Suukaudse hüpoksiaga indutseeritav faktor prolüülhüdroksülaasi inhibiitor Enarodustat neutraliseerib neeruenergia ainevahetuse muutusi diabeetilise neeruhaiguse algstaadiumis

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Sissejuhatus

Tokyo ülikooli meditsiinikooli nefroloogia ja endokrinoloogia osakond, Tokyo, Jaapan; Teadusstipendium noortele teadlastele, Jaapani Teaduse Edendamise Ühing, Tokyo, Jaapan; Bioloogiliste ja farmakoloogiliste uuringute laborid,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Jaapan; Tokyo ülikooli meditsiinikooli süsteemifarmakoloogia osakond, Tokyo, Jaapan; Laboratory for Synthetic Biology, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Suita, Jaapan; ja WPI rahvusvaheline neurointellekti uurimiskeskus, Tokyo ülikooli edasijõudnute uuringute instituut (UTIAS), Tokyo ülikool, Tokyo, Jaapan.

Hüpoksiaga indutseeritava faktori (HIF) prolüülhüdroksülaasi inhibiitorid, tuntud ka kui HIF stabilisaatorid, suurendavad endogeense erütropoetiini tootmist ja toimivad uudsete raviainetena aneemia vastukroonilineneerudhaigus. HIF indutseerib erinevate energia metabolismiga seotud geenide ekspressiooni adaptiivse vastusena hüpoksiale. Siiski jääb ebaselgeks, kuidas HIF-i stabiliseerimise kaudu toimuv metaboolne ümberprogrammeerimine sisekoe patofüsioloogiat mõjutab.neerud haigused. Varasemad uuringud näitavad, et süsteemsed metaboolsed häired, nagu hüperglükeemia ja düslipideemia, põhjustavad muutusi neerude metabolismis, mis põhjustab neerufunktsiooni häireid, sealhulgas diabeetilist neeruhaigust. Siin analüüsime suukaudse HIF-i stabilisaatori enarodustaadi (JTZ-951) mõju neerude energia metabolismile diabeetilise neeruhaiguse varases staadiumis, kasutades streptotsototsiini indutseeritud diabeetilisi rotte ja alloksaanist põhjustatud diabeetilisi hiiri. Transkriptoomianalüüs näitas, et enarodustat neutraliseerib diabeedi neerude metabolismi muutusi. Transkriptoomianalüüs näitas, et rasvhapete ja aminohapete metabolism oli diabeetilise neerukoes ülesreguleeritud ja enarodustaat alareguleeritud, samas kui glükoosi metabolism oli ülesreguleeritud. Neid sümmeetrilisi muutusi kinnitas metaboolne analüüs. Kui diabeetiliste loomade neerukoes kogunesid glükolüüsi ja trikarboksüülhappe tsükli metaboliidid ja vähenes aminohapete hulk, leevendas enarodustaat neid metaboolseid häireid. Lisaks suurendas enarodustatiin glutatiooni ja glutatiooni disulfiidi suhet ja leevendas oksüdatiivset stressi diabeetiliste loomade neerukoes. Seega neutraliseerib HIF-i stabiliseerumine algaval ajal toimuvaid muutusi neerude energia metabolismisdiabeetikneerudhaigus.

Cistanche on neerufunktsiooni jaoks väga hea

Tõlkeavaldus

Hüpoksiast indutseeritava faktori (HIF) prolüülhüdroksülaasi inhibiitorid (tuntud ka kui HIF stabilisaatorid) suurendavad endogeense erütropoetiini tootmist ja toimivad uudsete aneemiavastaste ainetena.kroonilineneerudhaigus. Meie neerukoe transkriptoomi- ja metaboolsed analüüsid rottide ja hiirte diabeedimudelites on näidanud, et enarodustaat (JTZ-951), suukaudne HIF-i stabilisaator, neutraliseerib neerude energia metabolismi muutusi diabeetilise neeruhaiguse varases staadiumis. Tulemused annavad olulisi andmeid HIF-i stabilisaatorite mõju ekstrapoleerimiseks neerude energia metabolismile kliinilistes tingimustes, kuigi on vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada, kuidas see neeru metabolismi ümberprogrammeerimine HIF-i stabilisaatorite poolt mõjutab haiguse progresseerumist.diabeetikneerudhaigus.

Sissejuhatus

Hüpoksiast indutseeritava faktori (HIF) prolüülhüdroksülaasi inhibiitorid suurendavad endogeense erütropoetiini tootmist ja toimivad uudsete raviainetena kroonilise aneemia vastuneerudhaigus. Rakud on varustatud hüpoksia vastase kaitsemehhanismiga ja HIF on selle kaitse peamine regulaator. Neerud puutuvad füsioloogiliselt kokku hüpoksiaga ja kroonilist hüpoksiat peetakse viimaseks levinud teeks, mis viib lõppstaadiumis neeruhaiguseni. Arvestades, et HIF indutseerib erinevate hüpoksiareaktsioonidega seotud geenide ekspressiooni, võivad HIF-i stabilisaatorid avaldada pleiotroopset mõju haiguse progresseerumisele.neerudhaigusedsamuti aneemia paranemine kroonilisesneerudhaigus. Huvitaval kombel indutseerib HIF glükolüütiliste geenide ja püruvaatdehüdrogenaasi kinaasi ekspressiooni, mis pärsib püruvaatdehüdrogenaasi kasutamist püruvaadil mitokondriaalse trikarboksüülhappe (TCA) tsükli käivitamiseks.6,7 See metaboolne ümberprogrammeerimine TCA tsüklist glükolüüsile pärsib hapnikutarbimist ja on kriitilise tähtsusega. hüpoksilise keskkonnaga kokkupuutuvate rakkude kohanemiseks. Siiski jääb ebaselgeks, kuidas neerukoe metaboolne ümberprogrammeerimine HIF-i stabiliseerimise teel mõjutab neerukoe patofüsioloogiat.neerud haigused. Diabeetiline neeruhaigus (DKD) on lõppstaadiumis neeruhaiguse peamine põhjus. Süsteemsed ainevahetushäired, nagu hüperglükeemia ja düslipideemia, põhjustavad neerude metabolismi muutusi, mis põhjustavad neerufunktsiooni häireid, sealhulgas DKD-d. Varasemad uuringud on näidanud suurenenud metaboolset voogu ja glükoosi ja TCA tsükli metaboliitide akumuleerumist diabeetilise neerukoore koes, mis võib olla seotud mitokondriaalse düsfunktsiooni ja DKD progresseerumisega. Me oletasime, et HIF-i stabilisaatorid võivad muuta ainevahetuse muutusi diabeetilise neerukoore koes, arvestades, et HIF kui adaptiivne reaktsioon hüpoksiale vähendab rakkude metaboolset voogu hapnikutarbimise pärssimiseks. Seega viisime transkriptoomi- ja metaboolsete analüüside abil läbi kontseptsiooni tõendava uuringu, et mõista põhjalikult, kuidas enarodustat (JTZ-951), suukaudne HIF-i stabilisaator, mõjutab neerude metabolismi muutusi DKD varases staadiumis.

TULEMUSED: Enarodustat kutsub esile metaboolse ümberprogrammeerimise TCA tsüklist glükolüüsile neerude proksimaalsetes tuubulite rakkudes

Kuna neerukoor koosneb peamiselt proksimaalsetest tuubulitest, uurisime esmalt enarodustaadi mõju neerude proksimaalsete tuubulite rakkude metaboolsele voolule in vitro. Esiteks viidi läbi Mito stressitest (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ja glükolüütilise kiiruse test (Agilent) kultiveeritud HK-2 rakkudes, mis on inimese proksimaalse tuubuli epiteeli rakuliin (joonis 1a). Enarodustat vähendas oluliselt mitokondriaalset hingamist (TCA tsükkel) ja suurendas basaalglükolüüsi, mis näitab metaboolset ümberprogrammeerimist TCA tsüklist glükolüüsiks (joonis 1; täiendav joonis S1). Tegime ka katse, kasutades HIF-1 jaoks väikest segavat RNA-d (siRNA) (joonis 2; täiendav joonis S2). HIF-1 pärssimine siRNA poolt muutis enarodustaadi indutseeritud metaboolsed muutused (baashingamine, maksimaalne hingamine, vaba hingamisvõimsus ja adenosiintrifosfaadi [ATP] tootmine), mis näitas, et metaboolne ümberprogrammeerimine toimus peamiselt HIF-i kaudu-1 stabiliseerimine (joonis 2; täiendav joonis S2). Püruvaatdehüdrogenaasi aktiivsust, mis on rakkude jaoks oluline tegur püruvaadi kasutamisel TCA tsükli kütuseks, vähendas ka enarodustaat (joonis 2f), mis ühildus varem avaldatud tähelepanekutega.

Taustaandmed streptozototsiini poolt indutseeritud diabeetiliste rottide kohta

In vitro katsete tulemuste põhjal oletasime, et HIF-i stabilisaatorid võivad leevendada ainevahetuse muutusi diabeetilise neerukoore koes metaboolse ümberprogrammeerimise kaudu TCA tsüklist glükolüüsile. Esmalt valisime ülalmainitud hüpoteesi testimiseks kontseptsiooni tõestamise katse mudeliks streptozototsiini (STZ) indutseeritud diabeetilised rotid. Selles mudelis indutseeritakse diabeet kiiresti, mis võimaldab meil lühikese aja jooksul jälgida diabeedi ja HIF-i stabilisaatorite netomõju neerukoe energia metabolismile. Uuringuprotokoll ja STZ-indutseeritud diabeetiliste rottide katsete põhiandmed on näidatud joonisel 3a. Jagasime rotid kolme rühma: rühm A (võlts), rühm B (DKD) ja rühm C (DKD þ enarodustat). Vereplasma glükoosi, glükosüülitud hemoglobiini HbA1c, triglütseriidide ja üldkolesterooli tase 14. päeval tõusid diabeedirühmades võrreldes A rühmaga oluliselt, samas kui rühmade B ja C vahel olulisi erinevusi ei olnud (joonis 3d – g). Kuigi plasma kreatiniinisisaldus rühmades ei erinenud, suurenes albumiini eritumine uriiniga oluliselt ja glomerulomegaalia oli B-rühmas märgatav võrreldes A rühmaga ning enarodustaat kaldus need muutused tagasi pöörama (joonis 4). Vere uurea lämmastiku tase oli kõrgem diabeetikute rühmades, mis peegeldab diabeedist tingitud dehüdratsiooni. Kokkuvõttes esindavad meie uuringus STZ-ga ravitud rottide neerud DKD varajast staadiumit. Transkriptoomide ja metaboolsete analüüside läbiviimiseks kasutati nende rottide neerukoore kude.

Neerukoore koe transkriptoomianalüüs

Neerukoorekoe transkriptoomianalüüsi tulemused on näidatud joonistel 5 ja 6. Põhikomponentide analüüs ja hierarhiline klastrite analüüs näitasid, et rühmad A, B ja C eraldati vastavalt erinevatesse klastritesse (joonis 5a ja b). Erinevalt ekspresseeritud geenid valiti │log2 kordne muutus (FC) │ suurem või võrdne kui 0,5 ja Q väärtus < 0,05.="" geeni="" ontoloogia="" ja="" kanooniliste="" radade="" analüüsid="" näitasid,="" et="" rasvhapete="" metabolismiga="" seotud="" geenid="" olid="" b="" rühmas="" võrreldes="" a="" rühmaga="" ülesreguleeritud.="" seevastu="" glükoosi="" metabolismi="" ja="" hüpoksia="" vastusega="" seotud="" geenid,="" sealhulgas="" hif-1="" võrgustik,="" olid="" c="" rühmas="" ülesreguleeritud.="" rühmaga="" b="" (joonis="" 5c="" ja="" d).="" samuti="" viisime="" läbi="" geenikomplekti="" rikastamise="" analüüsi="" (gsea),="" kasutades="" transkriptoomilisi="" andmeid="" (joonis="" 6,="" tabelid="" 1="" ja="" 2).="" rasvhapete="" ja="" aminohapete="" metabolismi="" geenikomplektid="" olid="" rühmas="" b="" ülesreguleeritud="" võrreldes="" rühmaga="" a="" (joonis="" 6).="" seevastu="" need="" geenikomplektid="" olid="" allareguleeritud="" ja="" glükoosi="" metabolismi="" geenikomplektid="" olid="" c-rühmas="" võrreldes="" b-rühmaga="" ülesreguleeritud,="" mis="" näitab,="" et="" enarodustaat="" muutis="" diabeedist="" põhjustatud="" metabolismi="" muutused="" (joonis="" 6).="" veelgi="" enam,="" tca="" tsükli="" geenikomplektid="" olid="" rühmas="" c="" alareguleeritud="" võrreldes="" rühmaga="" b="" (tabel="" 2),="" mis="" on="" kooskõlas="" meie="" in="" vitro="" uuringus="" täheldatud="" enarodustat-indutseeritud="" metaboolse="" ümberprogrammeerimisega="" proksimaalsetes="" tuubulites.="" kokkuvõttes="" neutraliseeris="" enarodustaat="" diabeetiliste="" neerude="" metabolismi="" muutusi="" transkriptoomilisest="">

Neerukoore koe metaboloomianalüüs

Mõõtsime igast rühmast juhuslikult valitud 116 energiaga seotud metaboliidi absoluutset kontsentratsiooni rottide neerukoorekoes (n =4, iga rühma jaoks) (täiendav tabel S1; täiendav joonis S3). Klassi diskrimineerimise olulisuse hindamiseks viidi läbi osaline vähimruutude diskriminantanalüüs (PLS-DA) (joonis 7). Tegime metaboliitide komplekti rikastamise analüüsi (MSEA), kasutades metaboliite, mille PLS-DA muutuv tähtsus projektsioonis (VIP) oli $ 1. Aminohapete, nagu glütsiin, seriin, metioniin, aspartaat, glutamaat, arginiin, proliin, metabolismi erinevused, rühmade A ja B vahel täheldati b-alaniini. Aminohapete metabolismi erinevusi täheldati ka rühmade B ja C vahel. Lisaks näitasid glükoosi metabolismi protsessid, nagu glükolüüs ja glükoneogenees, rühmade B ja C vahel erinevaid suundumusi (joonis 7).

Transkriptoomide ja metaboolsete andmete visualiseerimine energia metaboolse raja kaardil

Visualiseerisime transkriptoomi ja metaboolsed andmed, et mõista energia metabolismi muutusi põhjalikult (joonis 8). Leiti, et glükolüüsi ja TCA tsükli metaboliidid akumuleeruvad rühmas B võrreldes rühmaga A, mis võib olla tingitud liigsest glükoosi sissevoolust ja rasvhapete metabolismi ülesreguleerimisest DKD-s. Aminohapete kontsentratsioon vähenes rühmas B võrreldes rühmaga A, mis peegeldab aminohapete metabolismi ülesreguleerimist (joonis 8a). Seevastu enarodustaat leevendas glükolüüsi metaboliitide kuhjumist glükolüüsi hõlbustatud voolu tõttu. Enarodustat muutis ka diabeedist põhjustatud muutused TCA tsükli metaboliitide ja aminohapete osas (joonis 8b). Veelgi enam, enarodustat leevendas glutatioondisulfiidi (GSSG) akumuleerumist diabeetilise neerukoes ja näitas seega kõrgemat glutatiooni / GSSG suhet, mis viitas sellele, et enarodustat leevendas DKD-s oksüdatiivset stressi (joonis 8a ja b). Oksüdatiivse stressi vähenemist kinnitas lipiidide peroksüdatsioonimarkeri malondialdehüüdi tase neerukortikaalses koes: enarodustaat muutis malondialdehüüdi akumuleerumise diabeetilises neerukoore koes (täiendav joonis S4). Kokkuvõttes on transkriptoomi- ja metaboolsete andmete integreerimine näidanud, et enarodustaat neutraliseerib DKD varases staadiumis esinevaid neeruenergia metabolismi muutusi.

Sümmeetrilised metabolismi muutused (diabeet vs enarodustaat) on kinnitatud alternatiivse mudeliga

Tegime transkriptoomianalüüsi alloksaanist indutseeritud diabeetilistel hiirtel, mis on veel üks diabeedi loommudel, et kinnitada oma tulemusi rotimudelis. Hiiremudeli uuringuprotokollid ja taustandmed on näidatud joonisel 9. Albumiini eritumine uriiniga suurenes märkimisväärselt B rühmas võrreldes A rühmaga, mille enarodustaat tühistas (joonis 9d). Lisaks kasutasime neeru glomerulide visualiseerimiseks põhjalikku 3-dimensioonianalüüsi (selged, takistusteta aju/keha pildistamise kokteilid ja arvutusanalüüs [CUBIC] – neer)16. Glomerulomegaalia oli märgatav rühmas B võrreldes A rühmaga, mille enarodustaat tühistas (joonis 9e). Alloksaanist indutseeritud diabeetiliste hiirte neerukoe transkriptoomanalüüs näitas sümmeetrilisi metabolismi muutusi (diabeet vs enarodustaat) samamoodi nagu STZ-indutseeritud diabeetilise roti mudelis (joonis 10): diabeet reguleeris rasvhapete metabolismi, samas kui glükoos. ainevahetust reguleeris enarodustaat. Lisaks reguleeris diabeet aminohapete metabolismi ja enarodustaat vähenes. Seega neutraliseeris enarodustaat neeruenergia metabolismi muutusi, mis esinesid DKD varases staadiumis nii alloksaanist põhjustatud diabeetilise hiire mudelis kui ka STZ-indutseeritud diabeetilise roti mudelis.

ARUTELU

Selles uuringus näitasime, et enarodustat (JTZ-951), suukaudne HIF-i stabilisaator, neutraliseerib neerude energia metabolismi muutusi, mis esinevad DKD varases staadiumis diabeedi roti- ja hiiremudelites. Transkriptoomide ja metaboolsete analüüsidega on näidatud sümmeetrilisi metabolismi muutusi neerukoes (diabeet vs enarodustaat): rasvhapete ja aminohapete metabolism oli DKD korral ülesreguleeritud, samas kui enarodustaat reguleeris neid radu alla ja lisaks glükoosi metabolismi (joonised 5–10).

Ei ole täielikult välja selgitatud, kas HIF-i stabiliseerimisel on kaitsev toime DKD patofüsioloogiale või mitte. Varasemad uuringud on näidanud, et diabeedi neerukude puutub kokku hüpoksiaga17 ja HIF-i ekspressioon diabeetilise neerukoes on ebapiisav, et reageerida nende hüpoksilistele seisunditele, mis on osaliselt põhjustatud oksüdatiivsest stressist.18 HIF-i stabiliseerimine koobaltkloriidiga parandas oksüdatiivse stressi seisundit ja vähendas proteinuuria ja tubulointerstitsiaalne kahjustus STZ-indutseeritud DKD korral.19 Loomkatsete tulemused näitasid ka, et HIF-i stabiliseerumine kaitses rasvumise eest,20 parandas insuliinitundlikkust20 ja alandas seerumi kolesteroolitaset.21 Need tulemused viitavad HIF-i stabiliseerimise kaitsvale toimele DKD. Seevastu teatati, et HIF-i suprafüsioloogiline stabiliseerimine von Hippel-Lindau deletsiooniga indutseerib neerufibroosi.22 HIF-i stabiliseerimise roll DKD progresseerumisel võib olla kontekstist sõltuv, võttes arvesse HIF-i pleiotroopset toimet ja erinevate DKD fenotüüpide olemasolu. Selle uuringu eesmärk oli selgitada HIF-i stabiliseerimise netomõju diabeetilise neeru energia metabolismile. Varasemad aruanded on näidanud, et DKD-s esinevad energia metabolismi muutused. Sas et al.10 näitasid suurenenud energia metaboolset voogu ja glükoosi metaboliitide kuhjumist diabeetilise neerukoore koes, mis võib olla seotud mitokondriaalse düsfunktsiooniga. You et al.23 teatasid, et fumaraat, TCA tsükli metaboliit, kogunes diabeetilise neerukoesse ja see aitas otseselt kaasa DKD progresseerumisele. Oleme varem näidanud, et TCA tsükli metaboliidid kuhjusid diabeetilise neerukoes, mis muudeti naatrium-glükoosi kaastransporter 2 inhibeerimise või kaloripiiranguga.11 Lisaks näitasid Qi et al.24, et glükolüütilistes radades sisalduvad ensüümid, sealhulgas püruvaatkinaas M2 (PKM2), olid I tüüpi diabeediga patsientidel, kellel ei olnud DKD-d, võrreldes DKD-ga patsientidega ülesreguleeritud. PKM2 aktiveerimine muutis glükolüüsi metaboliitide kuhjumise ja taastas mitokondriaalse funktsiooni, suurendades osaliselt glükolüütilist voolu.24,25 Need varasemad aruanded viitavad sellele, et glükolüüsi ja TCA tsükli metaboliitide akumuleerumine võib mõjutada DKD progresseerumist, mida saab leevendada hõlbustatud PKM2 glükolüüsiga. aktiveerimine. Meie uuringus muutis HIF-i stabiliseerimine enarodustaadiga energia metabolismi muutusi ja leevendas glükolüüsi ja TCA tsükli metaboliitide akumuleerumist diabeetilise neerukoore koes (joonis 8). Glükolüütiliste ensüümide, sealhulgas PKM2, ekspressiooni reguleeris ka enarodustat (täiendav joonis S4B). Lisaks leevendas enarodustaat GSSG akumulatsiooni ja suurendas glutatiooni / GSSG suhet, mis viitab sellele, et enarodustat leevendas DKD oksüdatiivset stressi (joonis 8). Seda enarodustaadist põhjustatud oksüdatiivse stressi vähenemist kinnitasid ka malondialdehüüdi taseme muutused neerukoore koes (täiendav joonis S4A). Need tulemused viitavad sellele, et HIF-i stabiliseerimisel peaks olema DKD patofüsioloogias kaitsev roll vähemalt metaboolsest vaatenurgast. On kindel, et me ei saa uurida, kas HIF-i stabiliseerimisega metaboolsel ümberprogrammeerimisel on otsene mõju DKD progresseerumisele, kuna HIF-i pleiotroopse rolli tõttu võib olla võimatu tuvastada ainevahetuse muutuste netomõju neerude tulemustele. Kuid meie uuringus leevendas enarodustaat seoses neerude energia metabolismi normaliseerimisega kerget albumiini eritumist uriiniga ja diabeedi põhjustatud neerupatoloogilisi kõrvalekaldeid (glomerulomegaalia ja glomerulaarse basaalmembraani paksenemine). Ekstraheerisime alloksaanist indutseeritud diabeetilise hiire mudeli mikrokiibi andmetest geenid, mille ekspressioonimuutused korreleerusid uriini albumiini tasemega (257 sondi; 232 geeni), ja viisime läbi raja rikastamise analüüsi (täiendav joonis S5). Selle tulemusena on mitokondriaalse membraani ja hingamisteede elektronide transpordiga seotud teed ülesreguleeritud seoses uriini albumiini tasemega, mis näitab, et mitokondriaalne koormus on tihedalt seotud albumiini eritumisega uriiniga. Seega on võimalik, et diabeetilise neerukoe metaboolne normaliseerimine HIF-i stabilisaatoritega võib vähendada mitokondriaalset koormust ja leevendada DKD progresseerumist. Meie andmed viitavad DKD patofüsioloogiale metaboolsest vaatenurgast järgmiselt: Hüperglükeemia tekitab energiavajaduse glükoosi reabsorptsiooniks neerude proksimaalsetes tuubulites; seega aktiveeritakse TCA tsükkel mitokondrites sunniviisiliselt, et rahuldada energiavajadust DKD varases staadiumis (rasvhapete ja aminohapete metabolismi ülesreguleerimine). Ja HIF-i stabilisaatorid võivad seda mitokondriaalset koormust leevendada metaboolse ümberprogrammeerimisega TCA tsüklist glükolüüsile (rasvhapete ja aminohapete metabolismi alareguleerimine ja glükolüüsi ülesreguleerimine), millel võib olla kaitsev roll DKD progresseerumise vastu. Vaja on täiendavaid uuringuid, sealhulgas üherakulisi omikaid, et selgitada, kuidas mitokondriaalne koormus neerukoes mõjutab otseselt DKD patofüsioloogiat. Veel üks huvitav küsimus on, kas HIF-i stabilisaatorid mõjutavad otseselt glükoosi imendumist proksimaalsetes tuubulites. Meie in vitro andmed näitasid, et enarodustaat vähendab oluliselt ATP tootmist metaboolse ümberprogrammeerimise kaudu TCA tsüklist glükolüüsile (joonised 1 ja 2). Arvestades, et ATP on vajalik glükoosi reabsorptsiooniks naatrium-glükoosi kaastransporteri 2 poolt, püstitasime esmalt hüpoteesi, et enarodustaat võib glükoosi reabsorptsiooni inaktiveerida. Kuid uriini glükoosisisaldus ei erinenud mõlemas loommudelis B- ja C-rühma vahel oluliselt (täiendav joonis S6). Tõenäoliselt on enarodustaadi ATP produktsiooni vähenemine füsioloogilises olukorras palju kergem võrreldes selle toimega in vitro; seega ei mõjuta HIF-i stabiliseerumine glükoosi imendumist naatrium-glükoosi kaastransporteri 2 kaudu, vähemalt meie loomkatsetes. Meie uuringul oli 2 piirangut. Esiteks kasutasime STZ-indutseeritud diabeetilisi rotte ja alloksaanist põhjustatud diabeetilisi hiiri varases staadiumis DKD mudelitena ning vaatlesime diabeetiliste seisundite lühiajalisi mõjusid. Kuid kliinilises keskkonnas manustatakse HIF-i stabilisaatoreid hilises staadiumis DKD-ga aneemiaga patsientidele. Vaja on rohkem uuringuid, et mõista HIF-i stabiliseerimise mõju neerude metabolismi muutustele DKD hilises staadiumis. Teiseks puudus uuringus piisav statistiline võimsus metaboliitide kontsentratsioonide hajumise osas metaboolsetes andmetes, samas kui transkriptsiooniandmete statistiline jõud oli piisavalt suur, et selgitada energia metabolismi kogu pilti. Kuna paljud metaboliidid ei näidanud olulist erinevust rühmade vahel, viisime läbi PLS-DA ja valisime metaboliidid, mille PLS-DA VIP skoor oli MSEA puhul suurem või võrdne 1-ga. Kuigi metaboolsete muutuste ristkontrollimine ainult metaboolsete andmete abil on keeruline, ühildusid metaboolsete analüüside tulemused transkriptoomiliste andmetega (joonised 7 ja 8), pakkudes täiendavat tuge transkriptoomiliste muutuste täheldatud mõjudele neeruenergia metabolismile. Kokkuvõtteks võib öelda, et enarodustat (JTZ-951), suukaudne HIF-i stabilisaator, neutraliseerib neerude energia metabolismi muutusi DKD varases staadiumis. Meie uuring viitab sellele, et HIF-i stabiliseerimine võib olla potentsiaalne sekkumine, mis on suunatud DKD-s düsreguleeritud neeruenergia metabolismile.

MEETODID

Mito stressitest ja glükolüütilise kiiruse test

HK-2 rakud külvati 96-süvendiga mikroplaadile tihedusega 1 x 10⁴rakud/kaev. Järgmisel päeval mõõdeti metaboolset voogu reaalajas Seahorse XFe96 analüsaatoriga (Agilent), kasutades Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) või Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent). Glükoosi, püruvaadi ja glutamiini kontsentratsioonid söötmes olid vastavalt 10 mmol/l, 1 mmol/l ja 2 mmol/l.

siRNA transfektsioon

HIF-1 knockdowni viis läbi Stealth RNAi inimese HIF1A jaoks (HSS104774 [#1] ja HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Negatiivse kontrollina kasutati Stealth RNAi siRNA negatiivset kontrolli Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific).

Western blotting

Peamised värvimiseks kasutatud antikehad olid inimese HIF-1-vastane antikeha (küüliku polüklonaalne, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) ja inimese aktiinivastane antikeha (küüliku polüklonaalne, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sekundaarne antikeha oli mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastane IgG antikeha (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Loomkatsed

Crl: CD (Sprague Dawley) rotid ja Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) hiired saadi ettevõttest Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Jaapan). Kõik katsed kiitis heaks Tokyo ülikooli institutsionaalse ülevaatenõukogu (kinnitusnumber P17-110). Kõik loomadega tehtavad protseduurid viidi läbi vastavalt riiklikele terviseinstituutide juhistele (laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhend). Uuringuprotokollid on näidatud joonistel 3 ja 9.

Transkriptoomi analüüs

Neerukoore koest kogu RNA eraldati GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich) abil. Kogu RNA (100 ng) märgistati madala sisendiga kiirvõimendi märgistuskomplekti (Agilent) abil ja seejärel hübridiseeriti SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (rottide jaoks; Agilent) ja SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (hiire jaoks) vastavalt. Kõik mikrokiibi katsed viis läbi DNA Chip Research Inc. (Tokyo, Jaapan). Toorandmeid töödeldi R-paketiga limma rakenduses Bioconductor (//www.bioconductor.org/), et teostada taustakorrektsioon ja andmete normaliseerimine kvantiilse normaliseerimise meetodi abil. Partiiefektid eemaldati rotikatses ComBat (Bioconductor) abil. Erinevalt ekspresseeritud geenid määrati │log2 FC│ väärtusega, mis oli suurem või võrdne 0,5 ja Q väärtus < 0,05.="" geeni="" ontoloogia="" ja="" kanoonilise="" raja="" analüüsid="" viidi="" läbi="" basespace="" correlation="" engine'i="" (illumina,="" san="" diego,="" ca)="" abil.="" mikrokiibi="" andmed="" on="" talletatud="" riiklikusse="" biotehnoloogia="" teabekeskusesse="" geeniekspressiooni="" koondkogu="" seeriatena="" gse131221="" (rott)="" ja="" gse139317="">

Geenikomplekti rikastamise analüüs

GSEA on arvutusmeetod, mis määrab, kas a priori määratletud geenide komplekt näitab statistiliselt olulisi ja ühtseid erinevusi kahe bioloogilise oleku vahel. GSEA viidi läbi kasutades GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Vääravastamise määraga < 0,25="" radu="" peeti="">

Metaboloomide analüüs

Metaboloomi mõõtmised viis läbi Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Jaapan). Metaboliitide kontsentratsioonid arvutati, normaliseerides iga metaboliidi piigi pindala sisestandardi pindala suhtes ja kasutades standardkõveraid, mis saadi 3-punktide kalibreerimisest. Vaadake ka täiendavaid meetodeid.

Metaboliitide komplekti rikastamise analüüs

Metaboolsete andmete analüüs viidi läbi integreeritud veebipõhise platvormi MetaboAnalyst 4 abil.0. Viidi läbi PLS-DA ja arvutati seotud VIP-skoorid. MSEA jaoks kasutati metaboliite, mille PLS-DA VIP skoor oli 1 või suurem.

Glomerulaarsete piirkondade kvantifitseerimine neerupatoloogiates

Tegime iga proovi perioodilise happe-Schiffi värvimispildist juhuslikult 3 patoloogilist pilti ja mõõtsime vastavalt iga glomerulaarpiirkonda, kasutades Fidžit (ImageJ jaotus; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

KUBIK-neer

Vastavalt meie varasematele dokumentidele viidi läbi CUBIC-i abil põhjalik 3-mõõtmeline glomerulite kujutis neerukoes. Lühidalt, fikseeritud hiire neerud sukeldati delipidatsiooniks CUBIC-L-i ja seejärel värviti immunofluorestsentsvärviga. Lõpuks sobitati murdumisnäitaja proovide paigutusega CUBIC-R plussis. Läbipaistvatest neerudest pärinevad põhjalikud 3D-mõõtmelised kujutised saadi spetsiaalselt ehitatud valguslehtfluorestsentsmikroskoopia abil (MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Jaapan). Peamine värvimiseks kasutatud antikeha oli podotsiinivastane antikeha (küüliku polüklonaalne, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Sekundaarne antikeha oli Alexa Flour 555- konjugeeritud eesli küülikuvastane IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Statistiline analüüs

Mitme võrdluse jaoks rakendati {{0}}viisi dispersioonanalüüsi, millele järgnes võimaluse korral post hoc Tukey mitme võrdluse test. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism 7 tarkvaraga (GraphPad Software, San Diego, CA). P < 0,05="" loeti="" statistiliselt="" oluliseks.="" andmed="" on="" esitatud="" kui="" keskmine="" ±="">

AVALIKUSTAMINE

MN on saanud honorare, nõustamistasusid või uurimistööd rahastanud KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer ja Alexion. TT on saanud JT-lt uurimistoetuse. Enarodustati (JTZ-951) pakkus JT, Tokyo, Jaapan. EAS ja HRU on RIKENile kuuluvate patentide kaasleiutajad. Osa sellest uuringust viidi läbi koostöös Olympus Corporationiga ja Bitplane'i toetatud lahke tarkvaraga. Teine autor ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

Oleme tänulikud dr Shuhei Yaole ja dr Shinji Tanakale väärtuslike arutelude eest. Täname ka dr Tsuyoshi Inoue, dr Satoru Fukuda ja pr Kahoru Amitani tehnilise toe eest. See töö viidi osaliselt läbi Tokyo ülikooli Isotoopide teaduskeskuse toetusel. Seda tööd toetas Jaapani Teaduse Edendamise Ühingu (JSPS) teadur (JSPS KAKENHI stipendium 19J11928 SH-le), teadusuuringute toetus (B) (JSPS KAKENHI stipendium 18H02824 MN-ile ), teadusuuringute toetus (C) (JSPS KAKENHI toetus 17K09688, TT) ja toetus innovatiivsete valdkondade teadusuuringuteks (KAKENHI toetus 26111003 MN-ile).