Vanusega seotud neurodegeneratiivsete haiguste prekliiniliste uuringute edenemise tee: näriliste ja HiPSC-st pärinevate mudelite väljavaade, 5. osa

HiPSC-st tuletatud rakusüsteemide ja haiguste mudelite eelised

Täiustatud haiguste modelleerimise ja ravimite avastamise platvormid

HiPSC-põhiste in vitro mudelite potentsiaal olla inimese geneetilise komponendi uurimisega NDD-de jaoks väga informatiivne.

Inimese geneetika ja mälu suhe on palju arutatud teema, eriti kaasaegses ühiskonnas, kus keskendume isiklikule arengule ja õppimisele. Kuigi meie geneetiline informatsioon määrab sünnihetkel meie põhiomadused, erineb mälu fikseeritud omadustest, nagu meie pikkus ja nahavärv. Selle asemel saab seda kasvatada ja täiustada ning see mängib igapäevaelus olulist rolli.

Esiteks näitavad teadusuuringud, et mälu ei ole otseselt seotud geneetiliste geenidega. Kuigi mõned inimesed sünnivad targemana kui teised, saab pikemas perspektiivis õppimise ja kasvatamise kaudu mälu järk-järgult parandada. Oma õppeprotsessis põhikoolist ülikoolini peame pidevalt kasutama ja parandama oma mälu, et parandada oma õppeedukust. Näiteks mäletame probleeme ja lahendusi korduva ülevaatamise ja harjutamise kaudu, mis aitab meie mäluvõimet treenida.

Teiseks aitab tervislik eluviis palju kaasa ka meie mälule. Füüsilisel tervisel on suur mõju ja mõju mälule, näiteks piisav uni, tervislik toitumine ja mõõdukas treening. Alustame oma kehast ja püsime tervena läbi liikumise ja tervisliku eluviisi, mis muudab meie mälu selgemaks ja teravamaks.

Lõpuks saame ka oma mäluvõimet laiendada, avardades pidevalt silmaringi ja osaledes erinevates uutes asjades. Näiteks võime proovida õppida uut keelt ja osaleda ühiskondlikes tegevustes, nagu reisimine, ning need kogemused võivad tekitada rohkem mälestusi meie mõtetes.

Lühidalt, inimese geneetika ja mälu suhe on keeruline ja mitmekesine ning loomulikult tekivad ka vastavad erinevused, mis põhinevad isiklikel geneetilistel erinevustel. Kuid me ei tohiks ignoreerida seda, mida saame teha: meie mälu ja enesejuhtimise võime parandamine pideva õppimise, tervisliku eluviisi ja pideva silmaringi laiendamise kaudu on parim viis geneetilistest erinevustest üle saamiseks. On näha, et me peame oma mälu parandama ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche on traditsiooniline Hiina meditsiin, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche'i efektiivsus tuleneb selle erinevatest toimeainetest, sealhulgas parkhappest, polüsahhariididest, flavonoidglükosiididest jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Lühimälu parandamiseks klõpsake nuppu Tea

Võime korreleerida NDD kandidaatgeene raku fenotüüpidega, nagu RNA ja valgu ekspressiooniprofiilid, morfoloogilised muutused ja biokeemilised signatuurid hiPSC-st pärinevates rakkudes, hõlbustab uuringuid selle kohta, kuidas komplekssete NDD-de, nagu AD ja PD, inimese geneetilised komponendid ekspresseeruvad raku tase.

Veelgi enam, hiPSC-d võimaldavad mudelisse kaasata patsiendi geneetilise tausta geneetilise keerukuse, mida sageli eitatakse (nt keemilised mudelid) või ülelihtsustatud (nt monogeneetilised loommudelid).

On hästi teada, et neurodegeneratsiooni alguse, progresseerumise ja raskusastme määravad keerulised geneetilised tegurid ja mitmete suhteliselt väikese mõjuga geneetiliste variantide koosmõju.

See kaasasündinud geneetiline maastik, mis on jäädvustatud patsientidest pärinevatesse hiPSC mudelitesse, võimaldab meil uurida geneetilisi determinante ja bioloogilisi tegureid, mis on ühendatud võimega genereerida modulaarseid, ülitäpseid in vitro NDD-mudeleid, et tugineda meie praegusele arusaamale haigusbioloogiast. hiPSC-tehnoloogia on praegu ainus saadaolev inimese jaoks -põhised mudelid, milles on jäädvustatud patsientide täielik geneetiline maastik.

Samuti võimaldas hiPSC-de abil genoomi redigeerimise tehnoloogiate (nt CRISPR-Cas9) rakendamine luua isogeenseid mudeleid täpsete geneetiliste variantide hindamiseks. Lisaks skaleeritavusele on hiPSC-d iseeneslikult taastuvad.

Seega on hiPSC-st tuletatud mudelid prekliiniliste uuringute jaoks paljulubav süsteem. Veelgi enam, patsiendilt saadud hiPSC-võimega seotud inimese geneetiline mitmekesisus muudab need sobivaks "personaliseeritud meditsiini" lähenemisviiside hindamiseks.

Võimalus tõhusalt sõeluda individuaalseid reaktsioone ravile ja tuvastada mittereageerivaid või halvasti reageerivaid inimesi enne manustamist kliinilises keskkonnas rõhutab veelgi hiPSC-st tuletatud mudelite sobivust prekliinilisteks hindamisteks (joonis 2).

Kokkuvõttes on hiPSC mudelite prekliiniliste uuringute käigus saadud potentsiaalne teave usaldusväärne, inimeste jaoks asjakohane ja oluline kliiniliste uuringute kavandamisel (nt uuritavate kihistumine), et parandada tulemuste täpsust.

Loommudelite piiride ületamine

HiPSC-d pakuvad võimalust ületada paljud praegustes loomapõhistes mudelites esinevad probleemid, nagu eelnevalt arutatud. Esiteks pakuvad iPS-ist tuletatud mudelid inimesel põhinevat platvormi potentsiaalsete ravimite hindamiseks inimhaiguse tegelikul geneetilisel maastikul.

Teiseks, patsientidelt rakkude tuletamisega hoitakse mööda paljudest tehnilistest probleemidest, mis on seotud inimeste haiguste mutatsioonide parima mudeli modelleerimisega, kuna mudel sisaldab patsiendi ainulaadset geneetilist tausta. Kolmandaks on hiPSC rakud kergesti ligipääsetavad geneetiliseks ja farmakoloogiliseks manipuleerimiseks, võimaldades suure läbilaskevõimega struktuurseid ja funktsionaalseid analüüse, mis hindavad haiguse fenotüüpi.

Sel eesmärgil töötasime hiljuti välja hiPSC-st tuletatud DA neuronaalse mudeli, mis saadi SNCA kolmekordse PD-ga patsiendilt, et hinnata kõik-ühes LV GT-d, mille eesmärk on vähendada SNCA taset. Meie LV sekkumine vähendas edukalt SNCA taset ja päästis haigustega seotud fenotüübid reaktiivsete oksüdatiivsete liikide (ROS) tekke ja rakkude elujõulisuse säilitamise kaudu.140

Neljandaks, võrreldes standardse näriliste mudeliga, saab in vitro hiPSC-põhiste mudelite genereerimist saavutada oluliselt lühema aja jooksul, suurusjärgus 30 päeva, võrreldes loommudelitega, mis võivad ulatuda kuudest aastateni.

Viiendaks, kooskõlas eelmise punktiga, on hiPSC-põhised mudelid tunduvalt odavamad ja energiakulukamad kui näriliste mudelid, eriti kui arvestada käimasolevaid loomapidamiskohustusi ja infrastruktuuri, eeskirju, samuti koolitus- ja vastavusnõudeid. Üha majanduslikum prekliiniline haiguste modelleerimine suurendab uurimisrühmade juurdepääsu oletatavatele ravimitele, mis parandavad transleeritavust ja lõppkokkuvõttes DMT arendamise tõhusust.202

Kokkuvõttes annavad need eelised hiPSC-st tuletatud mudelitele selge eelise neurodegeneratsiooni uurimisel ja sellistel mudelitel on potentsiaal luua uusi avastusi, mis varasemates rakukultuuri ja loomahaiguste mudelites olid kättesaamatud.

Siin läbivaadatud uuringud näitavad 2D- ja 3D-hiPSC-põhiste mudelite lisamise vajalikkust ja väärtust NDD mehhaanilistes uuringutes, mis selgitavad haiguse põhjuslikkuse ja patogeensete radadega seotud tegureid, samuti translatsiooni- ja ravimite avastamise uuringuid, nagu terapeutiliste sihtmärkide tuvastamine ja valideerimine. .

Üheskoos kujutavad hiPSC-st tuletatud NDD mudelid edasi hüpet meditsiinilistes uuringutes tänu haiguste täiustatud modelleerimisele, mis on märkimisväärselt teostatav, suhteliselt lühemate katsetega, mis on kulutõhusad ja mis võib-olla kõige tähtsam, täpsed ja sobivad inimeste haiguste modelleerimiseks.

Joonis 2. NDD-de täiustatud DMT-ravimite väljatöötamise torujuhtme skeem hiPSC-st tuletatud mudelite suurendatud kaasamise ja/või asendamise kaudu. Iga oletatava DMT väljatöötamine algab avastamisfaasist, mis hõlmab nii asjakohaste geenisihtmärkide kui ka haiguse mehhanismide tuvastamist.

Järgnevad haigusmudelid töötatakse välja varases prekliinilises faasis, et uurida rakuhaiguste patofüsioloogiat ja valideerida ravimite sihtmärke, samuti varajaste CGT-IP-de/DMT-de varajast skriinimist ja optimeerimist. DMT-de järkjärguline arendamine, sealhulgas mudeli edasine arendamine ja sihtmärgi valideerimine, samuti sihtmärgiväliste mõjude uurimine toimub prekliinilise faasi keskpaigas.

DMT edenedes saadakse lisateavet farmakokineetilise ja farmakodünaamilise aktiivsuse kohta hilises prekliinilises faasis. HiPSC-st tuletatud mudelite suurenenud kasutamine nendes faasides on mitmel põhjusel ahvatlev edasiminek olemasolevale ravimiarenduse torujuhtmele; nimelt on need kulutõhusad, mitmekülgsed ja, mis kõige tähtsam, ületavad paljusid NDD-de olemasolevate loommudelite kaasasündinud piiranguid.

Selles etapis saab esitada IND-taotlusi oletatavate DMT-de jaoks, mis sisaldavad praegu nelja kriitilist eesmärki, mis tuleb täita mis tahes tekkiva DMT-ga, eriti CGT-IP-dega: (1) sihtmärgi valik, (2) juhtühendi arendamine ja optimeerimine, (3) esialgne eesmärk. ja suurenev doseerimisrežiim ning (4) teostatavuse ja ROA kindlaksmääramine.

Kõiki neid saab täpselt ja asjakohaselt käsitleda, asendades prekliinilistes uuringutes hiPSC-põhiseid mudeleid. Seejärel võivad DMT-d saada kliiniliste uuringute alustamiseks FDA loa.

HiPSC-põhiste mudelite lisamine täiendavasse faasi 1a võib olla kaasatud, mis hõlbustab kandidaatide paremat skriinimist värbamisfaasis ja potentsiaalsete mittereageerivate või halvasti reageerivate isikute tuvastamist prekliiniliste geneetiliste uuringute põhjal.

DMT-d, mille faasis 1a on tõestatud ohutus, läbivad seejärel 1., 2. ja 3. faasi kliinilised uuringud, mille järel saavad olulise positiivse mõjuga need ravimid uue ravimitaotluse (NDA) regulatiivse heakskiidu ja lastakse tarbijatele kasutamiseks koos jätkuva ravimiohutuse järelevalvega, et tuvastada kõik varem tuvastamata. ebasoodsad tagajärjed aja jooksul.

HiPSC-st tuletatud in vitro mudelite piirangud, aeg ja reprodutseeritavus

HiPSC-de kultiveerimistehnoloogiad tekkisid viimase kümnendi jooksul ning nende kasulikkus haiguste modelleerimiseks ja oletatavate DMT-de prekliiniliseks hindamiseks on suhteliselt uudne.

Nagu iga areneva tehnoloogia puhul, tuleb NDD-de bioloogiliste omaduste täpseks taastamiseks arvestada mitmete piirangutega. Esiteks võib hiPSC-de kasvatamine ning täpsete ja usaldusväärsete rakumudelite loomine olla kulukas, töömahukas ja aeganõudev. Meditsiiniuuringute jaoks sobival tasemel hiPSC liinide valideerimine maksab keskmiselt 10–25 USD.203

Ümberprogrammeerimise, diferentseerumise ja küpsemise protsessid pikenevad. Stardikoe rakkude ümberprogrammeerimine hiPSC-deks võib kesta vähemalt 20–30 päeva151 ning sellele järgnev rakkude diferentseerumine ja küpsemine varieerub sõltuvalt soovitud rakutüübist ja kasutatavast meetodist; Näiteks küpsete neuronite, astrotsüütide ja mikrogliakaani genereerimiseks kulub vastavalt 6 kuni 15 nädalat, 204 4 kuni 9 nädalat, 205 206 või 5 kuni 9 nädalat, 164 207.

Selle tulemusena eelistavad teadlased sageli katsete jaoks stabiilsete vaheühenditena kasutada eellasrakke, kuna need esindavad üldjoontes sihtrakutüüpi ja neid saab genereerida kiirema aja jooksul.204 Seega võivad hiPSC-mudeli süsteemi loomiseks vajalikud ajapiirangud ja kulud olla olulised. tekitab muret paljudele uurimisrühmadele.

Lisaks võetakse NDD-de modelleerimisel arvesse ka aega, mis kulub peamiste haigustega seotud rakuliste fenotüüpide väljatöötamiseks hiPSC-st pärinevates rakkudes. Kui kliiniliste ja patoloogiliste sümptomite ilmnemiseks kulub patsiendi elust aastakümneid, siis haigusega seotud molekulaarsed fenotüübid tuvastati hiPSC-st tuletatud mudelites umbes 2 kuud pärast küpsemist.208

Sellegipoolest tulenevad piirangud hiPSC-põhiste mudelite kultuuride piiratud elueast, mis ei pruugi olla piisav, et luua terviklikku pilti, mis sarnaneb haigusega raku ja koe tasemel.

Diferentseerumis- ja küpsemisprotsessi kiirendamise strateegiad, nagu Notchi ja g-sekretaasi inhibiitorite lisamine küpsemisaja lühendamiseks209 ja neurogeniini -2 (Ngn2) või NeuroD1 üleekspressioon158, on olnud osaliselt edukad ja toonud kaasa muid ektoopilise ekspressiooniga seotud probleeme.

Muud piirangud on seotud süsteemide reprodutseeritavusega korduvates katsetes ja omase mudelitevahelise varieeruvusega, sealhulgas hiPSC-st pärinevate kultuuride puhtusega seotud tagasilöögid ja ebasoovitavate heterogeensete rakupopulatsioonide olemasolu.

Seega on hiPSC-st tuletatud haigusmudelite kasutamisel oluline arvestada rakupopulatsioonide heterogeensusega, eriti DMT skriinimisel ja efektiivsuse hindamisel. Lisaks on teatatud, et hiPSC kultuuridel on genoomne ebastabiilsus ning raku laienemise ja ümberprogrammeerimise käigus võivad nad omandada geneetilisi aberratsioone ja mutatsioone.211

Ettevaatlik tuleb olla ka erinevate genoomi redigeerimise tehnikate abil loodud isogeensete liinide kasutamisel, kuna võivad ilmneda potentsiaalsed sihtmärgivälised efektid (nt tahtmatu kloonide varieeruvus isogeensete liinide vahel ja sihtmärgiväline mutagenees).212 213 Seetõttu on oluline perioodiliselt hinnata. hiPSC-de genoomne stabiilsus tagab range DMT-sõeluuringu.

Väljakutsed sporaadilise NDD patofüsioloogia ja raku fenotüüpide kokkuvõtmisel

NDD-de keerukus ning nende rakuliste fenotüüpide tervikliku iseloomustamise ja mehaanilise mõistmise puudumine seavad väljakutsed võimele neid kokku võtta rakumudelitega, sealhulgas hiPSC-põhiste süsteemidega.

NDD-de põhjused on keerulised ja mitmefaktorilised, sealhulgas polügeensed riskifaktorid (st multigeenid ja variandid), epigeneetilised märgid, vananemine, sugu ja keskkonnategurid, nagu oksüdatiivse stressi vallandajad, millest mõnda on raske esile kutsuda, eriti paljude erinevate tegurite loendis. kombinatsioonid laborisüsteemis.

Lisaks pärineb suurem osa hiPSC-st tuletatud AD-PD-mudeleid perekondlike mutatsioonidega patsientidelt, mis moodustavad vaid väga väikese osa üldistest juhtudest.214 215 Kuna perekondlike ja sporaadiliste vormide aluseks olevad mehhanismid võivad erineda, on vaja luua mudelid, mis on tuletatud hiPSC ja fibroblastid, mis on saadud sAD või juhuslikult PD patsientidelt.

Selle eesmärgi saavutamiseks on viimastel aastatel esile kerkinud patsientide rakuhoidlate algatused; nende hulka kuuluvad rakenduslikud tüvirakud (ASC), California regeneratiivse meditsiini instituut (CiRA), Cedars Sinai indutseeritud pluripotentsed tüvirakud, Euroopa indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude pank (EBiSC), Korea riiklik tüvirakupank (KSCB), riiklik vananemisinstituut (NIA) , National Institue of Neurological Disordersand Stroke (NINDS), National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) ja WiCell Research Institute (WiCell) (tabel S2).

Nende kollektsioonide eeldatav kasv hõlbustab hiPSC-st tuletatud mudelite loomist, mis sobivad paremini tavalise sAD ja sporaadilise PD uurimiseks.

Sellegipoolest tekitavad sporaadilistelt NDD-ga patsientidelt saadud hiPSC mudelid keskkonnaga manipuleerimisel, näiteks kokkupuutel neurotoksiinidega ja oksüdatiivse stressi keemilise indutseerimisega, AD181-le ja PD216-le iseloomulikke rakulisi fenotüüpe.

Hiljutine uuring näitas ka muutusi mitokondriaalse valgu ekspressioonis ja suurenenud oksüdatiivset stressi sAD-patsientidelt tekkinud hiPSC-des, vaatamata Ab- ja tau-patoloogia märgatavale puudumisele,217 mis viitab sellele, et hiPSC mudelid võivad avaldada väärtuslikku ülevaadet sporaadiliste NDD alatüüpide spetsiifilisest nüansilisest patofüsioloogiast.

Lisaks kasutasid Meyer jt hiljutises uuringus 218 sAD-ga patsientidelt saadud hiPSC-sid ja leiti, et tau valku kodeeriv MAPT oli sAD-st pärinevates rakkudes tervete kontrollidega võrreldes oluliselt suurenenud.

Seega, vaatamata nendele väljakutsetele, on praegused hiPSC-st tuletatud mudelid suurepärased asendused, mis annavad võimaluse matkida haiguse patofüsioloogiat ja luua sporaadilistel patsientidel täieliku geneetilise alusega kuldstandardi haiguse tunnuseid, mida saab kasutada järgnevate haigusmudelite parandamise meetmetena.

For more information:1950477648nn@gmail.com