemused pakuvad molekuli TRAF{75}}vahendatud immuunregulatsiooni uurimiseks madalamatel selgroogsetel.

Tulemused

calpain2a interakteerub TRAF6-ga ja reguleerib negatiivselt NF-κB signaaliülekannet.

Et saada ülevaadet TRAF{0}}seotud valkudest teleostkalade kaasasündinud immuunvastuses, iseloomustasime afiinsuspuhastuse ja massispektromeetria abil interaktoomi miiuy croaker TRAF6. Sorteeriti sildivaba kvantifitseerimise (LFQ) intensiivsuse järgi, püüdsime osa andmetest kinni ja kuvasime need (joonis 1a). TRAF6-seotud valkude hulgas võib calpain2a reguleerida TRAF6 aktiivsust ja mõjutada TRAF6-vahendatud signaaliradu. Esiteks tuleks uurida seost calpain2a ja TRAF6 vahel valgu tasemel, kontrollisime calpain2a interaktsiooni TRAF6-ga Miiuy croaker neeru rakuliinides (MKC). Endogeense koimmunosadestamise katsed näitasid, et calpain2a interakteerub TRAF6-ga (joonis 1b, c). Nagu näitavad mööduva transfektsiooni ja koimmunosadestamise katsed, interakteerusid üleekspresseeritud calpain2a ja TRAF6 üksteisega (joonis 1d, e). Kõik need näitavad, et calpain2a interakteerub TRAF6-ga ja nende toimemehhanismi uurimiseks on vaja täiendavaid katseid. Inimese, hiire, sebrakala ja kalpain2a valkude mitme järjestuse joondamisega on calpain2a kalade ja imetajate vahel evolutsiooniliselt konserveerunud (joonis 1f). Kalpain2a funktsiooni määramiseks kaasasündinud immuunsuses uurisime, kas calpain2a oli seotud LPS-i stimulatsiooni poolt indutseeritud NF-κB aktiveerimisega. Transfekteerisime epithelioma papulosum cyprinid (EPC) rakud NF-KB lutsiferaasi reporteriga, sisekontrolli renilla lutsiferaasi reporteriga ja vektoriga, mis kodeerib calpain2a või tühja vektorit. calpain2a vähendas oluliselt NF-KB reporteri aktiivsust LPS-i stimuleerimisel annusest sõltuval viisil (joonis 1g). Lisaks vähenesid põletikueelsed tsütokiinid nagu IL-1 ja IL-8 promootor, mis reageerisid LPS-i stimulatsioonile calpain2a üleekspresseeritud EPC rakkudes (joonis 1h, i), mis viitab calpain2a potentsiaalsele rollile põletikuliste signaalide edastamisel. LPS-i stimulatsioonist põhjustatud rajad.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

LPS-indutseeritud NF-κB signaaliülekande negatiivne regulatsioon calpain2a poolt.

Kalpain2a potentsiaalse rolli uurimiseks NF-KB signaaliülekandes transfekteerisime calpain2a MKC-s LPS-i ajagradiendiga ja hindasime LPS-ile reageerivaid põletikulisi tsütokiine. Calpain2a üleekspressioon viis IL-1, IL-8 ja IL-6 ekspressiooni allareguleerimiseni (joonis 2a). Järgmiseks kavandasime kaks calpain2a-spetsiifilist väikest segavat RNA-d (siRNA-d), mis vähendasid tõhusalt calpain2a-d (joonis 2b, d). Calpain2a pärssimine suurendas oluliselt LPS-i indutseeritud põletikueelseid tsütokiine, sealhulgas IL-1 ja IL-8 MKC ja Miiuy croaker intestine rakuliinides (MIC) (joonis 2c, e). LPS-stimuleeritud rakkude rühmas suurendas calpain2a katkestamine rakkude proliferatsiooni. Samamoodi avastasime stimulatsiooni puudumisel, et calpain2a katkestamine suurendas ka rakkude proliferatsiooni (joonis 2f). Et teha kindlaks, kas calpain2a inhibeeris valke LPS-i indutseeritud NF-KB signaaliülekandes, inhibeeris calpain2a märkimisväärselt TRAF6 endogeense valgu taset, kuid mitte MyD88, IRAK4 ega TAK1 (joonis 2g). Kokkuvõtlikult võib öelda, et calpain2a ja põletikueelse tsütokiini ekspressiooni kineetika viitas calpain2a funktsionaalsele osalemisele LPS-i indutseeritud NF-κB signaaliülekandes.

Joonis fig 1 calpain2a interakteerub TRAF6-ga ja inhibeerib NF-κB signaalirada. TRAF6 interaktoomi loend, mis põhineb märgistuseta kvantifitseerimise intensiivsusel (jaotis). b, c MKC rakud külvatud 6 cm2 tassidesse. 24 tunni pärast immunosadestati (IP) rakulüsaadid anti-TRAF6 või anti-calpain2a afiinsusgeelidega. Seejärel analüüsiti immunosademeid ja rakulüsaate IB-ga vastavalt anti-TRAF6 ja anti-calpain2a Abs. d, e HEK 293 rakud, mis olid külvatud 6 cm2 tassidele, transfekteeriti plasmiididega calpain2a-Flag ja TRAF6-Myc (igaüks 2 ug). 24 tunni pärast immunosadestati rakulüsaadid (IP) anti-Myc d või anti-Flag e afiinsusgeelidega. Seejärel analüüsiti immunosademeid ja rakulüsaate IB-ga vastavalt anti-Myc ja anti-Flag Abs. f Musta taustaga on esile tõstetud samad aminohapped inimese calpain2a (Hu-calpain2), hiire calpain2a (Mu-calpain2), sebrakala calpain2a (ZF-calpain2a) ja miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) hulgas. g-I EPC rakud transfekteeriti calpain2a-Flag või tühja vektoriga koos NF-κB, IL-1 ja IL-8 lutsiferaasi reporteritega. 24 tundi pärast transfektsiooni rakke ei töödeldud (Mock) või töödeldi LPS-ga 6 tundi. Lutsiferaasi aktiivsuse väärtus saavutati Renilla lutsiferaasi aktiivsuse suhtes (n=3 rühma kohta). Transientselt transfekteeritud calpain2a lipu ekspressiooni mõõtmiseks kasutati Western blot analüüsi. Laadimiskontrollina kasutati Tubuliini ekspressiooni. Andmeid analüüsiti kahesuunalise ANOVA abil (g, h, i). **p < 0.01. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses.

Calpain2a koostoime TRAF6-ga.

Domeenianalüüs viidi läbi Conserved Domain Database (CDD) NCBI abil. calpain2a koosneb kolmest domeenist: Calpaini perekonna tsüsteiiniproteaasi (CysPc) domeen (aa 46-339), tsentraalne Calpaini suure subühiku domeen III (aa 360-499) ja C-terminaalne Penta-EF käedomeen ( aa 500-697). Et teha kindlaks, milline calpain2a domeen on vajalik selle interaktsiooniks TRAF6-ga, lõime kolm kärbitud mutanti: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) ja calpain (500-697). (joonis 3a). HEK293 rakud transfekteeriti calpain2a-Flag metsiktüüpi (WT), calpain2a-Flag truncation mutantide või TRAF6-HA vektoriga. Leidsime, et nii täispikk calpain2a kui ka kolm kärbitud mutanti võivad TRAF6-ga suhelda (joonis 3c). TRAF6 koosneb C-terminaalsest TRAF domeenist, mähisega domeenist, tsingi sõrmede domeenist ja sõrmuse sõrme domeenist38. Et uurida, milliseid TRAF6 domeene oli vaja selle interaktsiooniks calpain2a-ga, koostasime rea TRAF6 kärbitud mutante, sealhulgas TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36) }}) ja TRAF6 (400-574). Vahepeal tegime domeeni mutandid: TRAF6ΔRing (millest sõrmusesõrme domeen on kustutatud), TRAF6ΔZF (milles on tsingi sõrmede domeen kustutatud), TRAF6ΔCC (milles on mähisega domeen kustutatud) ja TRAF6ΔTRAF-C ( milles C-terminaalne TRAF domeen on kustutatud) (joonis 3b). calpain2a suhtles nii täispika TRAF6-ga kui ka TRAF6 kärpimistega, mis sisaldasid C-terminaalset TRAF-domeeni, mähisega domeeni, tsink-sõrmede domeeni (joonis 3d, f), kuid mitte sõrmusesõrme domeeniga (joonis 3e) . Lutsiferaasi testid näitasid, et calpain2a ja nende kärbitud mutantide üleekspressioon inhibeeris oluliselt NF-κB ja IL-1 reporteri aktiivsust EPC rakkudes (joonis 3h). Lisaks uuriti calpain2a subtsellulaarset kolokalisatsiooni TRAF6-ga. Transfekteerisime EPC rakud TRAF{60}}GFP ja tühja vektori või calpain2a-mCherryga. Konfokaalne mikroskoopia analüüs näitas, et TRAF6 rohelised signaalid kattusid calpain2a punaste signaalidega, mis näitas, et calpain2a lokaliseerub EPC rakkudes koos TRAF6-ga (joonis 3i, j). Need andmed näitavad, et TRAF6 mitme domeeni struktuurne alus (C-terminaalne TRAF domeen, mähisega domeen, tsingi sõrmede domeen), kuid mitte sõrmusesõrme domeen, on määrav selle seose suhtes calpain2a-ga (joonis 3g).

Joonis fig 2 calpain2a negatiivne reguleerib LPS-indutseeritud NF-κB signaalirada. IL-1, IL-8 ja IL-6 mRNA MKC-s, mis on transdutseeritud calpain2a-Flagi või tühja vektoriga ja töödeldud soolalahusega (0) või nakatatud LPS-iga erinevatel põhjustel. korda (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 rühma kohta). b, d MKC rakud ja MIC rakud transfekteeriti si-calpain2a #1 ja si-calpain2a #2 (100 nM) või si-ctrl-ga (100 nM). 48 tundi pärast transfektsiooni mõõdeti calpain2a ekspressiooni qRT PCR abil (n=3 rühma kohta). Calpain2a valgu tase määrati Western blot analüüsiga. c, e IL-1, IL-8 mRNA MKC-s ja MIC-s, mis on stabiilselt transdutseeritud si-calpain2a #1 või si-ctrl-ga (kontrollvektor) ja töödeldud soolalahusega (0) või nakatatud LPS-ga erinevateks korda (4 h, 8 h) (n=3 rühma kohta). f MKC rakud transfekteeriti kas si-ctrl või si-calpain2a #1-ga. 36 tundi pärast transfektsiooni stimuleeriti rakke LPS-ga 12 tundi, seejärel mõõdeti rakkude proliferatsiooni testi (n=3 rühma kohta). Skaalariba, 100 μm. g calpain2a-Flag transfekteeriti MKC rakkudesse, mida nakatati LPS-ga erinevatel aegadel (3 h, 6 h, 9 h). Näidatud Abs-ga rakulüsaatide immunoblotanalüüs. Suhteline mRNA tase normaliseeriti igas proovis -aktiini kodeeriva geeni ekspressiooniga. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses. Andmeid analüüsiti kahesuunalise ANOVA (a, c, e, f) või ühesuunalise ANOVA (b, d) abil. *p < 0,05, **p < 0,01.

Joonis 3 Calpain2a interaktsioon TRAF6-ga. a, b Selles uuringus kasutati miiuy croaker calpain2a, TRAF6 ja mutantide domeenikorralduse skemaatilised diagrammid. "+" tähistab interaktsiooni TRAF6 või calpain2a-ga, "-" tähendab interaktsiooni puudumist. c HEK293 rakud transfekteeriti näidustatud, calpain2a-Flag metsiktüüpi (WT) ja calpain2a-Flag kärbitud mutantidega või TRAF6-HA-ga, nagu näidatud. 24 tundi pärast transfektsiooni transfekteeritud rakud ekstraheeriti ja rakulüsaadid immunosadestati HA-vastase antikehaga, millele järgnes IB, kasutades anti-HA või anti-Flag antikeha. d–f HEK293 rakud transfekteeriti näidustatud TRAF6-HA metsiktüüpi (WT) ja TRAF6-HA kärbitud mutantidega või calpain2a-Flagiga, nagu näidatud. 24 tundi pärast transfektsiooni transfekteeritud rakud ekstraheeriti ja rakulüsaadid immunosadestati HA-vastase antikehaga d, f või anti-Flag antikehaga e, millele järgnes IB, kasutades anti-HA või anti-Flag antikeha. g TRAF6 ja calpain2a interaktsioonikoht. h EPC rakud transfekteeriti TRAF6-HA, calpain2a-Flag või calpain2a-Flag kärbitud mutantidega koos NF-κB ja IL-1 lutsiferaasi reporteritega. Pärast 36 tundi pärast transfektsiooni saavutati lutsiferaasi aktiivsuse väärtus renilla lutsiferaasi aktiivsuse suhtes (n=3 rühma kohta). I j EPC rakud transfekteeriti mock, calpain2a-mCherry ja TRAF6-GFP-ga. DAPI-värvitud tuumad on näidatud sinisena. calpain2a tuvastati punase fluorestsentsiga ja TRAF6 tuvastati rohelise fluorestsentsiga. Skaalariba, 10 μm. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses. Andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA (h) abil. **p < 0,01.

calpain2a inhibeerib proteolüütilise aktiivsusega TRAF6 valgu ekspressioonitaset.

Calpain2a regulatiivse mehhanismi uurimiseks TRAF6-l uurisime kõigepealt, kas calpain2a mõjutas TRAF6-d valgu tasemel. calpain2a-Myc ja TRAF{6}}Flag transfekteeriti koos EPC rakkudesse, TRAF6 valgu tase langes osaliselt 30 tunni pärast (joonis 4a). Nagu on näidatud joonisel 4b, soodustas calpain2a TRAF6 lagunemist annusest sõltuval viisil. Calpain2a juuresolekul ei mõjutanud see TRAF6 mRNA taset, mis näitab, et calpain2a mõjutab ainult TRAF6 valgu taset. Vahepeal näitas inhibiitori tsükloheksimiidi (CHX) test, et calpain2a võib kiirendada TRAF6 valgu poolväärtusaega (joonis 4c). Calpain2a üleekspressioon MKC rakkudes põhjustas endogeense TRAF6 destabiliseerumise (joonis 4d). Et uurida, kas calpain2a poolt vahendatud TRAF6 lagunemine sõltus ubikvitiini-proteasoomist, autofagosoomist, lüsosomaalsetest radadest või muust, töödeldi EPC rakke neid radu inhibeerivate reagentidega: MG132, 3-MA ja NH4Cl. Siiski ei muutnud proteasoomi inhibiitor MG132, autofagiline inhibiitor 3-MA ega lüsosomaalne inhibiitor NH4Cl (joonis 4e) TRAF6 kalpaiin2a-vahendatud destabiliseerumist. Järgmisena töödeldi EPC rakke reagentidega: E-64 (kalpaiini inhibiitor, mis inaktiveerib kalpaiini hüdrolaasi aktiivsust) ja PMSF (mittespetsiifiline seriinproteaasi inhibiitor). Leidsime, et kalpaiini inhibiitor E-64 takistas lagunemist TRAF6 valgu tasemel (joonis 4f). Nagu on näidatud joonisel 4g, muutis E-64 ka endogeense TRAF6 valgu taseme lagunemise kalpain2a poolt.

Joonis fig 4 calpain2a inhibeerib TRAF6 valgu ekspressiooni. a Tühjade vektorite või calpain2a-Myc plasmiidide ajagradiendi katse koos TRAF6- Flagiga viidi läbi EPC rakkudes. Rakulüsaadid allutati IB-le koos anti-Myc, anti-Flag ja anti-Tubulin Abs. RNA ekstraheeriti rakkudest ja pöördtranskribeeriti ning seejärel amplifitseeriti TRAF6 ja aktiini PCR praimeritega. b EPC rakud külvati 12-süvendiplaatidele üleöö ja kaastransfekteeriti TRAF6-Flagi ja calpain2a-Myc-ga (0.3, 0.6 või {{ 18}},9 ug) 48 tundi. TRAF6-Flag ja calpain2a-Myc valkude ekspressioon tuvastati Western blot analüüsiga. RNA ekstraheeriti rakkudest ja pöördtranskribeeriti, seejärel amplifitseeriti TRAF6 ja aktiini PCR praimeritega. c calpain2a-Myc või tühjad vektorid transfekteeriti koos TRAF6-Flagiga EPC rakkudesse. 36 tundi pärast transfektsiooni töödeldi transfekteeritud rakke tsükloheksimiidiga (CHX) 2 või 4 tundi. d MKC rakud transfekteeriti calpain2a-Flag või tühjade vektoritega. 48 tundi pärast transfektsiooni allutati rakulüsaadid IB-le koos anti-TRAF6, anti-Flag ja anti-Tubulin Abs. e, f EPC rakud transfekteeriti näidatud plasmiididega MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 või 75 µM) või PMSF juuresolekul või puudumisel 6 h enne immunoblotanalüüsi läbiviimist. g MKC rakke transfekteeriti calpain2a-Flag'iga E{{50}} juuresolekul või puudumisel (50 või 75 µM) 6 tundi enne immunoblotanalüüsi läbiviimist. h calpain2a-Flag ja calpain2a-ΔCysPc-Flag transfekteeriti koos TRAF6-HA-ga EPC rakkudesse. 48 tundi pärast transfektsiooni allutati rakulüsaadid näidatud Abs-ga IB-le. I calpain2a-Flag ja calpain2a-ΔCysPc-Flag kotransfekteeriti MKC rakkudesse. 48 tundi pärast transfektsiooni allutati rakulüsaadid IB-le koos anti-TRAF6, anti-Flag ja anti-Tubulin Abs. j IL-1, IL-8 mRNA MKC-s, mis on stabiilselt transdutseeritud calpain2a-Flagi ja calpain2a-ΔCysPc-Flagiga ning töödeldi soolalahusega (0) või nakatati LPS-ga 4 tundi (n=3 rühma kohta). Suhteline mRNA tase normaliseeriti igas proovis -aktiini kodeeriva geeni ekspressiooniga. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses. Andmeid analüüsiti kahesuunalise ANOVA abil (j). **p < 0,01.

Et teha kindlaks, kas TRAF6 lagunemine sõltus calpain2a hüdrolaasi aktiivsusest. Kasutades ära varasemaid kalpain2a struktuurseid ja biokeemilisi uuringuid imetajatel, muteerisime calpain2a tsüsteiini, histidiini ja asparagiini jäägid alaniiniks (calpain2a C105A, H262A, N286A ja 3 A), mis kaotas katalüütilise-triaadi koordinatsiooni44-46. Me täheldasime, et see mutatsioon ei mõjutanud TRAF6 lagunemist (täiendav joonis 1a). Niisiis, me muteerisime proteaasi domeeni, mis on calpain2a (tähistatud kui calpain2a-ΔCysPc) Calpaini perekonna tsüsteiini proteaasi (CysPc) domeen. Kalpain2a-ΔCysPc ei mõjuta ei üleekspresseeritud TRAF6 ega endogeenset TRAF6 (joonis 4h, i). Metsiktüüpi või muteerunud calpain2a mõjutab LPS-i stimuleerimisel aga põletikueelseid tsütokiine IL-1 ja IL-8 samaaegselt (joonis 4j). Mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, ei mõjuta TRAF6 valgu taset, kuid mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, mõjutas siiski allavoolu põletikueelsete tsütokiinide ekspressiooni. See käivitas meie uurimise võimalike mehhanismide kohta, mille abil calpain2a reguleerib TRAF6. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et calpain2a reguleerib NF-κB signaaliülekannet, pärssides TRAF6 valgu taseme ekspressiooni oma kalpaiini hüdrolaasi aktiivsuse kaudu.

calpain2a inhibeerib TRAF6 ubikvitiini-ligaasi aktiivsust.

Järgmisena uurisime molekulaarseid mehhanisme, mille abil calpain2a reguleerib negatiivselt TRAF6-aktiveeritud NF-κB signaaliülekannet ja kas calpain2a interaktsioon TRAF6-ga ensümaatilise aktiivsuse kaotamisel moduleerib selle ubikvitiini ligaasi aktiivsust. Töötlesime MKC rakke LPS-ga ja seejärel immunosadestasime TRAF6. Ubikvitineerimise test puhastatud rekombinantsete valkudega kinnitas, et calpain2a ja calpain2a-ΔCysPc vähendasid TRAF6 ubikvitineerimist (joonis 5a). Nagu on näidatud joonistel 5b, c, vähendasid nii calpain2a kui ka calpain2a-ΔCysPc oluliselt TRAF6 WT ja K63 ubikvitineeritud valke. Calpain2a ja calpain2a-ΔCysPc kontsentratsioonigradiendid vähendasid TRAF6 WT ja K63 ubikvitineeritud valke annusest sõltuval viisil. calpain2a-ΔCysPc takistas siiski TRAF6 K63 ubikvitiini ahela agregatsiooni, mõjutamata TRAF6 valgu taset (joonis 5d, e). Seejärel transfekteerisime MKC rakke Myc-märgistatud TRAF6 ekspresseerimiseks Flag-märgistatud calpain2a-ΔCysPc juuresolekul või puudumisel, seejärel teostasime immunosadestamise katsed anti-Myc antikehaga ja analüüsiti immunoblotiga anti-UB-ga. Sellist TRAF6 ubikvitineerimist nõrgendas oluliselt calpain2a-ΔCysPc (joonis 5f). LPS-i poolt stimuleeritud TRAF6 toimetab K63-seotud ubikvitiini ahela TAK1-le, mis stimuleerib TAK1 autofosforüülimist ja aktiveerib NF-κB18. TAK1 WT ja K63 ubikvitiini valgud suurenesid märkimisväärselt TRAF6 juuresolekul, samas kui TAK{49}}-seotud ubikvitinatsioon inhibeeriti calpain2a-ΔCysPc juuresolekul (joonis 5g, h). Need andmed kinnitavad, et mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, pärsib sarnaselt TRAF6 ubikvitiini ligaasi aktiivsust, mõjutamata TRAF6 valgu taset.

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

calpain2a inhibeerib TRAF6 homo-oligomerisatsiooni.

TRAF6 sünteesitud Lys63 ubikvitiini ahel mängib signaali ülekandes võtmerolli. On teatatud, et TRAF6 dimeriseerimine on selle ubikvitiini ahela sünteesiks hädavajalik . Dimerisatsioonimudel on tihedalt seotud Ubc13 kombinatsiooniga K63 ubikvitinatsiooni tekitamiseks16, 30. Kontrollimaks, kas kalad TRAF6 võivad moodustada dimeere, kasutasime kaas-IP katseteks erinevate märgistega TRAF6 plasmiide: Myc-märgistatud TRAF6 ja HA-märgistatud TRAF6. IP-analüüs viidi läbi, kasutades HA-vastast antikeha, HATRAF6 interakteeris Myc-TRAF6-ga (joonis 6a). Kalpain2a inhibeeriva toime uurimiseks TRAF6-dimeeri interaktsioonis ekspresseeriti lipuga märgistatud calpain2a, HA-märgistatud TRAF6 ja Myc-märgistatud TRAF6 ajutiselt HEK293 rakkudesse. Nagu oodatud, vähenes TRAF6-dimeeri interaktsioon calpain2a juuresolekul (joonis 6b). Samal ajal, et vältida TRAF6 lagunemist calpain2a poolt. Transfekteerisime lipuga märgistatud calpain2a-ΔCysPc ja leidsime, et TRAF6-dimeeri interaktsioon vähenes järk-järgult calpain2a-ΔCysPc juuresolekul (joonis 6c). Nagu on näidatud joonistel 6d, e, leidsime HA-TRAF6 poolt Myc-TRAF6 võimendatud WT ja K63 ubikvitinatsiooni. Kuigi HEK293 rakke transfekteeriti koos calpain2a ja calpain2a-ΔCysPc-ga, pärsitakse tõhustatud ubikvitineerimist. Need tulemused viitavad sellele, et nii metsiktüüpi calpain2a kui ka mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, inhibeerivad TRAF6 homooligomerisatsiooni ja auto-ubikvitinatsiooni.

calpain2a pärsib TRAF6 ubikvitinatsiooni kohaletoimetamist ECSIT-i ja BECN1-sse.

Nagu on kujutatud joonisel fig 5d, leidsime, et calpain2a segas ubikvitilatsiooniprotsessi TRAF6-lt TAK1-le. On teatatud, et ECSIT toimis TAK1 ja TRAF6 adaptervalguna, et soodustada NF-κB signaaliülekannet LPS-i stimuleerimise teel37. Kontrollimaks, kas ECSIT-il on teleost-kalades nimetatud funktsioonid, viisime ECSIT-i valkude järjestuste joondamise läbi inimesel, hiirel ja vingerpussil (täiendav joonis 1b). Transfekteerisime EPC rakud NF-KB lutsiferaasi reporteriga, ECSIT suurendas oluliselt NF-KB reporteri aktiivsust pärast LPS-i stimuleerimist (täiendav joonis 1c). ECSITi üleekspressioon MKC rakkudes viis TNF- mRNA taseme ülesreguleerimiseni (täiendav joonis 1d). Pärast kalade ECSITi ja TRAF6 transfekteerimist HEK293 rakkudes leidsime, et TRAF6 suhtles ECIST-iga (joonis 7a). Sarnaselt transfekteeriti ka ECSIT ja TAK1 ning ka nende kahe valgu interaktsioon säilis (joonis 7b). Seejärel, et kontrollida, kas calpain2a-ΔCysPc inhibeerib TRAF6-ECSIT kompleksi moodustumist, transfekteerisime kolm plasmiidi HEK293 rakkudesse ja leidsime, et calpain2a-ΔCysPc takistas TRAF6-ECSIT kompleksi teket (joonis 7c). ). Ubikvitiini ahela ülekandeprotsessi kontrollimiseks NF-κB signaalimises. Nagu on näidatud joonisel 7d, võib TRAF6 soodustada ECSITi ubikvitineerimist; nagu oodatud, inhibeeris calpain2a-ΔCysPc protsessi, mille käigus TRAF6 edastas ubikvitiini ahela ECSIT-ile. BECN1 on LPS-i indutseeritud autofagia oluline valk. On kinnitatud, et K63 ubikvitineerimine võib muuta ja aktiveerida BECN1. Deubikvitineeriv ensüüm A20 eemaldab BECN1 ubikvitineerimise ja inhibeerib LPS-i põhjustatud autofagiat ning TRAF6 on E3 ligaas, mis vastutab selles signaalis BECN1 ubikvitineerimise eest47. Nagu on näidatud joonisel 7e, suhtles TRAF6 BECN1-ga ja soodustas BECN1 ubikvitineerimist. Seejärel transfekteerisime BECN1, TRAF6, calpain2a ja calpain2a-ΔCysPc HEK293 rakkudesse, TRAF6 soodustas BECN1 ubikvitineerimist. calpain2a-ΔCysPc inhibeeris protsessi, mille käigus TRAF6 edastas ubikvitiini ahela BECN1-le (joonis 7f). Need tulemused viitavad sellele, et metsiktüüpi calpain2a ja mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, inhibeerivad TRAF6 ubikvitinatsioonivõimet LPS-i indutseeritud autofagia ja NF-KB signaaliülekande korral.

Viirusevastase vastuse negatiivne regulatsioon calpain2a poolt.

RLR rajal toimib TRAF6 E3 ligaasina, mille MAVS värvab, et aktiveerida NF-κB, IFN-ide ja tsütokiinide tootmist. Järgmisena uurisime, kas calpain2a mängis rolli TRAF6 ennetamisel IFN-vahendatud viirusevastases protsessis. EPC rakkudes ekspresseeriti IFN-1, ISRE ja IRF3 promootori poolt juhitud lutsiferaasi reporterid. Leidsime, et calpain2a vähendas oluliselt neid promootori poolt juhitud lutsiferaasi aktiivsusi annusest sõltuval viisil Ploy (I: C) stimuleerimisel ja Siniperca petab rabdoviiruse (SCRV) infektsiooni (joonis 8a, b). Calpain2a hävitamine suurendas oluliselt Ploy (I: C) ja SCRV-ga vallandatud geeniekspressiooni, sealhulgas Viperin, Mx1 ja ISG15 (joonis 8c, d). Calpain2a pärssimine põhjustas rakkude elujõulisuse kõrgema ekspressiooni SCRV infektsiooni korral MKC rakkudes (joonis 8e). Nagu on näidatud joonisel 8f, näitasid rakkude proliferatsiooni testid, et calpain2a pärssimine suurendas rakkude proliferatsiooni SCRV infektsiooni korral. Calpain2a üleekspressioon soodustas järsult viiruse paljunemist, mida peegeldab viiruse replikatsioon pärast SCRV-nakkust (joonis 8g). calpain2a ja calpain2a-ΔCysPc vähendasid oluliselt IFN-1, ISRE ja IRF3 promootori juhitud lutsiferaasi reportereid Ploy(I:C) stimulatsiooni ja SCRV infektsiooni korral (täiendav joonis 2a, b). Need tulemused viitavad sellele, et calpain2a võib TRAF6 inhibeerimise kaudu negatiivselt reguleerida RLR signaaliülekande rada, inhibeerides seeläbi IFN aktiveerimist.

Joonis fig 5 calpain2a inhibeerib TRAF6 ubikvitiini ligaasi aktiivsust. endogeense TRAF6 ubikvitineerimine MKC rakkudes, mis on transdutseeritud calpain2a-Flag ja calpain2a-ΔCysPc-Flagiga ja nakatamatud (-) või nakatatud LPS-ga (+), mida hinnati immunoblotanalüüsiga anti-ubikvitiiniga pärast immunosadestamist anti-TRAF6 analüüsiga ja sisestamist. näidatud Abs. b, c HEK293 rakud kotransfekteeriti TRAF6-HA ja WT-ubikvitiin-His või K63O ubikvitiin-His-ga (milles hoitakse ainult lüsiini 63) koos calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. d, e HEK293 rakke kotransfekteeriti TRAF{{30}}HA ja WT-ubikvitiini-His või K63O-ubikvitiini-His-ga (milles hoitakse ainult lüsiini 63) koos calpain2a-Flagiga ({{45 }},5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) või tühi vektor. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. f Üleekspresseeritud TRAF6 ubikvitineerimine MKC rakkudes, mis on transdutseeritud calpain2a-ΔCysPc-Flagiga, hinnati immunoblotanalüüsiga anti-ubikvitiiniga pärast immunosadestamist anti-Myc-ga ja sisend-immunoblotanalüüsi näidatud Abs-ga. g, h HEK293 rakud kotransfekteeriti TAK1-Myc, TRAF6-HA ja WT-ubikvitiini-His või K63O-ubikvitiini-His-ga (milles hoitakse ainult lüsiini 63) koos calpain2a-Flagiga , calpain2a-ΔCysPc-lipp või tühi vektor. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. Kõik immunosademed ja sisestatud immunoblotanalüüs koos anti-Myc, anti-Flag, anti-HA ja anti-Tubulin Abs. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses.

calpain2a pärsib IRF3 ja IRF7 ubikvitineerimist TRAF6-st.

On teatatud, et MAVS-TRAF3/6 kompleksi poolt käivitatud viirusevastases signaalis on TRAF6 aktiivsus vajalik IRF3 ja NF-κB48 aktiveerimiseks. Nagu on näidatud joonistel 9a, 9b, soodustab TRAF6 WT- ja K63--seotud IRF3 ubikvitineerimist ning seda võimendust pärsib calpain2a-ΔCysPc ekspressioon. Samal ajal, kui viirus käivitab TLR-sõltuva signaalisignaali, on TRAF6 tihedalt seotud IRF7-ga ja soodustab IRF7 ubikvitineerimist koos aktiveeritud viirusevastaste teguritega 22, 49, 50. TRAF6 soodustab IRF7 WT ja K{21}}seotud ubikvitineerimist ning seda võimendust pärsib calpain2a-ΔCysPc ekspressioon (joonis 9c, d). Need andmed viitavad sellele, et metsiktüüpi kalpain2a ja mutantne kalpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, pärsivad IRF3 ja IRF7 TRAF{29}}vahendatud ubikvitineerimist.

Arutelu

TRAF6 on üks seitsmest kasvaja nekroosifaktori (TNF) retseptoriga seotud tegurite (TRAF) perekonna liikmest, mis on identifitseeritud kui signaaliadapter ja mis avaldab signaaliülekannet51,52. TRAF perekond sisaldab sõrmusesõrme domeeni, mis omab E3 ligaasi aktiivsust. HECT-domeeniga E3 ligaasid soodustavad substraadi polüubikvitinatsiooni ja Ring-domeeniga E3-d nõuavad polüubikvitinatsiooni edastamiseks E2~ub53,54. On kinnitatud, et dimeer Ub-siduv ensüüm Ubc13 / Uev1A osaleb TRAF6 polüubikvitinatsiooni agregatsioonis16. Kui hiire TRAF6 K124 on välja lülitatud, kaotab TRAF6 K63 auto-ubikvitinatsiooni aktiivsuse ja selle koha mutatsioon kõrvaldab TRAF6-vahendatud NEMO ubikvitinatsiooni ning TAK1, IKK ja NF-κB55 aktiveerimise. . See on täpne, kuna PRDX1 seondub K124-s sisalduva TRAF6 ringsõrme domeeniga ja välistab TRAF638 ubikvitineerimise. On teatatud, et TRAF6 ubikvitinatsioon on tihedalt seotud selle N-terminaalse domeeni (sõrmuse sõrme ja ZF sõrmede domeen) dimeriseerumisega. Mitu Ubc13-ga N-terminaalset interaktsiooni saiti muteeriti ja Ubc13 ei saanud polü~ub-i TRAF616-le edastada. Calpain2a ja TRAF6 mutantide vaheline interaktsioon näitas, et enamik TRAF6 domeene interakteeris calpain2a-ga, välja arvatud sõrmusesõrme domeen. Calpain2a ja TRAF6 ZF-sõrmede domeeni vahelise koostoime tõttu oletasime, et calpain2a võib pärssida auto-ubikvitinatsiooni, blokeerides TRAF6 dimerisatsiooni. Seejärel kontrollisime TRAF6 erinevate siltide koostoimet. Kuna hüdrolaasi aktiivsuseta mutantse calpain2a ekspressioon suurenes, nõrgenes TRAF6 erinevate märgiste interaktsioon. HA-märgistatud TRAF6 soodustab Myc-märgistatud TRAF6 ubikvitineerimist ja mutantne calpain2a inhibeerib ubikvitineerimist, mida suurendab HA-märgistatud TRAF6. TRAF6-TAK1 signaali edastusprotsessi vaheühendina seostub ECSIT TRAF6 C-terminaalse domeeniga (CC domeen ja TRAF-C domeen) ning on kinnitatud, et osaleb NF-κB signaaliülekandes37. Põletikuvastaste tsütokiinide ekspressioon vähenes ECSITKD THP-1 rakkudes. Kuid pärast ECSIT-i üleekspressiooni ECSITKD THP-1 rakkudes suurenesid sellised geenid nagu IRF7, IL-1 ja CD44 märkimisväärselt37. PRDX1 seondub TRAF6 sõrmusesõrme domeeniga ja pärsib ECSIT ja BECN1 ubikvitineerimist NF-KB ja autofagia signaalides, inhibeerides TRAF6 polüubikvitinatsiooni moodustumist38. Teleost-kalades kinnitasime ECSIT-i aktiveeritud NF-κB signaaliraja, suhtlesime vastavalt TRAF6 ja TAK1-ga ning edastasime TRAF6 toodetud polüubikvitiini ahela. calpain2a seostus TRAF6 ZF domeeni, CC domeeni ja TRAF-C domeeniga, mis pärssis TRAF6-ECSITi interaktsiooni. Kinnitasime, et mutantne calpain2a, millel puudus hüdrolaasi aktiivsus, takistas polüubikvitiini ahelat TRAF6-st ECSIT-i ja BECN1-ni.

Joonis fig 6 calpain2a nõrgendab TRAF6 autoubikvitinatsiooni. HEK293 rakud transfekteeriti TRAF6-Myc, TRAF6-HA või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti HA antikehaga. b HEK293 rakud transfekteeriti TRAF6-Myc, TRAF6-HA, tühja vektori või calpain2a-Flagiga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti HA antikehaga. c HEK293 rakud transfekteeriti TRAF6-Myc, TRAF6-HA, tühja vektoriga või erinevate kontsentratsioonidega calpain2a-ΔCysPc-Flag. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti HA antikehaga. d, e HEK293 rakud kotransfekteeriti TRAF6-Myc, TRAF6-HA ja WT-ubikvitiini-His või K63O-ubikvitiini-His-ga (milles hoitakse ainult lüsiini 63) koos calpain2a-Flagiga , calpain2a-ΔCysPc-lipp või tühi vektor. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. Immunosadestab ja sisestab immunoblotanalüüsi anti-Myc, anti-Flag, anti-HA ja anti-Tubulin Abs abil. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses.

Joonis 7 calpain2a inhibeerib ECSITi ja BECN1 TRAF6-vahendatud ubikvitineerimist. HEK293 rakud transfekteeriti ECSIT-Myc, TRAF6-Flagi või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti Flag antikehaga. b HEK293 rakud transfekteeriti TAK{10}}lipu, ECSIT-Myc või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti Myc antikehaga. c HEK293 rakud transfekteeriti TRAF6-Myc, ECSIT-HA, tühja vektoriga või erinevate kontsentratsioonidega calpain2a-ΔCysPc-Flag. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti Myc antikehaga. d HEK293 rakud kotransfekteeriti ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubikvitiini-His-iga koos calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. HEK293 rakud transfekteeriti BECN1-Flag, TRAF6-Myc või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja IP analüüsiti Myc antikehaga. f HEK293 rakud kotransfekteeriti BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubikvitiini-His-iga koos calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag või tühja vektoriga. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. Immunosadestab ja sisestab anti-Myc, anti-Flag, anti-HA ja anti-Tubulin Abs. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses.

Märkame, et calpain2a hüdrolaasi aktiivsus on üks kaltsiumist sõltuva proteaasi perekonda. m-kalpaiin (calpain-2) mängib HepG2 maksarakkude NF-κB signaaliülekande rajal positiivset reguleerivat rolli. Sõltumata 26-sekundilise proteasoomi lähenemisviisist hüdrolüüsib calpain2a IkB, et vabastada transkriptsioonifaktor NF-κB. Kalpaiini valgu spetsiifiline inhibiitor takistab IkB 56 lagunemist. Kalpaiini puhul on aga vähe uuringuid kalade kaasasündinud immuunvastuse kohta. MKC rakkudes inhibeeris calpain2a üleekspressioon LPS-i poolt indutseeritud NF-κB allavoolu proinflammatoorseid tsütokiine. See nähtus oli vastuolus HepG2 maksarakkude tulemustega. Võib juhtuda, et kalpaiini valgu perekonna liigispetsiifilisus põhjustas erinevaid mõjusid. Samamoodi kasutasime kalpaiini valgu E-64 spetsiifilist inhibiitorit, et takistada calpain2a TRAF6 hüdrolüüsimist. Mutantne calpain2a, millel puudub hüdrolaasi aktiivsus, inhibeerib TRAF6 ubikvitiini ligaasi aktiivsust, mõjutamata selle valgu taset. Me ei leidnud calpain2a jaoks ensüümiaktiivseid saite. Varasemate imetajatega tehtud uuringute kohaselt on kolm kohta: tsüsteiin (C105A), histidiin (H262A) ja asparagiinijäägid (N286A). Kuid meie katsed kinnitavad, et miiuy croaker calpain2a kolm aktiivset kohta ei mõjuta TRAF6 valgu tasemete ekspressiooni, kuid mutantse calpain2a, millel puudub hüdrolaasi domeen, ekspressioon. Seetõttu otsustasime muteerida kogu ensüümi aktiveeriva struktuuridomeeni. Kuigi valk calpain2a on imetajatel ja madalamatel selgroogsetel suhteliselt konserveerunud, väärivad spetsiifilised ensümaatilised aktiivsuskohad edasist uurimist.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Kokkuvõttes tuvastasime calpain2a LPS-indutseeritud NF-KB signaaliülekande ja viiruse poolt indutseeritud IFN-i aktiveerimise negatiivse regulaatorina (joonis 9e). Massispektromeetrias võib calpain2a interakteeruda TRAF6-ga ja me näitasime seda nähtust endogeense koimmunosadestamise katsega. Leidsime, et calpain2a osaleb LPS-indutseeritud NF-KB signaaliraja reguleerimises. Lisaks mängib TRAF6 olulist rolli ka viirusevastastes signaaliradades. IFN signaaliraja stimuleerimiseks kasutasime SCRV ja Ploy (I: C) ja leidsime, et calpain2a võib samuti pärssida IFN signaaliülekannet, reguleerides valgu taset ja TRAF6 autoubikvitineerimist. Kuna TLR3 suudab ära tunda viirusinfektsioonide tekitatud kaheahelalise RNA (dsRNA) struktuuri. Oleme rohkem huvitatud TRAF6-vahendatud IFN-i signaaliraja calpain2a regulatsiooni selgitamisest, kuid ei välista potentsiaalset seost calpain2a ja TLR3 signaaliraja vahel. calpain2a soodustas TRAF6 lagunemist hüdrolüütilisel viisil ja suhtles TRAF6-ga, et pärssida dimeeride moodustumist ja auto-ubikvitinatsiooni. See inhibeerimine takistas TRAF6 ja ECSITi interaktsiooni ning ubikvitinatsiooni ülekandeprotsessi TRAF6-lt ECSIT-i, BECN1, IRF3 ja IRF7-sse. Meie praegused tulemused aitavad kaasa negatiivsete reguleerimismehhanismide mõistmisele, suunates TRAF6 kaasasündinud immuunvastustes. Lisaks näitab see uuring TRAF6 homooligomerisatsiooni ja auto-ubikvitinatsiooni võtmerolli kalade kaasasündinud immuunvastuse protsessis. Samaaegselt pakutakse calpain2a-d regulatiivse mehhanismi valguna, et inhibeerida TRAF6 immuunvastust ja takistada normaalseid ja korrapäraseid signaaliradu. Teadmised aitavad mõista selgroogsete immunoloogiat ja selgroogsete immuunsüsteemi arengut.

Joonis fig 8 calpain2a inhibeerib SCRV- või polü(I:C)-indutseeritud IFN-i aktivatsiooni. ab EPC rakud transfekteeriti erineva kontsentratsiooniga calpain2a-Flag või tühja vektoriga koos IFN-1, ISRE ja IRF3-pro lutsiferaasi reporteritega. 24 tundi pärast transfektsiooni rakud nakatati või nakatati SCRV või Poly(I:C)-ga 12 tundi (n=3 rühma kohta). Transientselt transfekteeritud calpain2a-Flag ekspressiooni mõõtmiseks kasutati Western blot analüüsi. Laadimiskontrollina kasutati Tubuliini ekspressiooni. c, d Viperiini, Mx1, ISG15 mRNA MKC-s, mis on stabiilselt transdutseeritud si-calpain2a #1 või si-ctrl-ga (kontrollvektor) ja töödeldud soolalahusega (0) või nakatatud SCRV või Poly(I:C)-ga. 24 h. Suhteline mRNA tase normaliseeriti igas proovis -aktiini kodeeriva geeni ekspressiooniga (n=3 rühma kohta). e, f MKC rakud transfekteeriti kas si-ctrl või si-calpain2a #1-ga. 24 tundi pärast transfektsiooni stimuleeriti rakke SCRV-ga 24 tundi, seejärel mõõdeti rakkude elujõulisuse testi ja rakkude proliferatsiooni testi (n=3 rühma kohta). Skaalariba, 100 μm. g MKC rakke transfekteeriti calpain2a-Flag või pcDNA3.1-ga, seejärel nakatati SCRV-ga 24 tundi (n=3 rühma kohta). QRT-PCR analüüs viidi läbi rakusisese ja supernatandi SCRV RNA ekspressiooni jaoks. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses. Andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA (a, b), kahesuunalise ANOVA (c, d, e, f) või kahepoolse Studenti t-testi (g) abil. *p < 0,05, **p < 0,01.

meetodid

Rakukultuur.

Inimese embrüonaalse neeru (HEK) 293 rakuliinid ja Epithelioma papulosum cyprini (EPC) rakuliinid osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist ja neid hoiti meie laboris. Miiuy croaker (M. miiuy) neerurakuliine (MKC) ja Miiuy croaker intestine rakuliine (MIC) kultiveeriti miiuy croaker57,58 neeru- ja soolekudedest. Miiuy croaker neeru rakuliine ja Miiuy croaker soolestiku rakuliine kultiveeriti 26 kraadi juures niisutatud inkubaatoris, mis sisaldas 0,5% CO2 L-15 söötmes (HyClone, USA), millele oli lisatud 15% FBS-i (Gibco). , USA), 100 U/ml penitsilliini (Gibco, USA), 100 ug/ml streptomütsiini (Gibco, USA) ja 20 U/ml hepariini (Solarbio, Hiina). Epithelioma papulosum cyprini rakke kasvatati 26 kraadi juures niisutatud inkubaatoris, mis sisaldas 5% CO2 söötmes 199 (Hyclone), millele oli lisatud 10% FBS, 2 mM L-glutamiini, 100 U/ml penitsilliini ja 100 mg/ml streptomütsiini. Inimese embrüonaalse neeru 293 rakke kasvatati 37 kraadi juures niisutatud inkubaatoris, mis sisaldas 5% CO2 Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM) (Invitrogen), millele oli lisatud 10% FBS, 2 mM L-glutamiini, 100 U/ml penitsilliini ja 100 mg. /ml streptomütsiini.

Joonis 9 calpain2a inhibeerib IRF7 ja IRF3 TRAF6-vahendatud ubikvitineerimist. b HEK293 rakud kotransfekteeriti IRF3-Myc, TRAF6-HA ja WTubiquitin-His või K63O-ubikvitiini-His-ga (milles hoitakse ainult lüsiini 63) koos calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-ga -Lipp või tühi vektor. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. c, d HEK293 rakud kotransfekteeriti IRF7-Myc, TRAF6-HA ja WT-ubiquitinHis või K63O-ubikvitiini-His-ga (milles hoitakse ainult lüsiini 63) koos calpain2a-Flagiga, calpain2a -ΔCysPc-lipp või tühi vektor. Pärast 24 tundi pärast transfektsiooni rakud lüüsiti ja puhastati Ni-NTA agaroosiga. Kõik immunosademed ja sisend anti-Myc-, anti-Flag-, anti-HA- ja anti-Tubulin Abs-iga. Kõik katsed viidi läbi vähemalt kolmes sõltumatus katses. e Mudel, mis kirjeldab üksikasjalikult calpain2a rolli TRAF{39}}vahendatud signaaliradades. LPS-i ja viiruse korral võib TRAF6 aktiveerida, homo-oligomeriseerida ja auto-ubikvitineerida. BECN1, ECSIT, IRF7 ja IRF3 on TRAF6 poolt ubikvitineeritud ja käivitavad allavoolu signaalide aktiveerimise. calpain2a kui negatiivne regulaator on suunatud TRAF6-le, et pärssida TRAF{49}}vahendatud signaaliradu.

Viited

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Patogeeni äratundmine ja kaasasündinud immuunsus. Cell, 124, 783–801 (2006).

2. Takeuchi, O. & Akira, S. Mustri äratundmise retseptorid ja põletik. Cell 140, 805–820 (2010).

3. Wu, J. & Chen, ZJ Tsütosoolsete nukleiinhapete kaasasündinud immuunandur ja signaalimine. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-like retseptorid. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).

5. Schlee, M. Patogeense RNA põhiandurid – RIG-I meeldivad retseptorid. Immunobiology, 218, 1322–1335 (2013).

6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR valgud: kaasasündinud immuunsuse lahutamatud liikmed ja põletikuliste haiguste vahendajad. J. Leukoc. Biol. 83, 13–30 (2008).

7. Akira, S. & Hemmi, H. Patogeeniga seotud molekulaarsete mustrite tuvastamine TLR perekonna poolt. Immunol. Lett. 85, 85–95 (2003).

8. Kawai, T. & Akira, S. Mustri tuvastamise retseptorite roll kaasasündinud immuunsuses: Toll-like retseptorite värskendus. Nat. Immunol. 11, 373–384 (2010).

9. Kawagoe, T. et al. Toll-tüüpi retseptorist sõltuvate vastuste järjestikune kontroll IRAK1 ja IRAK2 abil. Nat. Immunol. 9, 684–691 (2008).

10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4– kaasasündinud ja omandatud immuunsuse ühine NF-kappaB aktivaator. Trends Immunol. 27, 566–572 (2006).

11. Kawai, T. & Akira, S. TLR signaalimine. Rakkude surma erinevus. 13, 816–825 (2006).

12. Deng, L. et al. IkappaB kinaasi kompleksi aktiveerimine TRAF6 poolt nõuab dimeerset ubikvitiini konjugeeriva ensüümi kompleksi ja ainulaadset polüubikvitiini ahelat. Cell, 103, 351-361 (2000).

13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. Kinaas TAK1 võib aktiveerida nii NIK-I kappaB kui ka MAP kinaasi kaskaadi IL-1 signaaliülekande rajal. Nature 398, 252–256 (1999).

14. Takaesu, G. et al. TAB2, uudne adaptervalk, vahendab TAK1 MAPKKK aktiveerimist, sidudes TAK1 TRAF6-ga IL-1 signaaliülekande rajal. Mol. Kamber. 5, 649–658 (2000).

15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm-i vahendatud TRAF6 ja TAB2 translokatsioon interleukiini{4}}indutseeritud NF-kappa BJ aktivatsioonis Biol. Chem. 276, 41661–41667 (2001).

16. Yin, Q. et al. E2 interaktsioon ja dimerisatsioon TRAF6 kristallstruktuuris. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).

17. Wang, C. et al. TAK1 on MKK ja IKK ubikvitiinist sõltuv kinaas. Nature 412, 346–351 (2001).

18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF TAK1 rakutüübispetsiifiline funktsioon kaasasündinud immuunsignalisatsioonis. Trends Immunol. 34, 307–316 (2013).

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Ootamatu pööre IKKbeta aktiveerimisel: TAK1 käivitab IKKbeta autofosforüülimise teel aktiveerimiseks. Biochem. J. 461, 531–537 (2014).

20. Emmerich, CH et al. Kanoonilise IKK kompleksi aktiveerimine K63/M1--seotud hübriidubikvitiini ahelatega. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).

21. Kawai, T. et al. Interferoon-alfa induktsioon Toll-sarnaste retseptorite kaudu hõlmab IRF7 otsest interaktsiooni MyD88 ja TRAF6-ga. Nat. Immunol. 5, 1061–1068 (2004).

22. Kitagawa, Y. et al. Inimese 2. tüüpi paragripiviiruse V valk inhibeerib TRAF6-vahendatud IRF7 ubikvitineerimist, et vältida TLR7- ja TLR9- sõltuvat interferooni induktsiooni. J. Virol. 87, 7966–7976 (2013).

23. Kawai, T. et al. IPS-1, adapter, mis käivitab RIG-I- ja Mda5-vahendatud I tüüpi interferooni induktsiooni. Nat. Immunol. 6, 981–988 (2005).

24. Zust, R. et al. Riboosi 2'-O-metüülimine annab molekulaarse signatuuri oma ja mitteise mRNA eristamiseks, mis sõltub RNA andurist Mda5. Nat. Immunol. 12, 137–143 (2011).

25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ MAVS-i, mitokondriaalse viirusevastase signaalvalgu, mis aktiveerib NF kappaB ja IRF, identifitseerimine ja iseloomustus 3. Cell 122, 669–682 (2005).

26. Xu, LG et al. VISA on adaptervalk, mis on vajalik viiruse poolt käivitatud IFN beeta signaaliülekandeks. Mol. Kamber. 19, 727–740 (2005).

27. Yoshida, R. et al. TRAF6 ja MEKK1 mängivad RIG-I-sarnases helikaasi viirusevastases rajas keskset rolli. J. Biol. Chem. 283, 36211–36220 (2008).

28. Liu, S. et al. MAVS värbab mitu ubikvitiini E3 ligaasi, et aktiveerida viirusevastaseid signaaliülekandekaskaade. Elife 2, e00785 (2013).

29. Ivaškiv, LB & Donlin, LT I tüüpi interferooni vastuste reguleerimine. Nat. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. TRAF6 poolt edendatud ubikvitiini ülekande mehhanism. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).

31. Boone, DL et al. Ubikvitiini modifitseeriv ensüüm A20 on vajalik Toll-sarnaste retseptorite vastuste lõpetamiseks. Nat. Immunol. 5, 1052–1060 (2004).

32. Kovalenko, A. jt. Kasvaja supressor CYLD reguleerib negatiivselt NF kappaB signaaliülekannet deubikvitineerimise teel. Nature 424, 801–805 (2003).

33. Ta, X. et al. USP2a reguleerib negatiivselt IL-1beeta- ja viiruse poolt indutseeritud NF kappaB aktivatsiooni, deubikvitineerides TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).

34. Xiao, N. et al. Ubikvitiini-spetsiifiline proteaas 4 (USP4) sihib TRAF2 ja TRAF6 deubikvitineerimiseks ja inhibeerib TNFalpha-indutseeritud vähirakkude migratsiooni. Biochem. J. 441, 979–986 (2012).

35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubikvitiini-spetsiifiline peptidaas 20 on suunatud TRAF6 ja inimese T-rakulise leukeemia viiruse 1. tüüpi maksule, et reguleerida negatiivselt NF-kappaB signaaliülekannet. J. Virol. 85, 6212–6219 (2011).

36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O reguleerib negatiivselt TRAF6-vahendatud NF-kappaB aktivatsiooni, inhibeerides TRAF6 polüubikvitinatsiooni. Cell Res. 23, 366–377 (2013).

37. Wi, SM et al. TAK1-ECSIT-TRAF6 kompleks mängib TLR4 signaalis võtmerolli NF-kappaB aktiveerimisel. J. Biol. Chem. 289, 35205–35214 (2014).

38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY TRAF6 ubikvitiini ligaasi aktiivsuse pärssimine PRDX1 poolt viib NFKB aktivatsiooni ja autofagia aktivatsiooni pärssimiseni. Autofagia 14, 1347–1358 (2018).

39. Jiao, S. et al. Kinaas MST4 piirab põletikulisi reaktsioone adapteri TRAF6 otsese fosforüülimise kaudu. Nat. Immunol. 16, 246–257 (2015).

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 ja Calpain-2: Sünaptilise plastilisuse ja neurodegeneratsiooni yin ja yang. Trends Neurosci. 39, 235–245 (2016).

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Rakkude migratsiooni reguleerimine: kalpaiinid teevad lõike. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).

42. Katsube, M. et al. Inimese neutrofiilide erinevate signaaliradade ja rakkude migratsiooni kalpaiini vahendatud reguleerimine. J. Leukoc. Biol. 84, 255–263 (2008).

43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Kalpaiini inhibeerimise mõju IkB alfa lagunemisele pärast PBMC-de aktiveerimist: kalpaiini lõhustumiskohtade tuvastamine. Neurochem. Res. 29, 1443–1451 (2004).

44. Tompa, P. et al. Kalpaiini lõhustumise järjestikuste determinantide kohta. J. Biol. Chem. 279, 20775–20785 (2004).

45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Peptiidsubstraadi spetsiifilisuse määramine mu-kalpaiini jaoks peptiidiraamatukogupõhise lähenemisviisi abil: praimitud külginteraktsioonide tähtsus. J. Biol. Chem. 280, 40632–40641 (2005).

46. ​​DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain lõhustamise ennustamine kasutades mitme tuuma õppimist. PLoS One. 6, e19035 (2011).

47. Shi, CS ja Kehrl, JH TRAF6 ja A20 reguleerivad lüsiiniga 63-seotud Beclini-1 ubikvitinatsiooni, et kontrollida TLR4-indutseeritud autofagiat. Sci. Signaal. 3, ra42 (2010).

48. Loo, YM & Gale, M. Immune Signaling by RIG-I-like Receptors. Immunity 34, 680–692 (2011).

49. Ling, T. et al. TARBP2 pärsib IRF7 aktivatsiooni, pärssides IRF7 TRAF6-vahendatud K63--seotud ubikvitinatsiooni. Mol. Immunol. 109, 116–125 (2019).

50. Zhou, Z. et al. Sebrakala otud6b reguleerib negatiivselt viirusevastaseid vastuseid, pärssides irf3 ja irf7 K63--seotud ubikvitinatsiooni. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. TRAF6 roll signaaliülekandes ja immuunvastuses. Mikroobid nakatavad. 6, 1333–1338 (2004).

52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, molekulaarne sild, mis hõlmab adaptiivset immuunsust, kaasasündinud immuunsust ja osteoimmunoloogiat. Bioesseys 25, 1096–1105 (2003).

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: struktuurid, funktsioonid, mehhanismid. Biochim. Biophys. Acta. 1695, 55–72 (2004).

54. Pickart, CM & Fushman, D. Polüubikvitiini ahelad: polümeersed valgu signaalid. Curr. Arvamus. Chem. Biol. 8, 610–616 (2004).

55. Lamothe, B. et al. Kohtspetsiifiline Lys{2}}seotud tuumori nekroosifaktori retseptoriga seotud faktor 6 auto-ubikvitinatsioon on I kappa B kinaasi aktivatsiooni kriitiline määraja. J. Biol. Chem. 282, 4102–4112 (2007).

56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tuumori nekroosifaktor-alfa-indutseeritav IkappaBalpha proteolüüs, mida vahendab tsütosoolne m-kalpain. Ubikvitiini-proteasoomi rajaga paralleelne mehhanism tuumafaktori-kappa B aktiveerimiseks. J. Biol. Chem. 274, 787–794 (1999).

57. Chu, Q. et al. Väga konserveerunud tsirkulaarne RNA circRasGEF1B suurendab viirusevastast immuunsust, reguleerides miR-21-3p/MITA rada madalamatel selgroogsetel. J. Virol. 95, e02145–20 (2021).

58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a indutseerib autofagiat, et blokeerida NF-kappaB signaaliülekannet ja apoptoosi, et hõlbustada Vibrio harveyi infektsiooni. iScience, 26, 106105 (2023).

59. Sepulcre, MP et al. Lipopolüsahhariidide (LPS) äratundmise ja signaalimise areng: kala TLR4 ei tunne LPS-i ära ja reguleerib negatiivselt NF kappaB aktiveerimist. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).

60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Pikk mittekodeeriv RNA NARL reguleerib immuunvastuseid mikroRNA-vahendatud NOD1 allareguleerimise kaudu teleostkalades. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Ekson-Introni tsirkulaarne RNA tsirkRNF217 soodustab kaasasündinud immuunsust ja antibakteriaalset aktiivsust Teleost kaladel, vähendades miR-130-3p Funktsioon. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).

62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdoviirusega indutseeritav mikroRNA-210 moduleerib viirusevastast kaasasündinud immuunvastust kaladel STING/MITA sihtimisega. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).

63. Bi, D. et al. Lipopolüsahhariidi äratundmine ja NF-kappaB aktiveerimine tsütosoolsensori NOD1 abil Teleost Fishis. Esiosa. Immunol. 9, 1413 (2018).

64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 ja IRF8 reguleerivad NF-kappaB signaalimist MyD88 sihtimisega Teleost Fishis. Esiosa. Immunol. 11, 606 (2020).

65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k pärsib NF-kappaB signaaliülekannet, sihtides MyD88 ATG5-vahendatud autofagilise lagunemise jaoks teleostkalades. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).