AbstraktneKuigi vananemine on inimese krooniliste (vähk, diabeet, südame-veresoonkonna ja neurodegeneratiivsed) haiguste suurim riskitegur, on peale kaloripiirangu ja vähese hulga ravimite (oluliste kõrvalmõjudega) teada vähe sekkumisi, mis vananemist otseselt vähendavad. Seega on hädasti vaja uusi võimalusi, millega saaks üldiselt vananemisprotsesse edasi lükata ja ennetada vanusega seotud haigusi. Rakkude vananemine on vananemisprotsesside aluseks. Pärmi Saccharomyces cerevisiae kronoloogiline eluiga (CLS) on väljakujunenud mudelsüsteem inimese postmitootilise raku vananemise sekkumiste uurimiseks. CLS on defineeritud kui päevade arv, mille jooksul rakud püsivad statsionaarses faasis elujõulisena. Töötasime välja uue, odava ja kiire kvantitatiivse meetodi CLS-i mõõtmiseks rakukultuurides, mida inkubeeriti koos erinevate keemiliste ainete ja kontrollidega 96-süvendiplaatidel. Meie PICLS-protokoll, mis sisaldab (1) propiidiumjodiidi kasutamist fluorestsentsil põhinevate rakkude ellujäämise lugemiseks mikroplaadi lugejas ja (2) rakkude koguarvu mõõtmist OD600nm neeldumise kaudu samalt plaadilt, tagab tõelise suure läbilaskevõime. Olenevalt logistikast saab paralleelselt töödelda suurt hulka plaate, nii et tuhandete ühendite sõelumine muutub lühikese ajaga teostatavaks. Meetod valideeriti rapamütsiini ja kaloripiirangu mõju mõõtmisega pärmi CLS-ile. Kasutasime seda lähenemisviisi keemiliste ainete sõelumiseks. Avastasime 2,5-anhüdro-D-mannitooli (2,5-AM) vananemisvastase/neuroprotektiivse potentsiaali ja soovitame seda kasutada eraldi või koos teiste vananemisvastaste sekkumistega.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja see suudab eemaldada reaktiivseid hapniku liike ja takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist, samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake vananemisvastaste toodete vaatamiseks

【Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

MärksõnadSaccharomyces cerevisiae · Kronoloogiline eluiga · Keemiline sõelumine · Vananemisvastane ühend · 2,5-anhüdro-D-mannitool

Sissejuhatus

The growing fraction of the elderly (>65 aastat) kogu elanikkonna hulgas (~ 10 protsendilt maailmas (üle 20 protsendi esimese maailma riikides) 2020. aastal ekstrapoleeritud 16 protsendini 2050. aastal), samuti nende oodatava eluea pikenemist (esimese maailma riikides ~ 10 aasta võrra alates 1960. aastast ), seisab maailm silmitsi üha raskemate probleemidega [1, 2]. Lisaks üldisele elutegevuse vähenemisele on vananemine endiselt suurim riskitegur krooniliste haiguste tekkeks, mis seejärel ohustavad iseseisvat inimelu ja viivad lõpuks surmani [3–7]. Praegused meditsiinilised lähenemisviisid vanusega seotud patoloogiate ennetamiseks on soovitused tervislikuks eluviisiks, sealhulgas treeninguks ja dieediks. Kuid need sekkumised üksi ei ole piisavad, et vältida vanusega seotud haiguste teket.

Vananemist iseloomustab füsioloogilise terviklikkuse, raku funktsioonide tõhususe ja metaboolse signaalimise järkjärguline kadu [8]. Üha enam püütakse mõista rakkude vananemisprotsesse, mis mõjutavad omavahel tihedalt seotud ja funktsionaalselt üleliigset geenide ja valkude interaktsioonide võrgustikku [8, 9]. Vaatamata vananemise keerukusele on hiljutised uuringud erinevates mudelisüsteemides, sealhulgas imetajates, näidanud, et vananemise edasilükkamine ja tervisliku seisundi paranemine on teostatavad vananemisvastaste sekkumiste, nagu rapamütsiini manustamise ja kalorite (glükoosi) piiramise abil [10–15]. Seetõttu on vananemisvastaste ühendite repertuaari laiendamine, mida saab kasutada geroprotektiivsete ravimitena, ja nende soovimatute kõrvalmõjude vähendamine üks paljutõotav strateegia, mis võib vananemist edasi lükata ja tervist pikendada.

Hiljutised uuringud on näidanud, et inimese vananemisel täheldatud molekulaarsed mehhanismid on säilinud erinevates organismides, sealhulgas üherakulises pärmis [8, 10, 16, 17]. Tekkiv pärm Saccharomyces cerevisiae on üks enim uuritud mudelorganisme rakkude vananemisega seotud bioloogiliste protsesside avastamiseks. Pärmi vananemise uurimise eelised hõlmavad lühikest genereerimisaega, jälgitavat eluiga ja selle võimet teha suure läbilaskevõimega teste. Seetõttu sai sellest organismist võimas vahend vananemisvastaste sekkumiste tuvastamiseks. Pärmi kasutatakse tavaliselt vananemise uurimiseks kahel erineval viisil: replikatiivne eluiga (RLS) ja kronoloogiline eluiga (CLS) [18]. RLS mõõdab üksikute rakkude jagunemiste arvu, mis on mitootiliste rakkude, näiteks tüvirakkude vananemismudel. CLS mõõdab aega, mille jooksul mittejagunev rakk püsib statsionaarses faasis elujõulisena, mis on postmitootiliste rakkude, näiteks neuronite vananemismudel. Vananevate pärmirakkude elujõulisus toitainetest ilma jäänud statsionaarse faasi tingimustes väheneb ja lõpuks nad surevad.

CLS-i on traditsiooniliselt mõõdetud kolooniaid moodustavate ühikute (CFU) arvu hindamisega agariplaadil [18]. Kogu söötmega (suurem kui 20 ml või sellega võrdne) kolvis olevad pärmirakud eksponeeritakse ühe keemilise ühendiga. Erinevatel ajahetkedel (nt 2, 5 ja 8 päeva pärast) lahjendatakse faski kronoloogilise vananemiskultuuri väikesed alikvoodid järjestikku, plaaditakse toitaineagariplaatidele ja inkubeeritakse 2–3 päeva kolooniate moodustamiseks ja loendamiseks. Elulemusfraktsioon määratakse iga kronoloogilise vanusepunkti CFU-st 1. päeva suhtes (arvestatakse 100-protsendiliseks rakkude ellujäämiseks). CFU-lähenemine on kvantitatiivne, kuid seotud paljude negatiivsete külgedega. Kolooniate ilmumiseks on vaja mitut seerialahjendust, plaadistamise etappe ja inkubatsiooniperioode. Kolooniate loendamine toimub kas käsitsi või kallite instrumentidega. Pealegi on see meetod sobimatu ja liiga kallis tuhandete ühendite suure läbilaskevõimega sõelumiseks (HTS), kuna see nõuab märkimisväärses koguses testitud ravimeid, suuremahulisi kolvikultuure ja paljusid agariplaate. Kahjuks sõltuvad CFU-meetod ja kõik hiljutised CLS-i mõõtmise variandid kriitiliselt postmitootiliste rakkude võimest uuesti mitootilisse faasi siseneda. Põhimõtteliselt ei suuda see metoodika eristada mitootilise seiskumise pärmi surnud rakkudest.

CFU-st tuletatud meetodite praegused tehnilised edusammud mõõdavad rakkude ellujäämist ja kasvu, mis põhinevad ravimiga kokku puutunud statsionaarse faasi pärmi väljakasvul toitaineterikkas kultuuris kas vedelas söötmes või agarplaadil täppimistestiga [17, 19–21] . 24 tunni pärast mõõdetakse vananenud rakkude väljakasvamist vedelas söötmes neeldumise järgi OD600 nm juures, samas kui määrimistestis tuvastatakse täpilise vananenud kultuuri väljakasv agarsöötmele visuaalselt 48 tunni pärast. Logistiline täiustus hõlmab 96-süvendplaatide kasutamist, mis võimaldavad piiratud keemilist või genoomi hõlmavat deletsioonitüve skriinimist. Ühendatud märgistatud pärmi deletsioonitüvede puhul on individuaalse tüve elujõulisuse kvantifitseerimiseks vajalik voolutsütomeetria [22].

Propidiumjodiid (PI) on fluorestseeruv värvaine, mis siseneb ainult surnud rakkudesse ja on seega võimas marker rakkude elujõulisuse otseseks kvantifitseerimiseks [23–25]. Varem kasutati uuringutes PI-põhist lähenemisviisi CLS-i mõõtmiseks ja rakkude elujõulisuse kvantifitseerimiseks, analüüsides fluorestsentsrakkude loenduri, UV-transilluminaatori või voolutsütomeetria abil saadud pilte [26, 27]. Andmeanalüüsi mitme proovi töötlemise, pildistamise ja tarkvara nõuded on aga kallid ja aeganõudvad, mis takistas nende meetodite kasutamist tõelistes suure läbilaskevõimega rakendustes. Alternatiivsete värvainete, nagu SYTOX roheline, kasutuselevõtt on suure läbilaskevõimega keskkonnas liiga kõrgete kulude tõttu piiratud väärtusega [26].

Seetõttu on vananenud raku elujõulisuse kvantifitseerimiseks vaja uusi meetodeid, et vältida olemasolevate metoodikatega seotud piiranguid. Selles töös kirjeldame PICLS-i, PI-põhist CLS-i mõõtmismeetodit, mis on väljakasvust sõltumatu. Meie uus lähenemisviis tugineb pärmirakkude inkubeerimisele erinevate testitavate ühendite või erinevate katsesöötmetingimustega 96-süvendiplaatidel. Rakkude ellujäämise kvantifitseerimiseks kasutame PI-d. Kiire ja tõhusa lugemise (~15 minuti jooksul) tagab mikroplaadilugeja, odav seade, mis on enamikus laborites hõlpsasti saadaval. See odav metoodika sobib hästi keemiliste ainete laiaulatuslikuks sõelumiseks vananemisvastaste ühendite tuvastamiseks, kuna ühele plaadile saab mugavalt paigutada palju erinevaid ühendeid, kontrolle või lahjendusi ja paralleelselt töödelda suurt hulka plaate. Lisaks valideerisime oma meetodi, määrates pärmi CLS-i laienemise, kasutades teadaolevaid vananemisvastaseid sekkumisi, nagu rapamütsiini manustamine ja kalorite piiramine. Meie laboris saadaolevate kemikaalide kiirsõel näitas ootamatult 2,5-anhüdro-D-mannitooli (2,5-AM), mis pikendab pärmi eluiga. Kinnitasime ka 2,5-AM vananemisvastast toimet traditsiooniliste väljakasvamismeetoditega. Teised testitud suhkruanaloogid ei andnud sarnast efekti.

Tulemused

Rakkude elujõulisuse kvantifitseerimise meetodi väljatöötamine propiidiumjodiidi fluorestsentsi mõõtmise abil mikroplaadilugejas

Meie uus protokoll algab metsiktüüpi pärmirakkude või nende mutantide eksponeerimisega, mis on paigutatud 96-süvendi plaatide toitainerikkasse söötmesse koos huvipakkuvate keemiliste ühendite konkreetse kontsentratsiooniga. Me kasutame rakusurma markerina PI-d, kuna see fluorestsentsvärv siseneb ainult mitteellujäävatesse rakkudesse [23–25]. Rakkude elujõulisus statsionaarses faasis kultuuris kvantifitseeritakse pärast kindlaksmääratud päevade arvu, lugedes PI fluorestsentsi mikroplaadi lugejas, mis omakorda annab andmete analüüsiks elektrooniliselt loetava arvutustabeli.

Esimese valideerimisena näitame, et mikroplaadi süvendites väikeste kogustega töötamine annab tulemusi, mis on sarnased küvetipõhiste lähenemisviisidega ja et mikroplaadi lugeja on piisavalt tundlik rakkude ellujäämisandmete kogumiseks. Seega analüüsisime pärmirakkude PI värvimist. Pärmirakke kasvatati klaaskolvis ja keedeti 15 minutit 100 kraadi juures. Elusad ja surnud rakud pesti ja inkubeeriti 15 minutit 1 × PBS-s (fosfaatpuhverdatud soolalahus) ilma PIta ja koos PI-ga (5 µg/ml). Pärast inkubeerimist rakud pesti ja resuspendeeriti PBS-is. Rakud visualiseeriti mikroskoopia abil ja fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti mikroplaadilugejaga (täiendav joonis S1). Pärast kinnitust, et PI on rakusurma sobiv marker, viidi meetodi väljatöötamiseks läbi järgnev analüüs. PI-ga värvitud surnud rakud resuspendeeriti PBS-is kuni lõpliku 48 OD600 nm-ni, mõõdetuna küvetis, kasutades spektrofotomeetrit. Järgmisena lahjendati rakud järjestikku PBS-is (OD600nm 48 kuni 0,05) ja kanti üle mustale 96-süvendiga plaadile (costar 3603). Pange tähele, et mustad mikroplaadid on neli korda kallimad kui läbipaistvad plaadid ja vähem kergesti kättesaadavad, kuid me kasutasime neid, kuna need sobivad paremini fluorestsentsi näidu jaoks proovidest ja mikroplaadi pindadest tuleneva autofluorestsentsi summutamise tõttu. GelDoc pildisüsteemiga (joonis 1A) visualiseerisime PI värvumise astet surnud pärmirakkudes erinevates lahjendustes. Sama plaati kasutades mõõtsime mikroplaadilugejaga PI fluorestsentsi intensiivsust ergastuse 535 nm ja emissiooni 617 nm lainepikkustel. Leidsime kõrge lineaarse korrelatsiooni PI fluorestsentsi intensiivsuse ja raku neeldumise vahel OD600nm juures (joonis 1B). See tulemus näitab, et meie PI fluorestsentsil põhineva meetodi variant on efektiivne rakkude elujõulisuse kvantifitseerimiseks.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 (joonis 1D). Järgmisena määrasime kindlaks seose PI fluorestsentsi intensiivsuse ja raku OD600nm 96-süvendi plaadi optimaalses OD600nm vahemikus 0,05–12. Me täheldame peaaegu täiuslikku lineaarset korrelatsiooni (joonis 1E). Seega on meie protokoll kindel meetod rakkude elujõulisuse kvantifitseerimiseks.

Mikroplaaditüüpide mõju rakkude elujõulisuse kvantifitseerimisele, kasutades propiidiumjodiidi fluorestsentsi mõõtmist mikroplaadilugejas

Rapamütsiini mõju pärmi kronoloogilisele elueale

Rapamütsiin on üks tuntud vananemisvastastest sekkumistest, mis pikendab mitmete mudelorganismide, sealhulgas pärmi, nematoodide, puuviljakärbeste ja hiirte eluiga [10, 14, 15, 28–30]. See inhibeerib toitainete tundliku kompleksi TORC1 (rapamütsiini kompleksi 1 sihtmärk). TORC1 on konserveerunud mitmest allüksusest koosnev valgukompleks eukarüootsetes rakkudes, mis seob keskkonnas olevad toitained rakkude kasvu ja proliferatsiooniga [19, 29, 31–34].

Oleme uurinud rapamütsiini mõju pärmitüve kronoloogilisele elueale (CLS), et kinnitada meie äsja väljatöötatud protokoll. Siin ja allpool kasutasime oma katsetes prototroofset pärmitüve (CEN.PK113- 7D), et vältida aminohapete auksotroofia tugevat mõju rakkude ellujäämisele statsionaarses faasis [35, 36]. Rakud vanandati erinevate rapamütsiini kontsentratsioonidega sünteetilises määratletud (SD) söötmes. Rakkude kasvu mõõdeti erinevatel ajahetkedel (24 h, 48 h ja 72 h). Leidsime, et rakkude kasv saavutas küllastumise ligikaudu 24 tundi pärast inkubeerimist 5 nM või vähema rapamütsiiniga (joonis 4A). Kuid 10 nM rapamütsiini manustamine aeglustas rakkude kasvu ja küllastus saavutati alles 48 tunni pärast (joonis 4A). Varem täheldati CLS-i katses sarnast suundumust rapamütsiiniga kasvavate rakkude puhul [37].

Järgmise sammuna mõõdeti rapamütsiini erinevates kontsentratsioonides kasvatatud rakkude CLS-i. Määrasime rakkude ellujäämise PI fluorestsentsi abil erinevatel kronoloogilistel vanusepunktidel. Kasvuaeg 72 tundi loeti 1. päevaks. Elulemusgraafikult võime järeldada, et rapamütsiini lisamise erinevad kontsentratsioonid pikendavad pärmi CLS-i (joonis 4B). Rapamütsiiniga (5 nM ja 10 nM) täiendatud vananenud rakkude elulemus 4. päeval oli ~75 protsenti; ilma rapamütsiinita oli aga ~50 protsenti. 7. päeval oli rapamütsiiniga täiendatud vananenud rakkude elulemus 70 protsenti; ilma rapamütsiinita vähenes aga alla 20 protsendi. Vananenud rakkude CLS-i laienemist võib täheldada ka rapamütsiini madalamate kontsentratsioonide (0,62–2,5 nM) korral (joonis 4B).

Oleme oma protokolli kinnitanud, võrreldes seda otse kahe traditsioonilise väljakasvu lähenemisviisiga, mis mõõdavad pärmi CLS-i. Esiteks viisime läbi väljakasvu testi vedelas söötmes, et mõõta rapamütsiini mõju elueale. Kronoloogilise vananemise rakkude ellujäämist jälgiti erinevates vanusepunktides, viides 3-µl kultuuri 200 µl YPD söötmesse värskele 96-süvendiga plaadile. Väljakasv vastab elujõuliste rakkude arvule inokulaadis (joonis 4C). OD600 nm neeldumise kaudu registreeritud vananenud rakkude väljakasv määrati mikroplaadilugeja abil. Elulemusfraktsioon arvutati väljakasvu OD600 nm neeldumise põhjal iga vanusepunkti kohta võrreldes 1. päevaga (arvestati 100-protsendiliseks rakkude ellujäämiseks). Ellujäämise graafik on näidatud joonisel 4D.

Samuti viisime väljakasvu läbi agarisöötmel määrimise testiga. Märkasime YPD agarplaadil 3-µl vananemiskultuuri ja inkubeerisime seda 48 tundi. Vananenud rakkude väljakasv YPD agarplaadil visualiseeriti GelDoc pildisüsteemiga (joonis 4E). Ootuspäraselt võime jälgida rapamütsiini eluea pikendamise suundumusi nii YPD vedeliku kui ka agari väljakasvu testides, mis on paralleelsed meie uue protokolliga kindlaksmääratutega.

Need tulemused näitavad, et meie HTS-protokoll kordab, et rapamütsiin pikendab raku eluiga. Lisaks hindame selle meetodi kvaliteedi hindamiseks Z-tegurit [38]. Üldiselt näitavad Z-tegurid vahemikus 0,5–1.0 suurepäraseid HTS-analüüse. Z-tegur määrati rapamütsiini erinevate kontsentratsioonide jaoks koos vananenud rakkude PI fluorestsentsiga (täiendav joonis S2). Meie rahastamine, Z-faktor {{10}},70 5 nM rapamütsiini ja 0,74 10 nM rapamütsiini puhul, asetab selle HTS-meetodi kõrgekvaliteedilisse kategooriasse. Seega on meie protokoll piisavalt tugev, et tuvastada potentsiaalseid vananemisvastaseid ühendeid.

Uurimaks, kas meetod on efektiivne erineval pärmi geneetilisel taustal, testisime rapamütsiini mõju BY4743 tüve CLS-ile. Saccharomyces cerevisiae BY4743 tüvi on auksotroofne histidiini, leutsiini ja uratsiili suhtes. BY4743 tüve kasvatati erinevates kontsentratsioonides rapamütsiini SD söötmes, millele oli lisatud auksotroofseid koostisosi. Vanade rakkude ellujäämine kvantifitseeriti PI fluorestsentsi abil (täiendav joonis S3). Leidsime, et rapamütsiin suurendas BY4743 rakkude elujõulisust kvantitatiivselt sarnaselt CEN.PK113-7D omaga. Seega näitavad need tulemused, et meie meetod on efektiivne erinevate pärmitüvede puhul.

Glükoosi mõju pärmi kronoloogilisele elueale

Samuti kinnitasime oma meetodi, uurides kaloripiirangu mõju pärmi kronoloogilisele elueale. Kalorite piiramine on üks väljakujunenud sekkumistest vananemise edasilükkamiseks ja mudelorganismide, sealhulgas pärmi- ja imetajarakkude eluea pikendamiseks [11, 13, 16]. Kalorite piiramise mõju määramiseks pärmi CLS-ile vähendame glükoosisisaldust söötmes. Kasvatasime rakku kolmes erinevas SD-söötme tingimustes, mis sisaldasid 0,25 protsenti, 0,5 protsenti ja 2 protsenti glükoosi. Mõõtsime rakkude kasvu erinevatel ajahetkedel (24 h, 48 h ja 72 h). Kõik kultuurid saavutasid kasvuküllastuse 24 tunni pärast (joonis 5A). Rakkude kasv oli madalam 0,25 protsenti ja 0,5 protsenti võrreldes 2 protsendi glükoosiga (joonis 5A). Mõõtsime erinevate glükoosikontsentratsioonide all kasvatatud rakkude kronoloogilise vananemise ellujäämist, kasutades PI fluorestsentsi meetodit (joonis 5B). Elulemusgraafikust järeldame, et glükoosipiirang pikendab pärmi CLS-i. Samuti kinnitasime samaaegselt CLS-i laienemist väljakasvu analüüsidega (joonis 5C, D ja E), kinnitades veelgi meie uut meetodit pärmi CLS-i määramiseks. Glükoosipiirangu mõju BY4743 tüve CLS-i pikendamisele näitas ka PICLS-meetod (täiendav joonis S3). Seega on meie lähenemisviis pärmi CLS-i mõõtmiseks uudne, kiire ja odav meetod keemiliste mõjurite ja kultiveerimistingimuste sõelumiseks, et tuvastada vananemisvastaseid sekkumisi.

Keemiliste mõjurite sõelumine äsja väljatöötatud meetodi abil tuvastas 2,5-veevaba D-mannitooli uudse vananemisvastase ühendina

Pärast uue protokolli väljatöötamist ja valideerimist kasutasime seda meetodit sadade keemiliste ainete sõelumiseks vananemisvastaste ühendite tuvastamiseks (täiendav joonis S4 ja täiendav tabel 1). Ühe üllatava tulemusena leidsime, et ühend 2,5-anhüdro-D-mannitool (2,5-AM) pikendab pärmi CLS-i. Joonisel 6 on esitatud selle ühendi üksikasjalike järelkatsete tulemused. Testisime 2,{12}}AM vananemisvastast toimet erinevatel kontsentratsioonidel 96-kaevuplaadil. Esiteks tegime kindlaks 2,5-AM mõju rakkude kasvule. Pärmirakke inkubeeriti SD-söötmes erineva kontsentratsiooniga 2,{17}}AM. Rakkude kasvu mõõdeti erinevatel ajahetkedel (24 h, 48 h ja 72 h). Leidsime, et rakkude kasv saavutas 24 tunni pärast sama küllastustaseme kõigi testitud kontsentratsioonidega 2,5-AM (joonis 6A). Seejärel mõõtsime PI fluorestsentsmeetodit kasutades kronoloogiliselt vananenud rakkude ellujäämist, millele oli lisatud erinevaid kontsentratsioone 2,{26}}AM. Nagu varem, peeti 72-tunnist kasvukultuuri CLS-analüüsi 1. päevaks. Ellujäämise graafik on kujutatud erinevate kronoloogiliste vanuseliste ajapunktide jaoks (joonis 6B). Leiame, et 2,5-AM laiendab CLS-i kontsentratsioonist sõltuval viisil. Vananenud rakkude elulemus, millele oli lisatud 2,5- AM (8 mM) 4. päeval, oli ~ 80 protsenti; kuid ilma kella 2ta oli 5- AM ~ 50 protsenti . 7. päeval oli 2,5-AM toidulisandiga vananenud rakkude elulemus ~ 75 protsenti; kuid ilma kella 2ta vähenes 5-AM vähem kui 20 protsendini . 2,5-AM vananemisvastast toimet kontrolliti ka väljakasvu analüüsidega (joonis 6C, D ja E).

2,5-AM on suhkru molekul, mis võib siseneda glükolüüsirada. See hüdrolüüsitakse ainult ülesvoolu glükolüütilistes etappides, mis põhjustavad mittemetaboliseerunud 2,5-AM-1, 6-bisfosfaadi (2,5-AMBP) akumuleerumist rakkudes [39–41 ]. Et testida, kas glükolüüsi ensüümid on töödeldud 2,5-AM CLS-i katsega sarnastes kontsentratsioonides, uurisime SNF1 geeni deletsioonitüve kasvavat tundlikkust. SNF1 on raku energiaandur ja kõrgelt konserveerunud AMP-aktiveeritud proteiinkinaas (AMPK) eukarüootides [42, 43]. Pärmirakud, millel puudub AMPK aktiivsus, on metaboliseerimata glükolüütiliste vaheühendite juuresolekul seotud ülitundliku kasvufenotüübiga [44]. Mõõtsime snf1A deletsioonitüve kasvu erinevate kontsentratsioonidega 2,5-AM. Leidsime, et 2,5-AM inhibeerib snf1A deletsioonitüve kasvu võrreldes metsiktüüpi tüvega (täiendav joonis S5). See täheldatud kasvufenotüüp näitab, et 2,5-AM läbib glükolüüsi ja hüdrolüüsitakse mittemetaboliseerunud glükolüütilisteks vaheühenditeks.

2, 5-AM on suhkruosa fruktoosi analoog [39]. Et selgitada, kas teised suhkrud mõjutavad ka CLS-i, uurisime fruktoosi, mannitooli ja maltoosi mõju pärmi vananemisele. Lisasime ka sorbitooli, mis on metaboliseerumata suhkur, mis väidetavalt suurendab pärmirakkude CLS-i, suurendades söötme osmolaarsust [20, 45]. Esiteks testisime fruktoosi, mannitooli, maltoosi ja sorbitooli mõju rakkude kasvule. Pärmirakke inkubeeriti erineva kontsentratsiooniga fruktoosi, mannitooli, maltoosi ja sorbitooliga, mis sarnanesid 2,5-AM-iga SD-söötmes. Nagu 2, 5-AM, saavutasid fruktoosi, mannitooli, maltoosi ja sorbitooliga inkubeeritud rakud kasvuküllastuse 24 tunni pärast (joonis 7A). Järgmisena mõõdeti kronoloogiliselt vananenud rakkude ellujäämist päeval 1, 7, päeval 14 ja 21. Erinevalt 2-st hommikul ei pikendanud fruktoosi, mannitooli, maltoosi ja sorbitooli lisamine nende eluiga. pärm (joonis 7B, C, D, E ja täiendav joonis S6). Märkimisväärselt pikendab kell 2 5-öö eluiga isegi kronoloogilise vananemise hilises staadiumis. Vananenud rakud, millele oli lisatud 2,5-AM-i (8 mM), jäid ellu (~65 protsenti) 21. päeval. Kuid vananenud rakkude elulemus ilma 2,5-AM-lisandita oli alla 10 protsendi.

Suureks üllatuseks leidsime, et sorbitool madalatel testitud kontsentratsioonidel ei suuda CLS-i suurendada (joonis 7B, C, D, E ja täiendav joonis S6). Hüpoteesisime, et CLS-i suurendamiseks võib olla vaja kõrgemaid sorbitooli kontsentratsioone. Testisime mitmesuguseid kõrgemaid kontsentratsioone, sealhulgas 1 M sorbitooli, mille kontsentratsioon varem teatati CLS-i mõjutavat (18 protsenti, mis vastab 1 M) [20, 45]. Kooskõlas varasemate aruannetega leiame ka, et väga kõrge sorbitooli kontsentratsioon (vahemikus 0,5–1 M) suurendab pärmi CLS-i (täiendav joonis S7), ilmselt suurendades söötme osmolaarsust. Huvitaval kombel viitab CLS-i suurenemine 2,{12}} AM võrra väga madalal kontsentratsioonil (2 mM), et selle vananemisvastase toime mehhanism erineb osmootsest. Need tulemused viitavad sellele, et 2,5-AM vananemisvastane toime on selle suhkruühendi jaoks spetsiifiline ja seda ei täheldata mitmete teiste sarnase struktuuriga kemikaalide puhul.

【Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】