Abstraktne:Käesoleva uuringu põhieesmärk on diferentsiaalanalüüsi abil hinnata kolme Fusarium oxysporum'i suhtes tundliku või resistentse datlipalmisordi alkohoolsete ekstraktide fenoolide üldsisalduse erinevaid bioloogilisi aktiivsusi. sp Albidinis. Siin tõestati resistentses sordis Taabdount (TAAR) antioksüdantse ja bioaktiivse toimega stilbeeni tooteid. Lisaks sisaldab TAAR-resistentse datlipalmisordi metanoolifraktsioon märkimisväärset toodet, mis on määratud LCMS/MS ja 1H,13C NMR abil, mis kuulub hüdroksüstilbeenide perekonda, millel on antioksüdantne võime, inhibeerib seene türosinaasi aktiivsust ja aktiveerib. ja avaldab kaitsvat toimet hüpokloritist põhjustatud kahjustustele inimese dermaalsete fibroblastide vananenud rakkude 20S proteasoomides. Kokkuvõttes näitavad praegused tulemused, et resistentses Phoenix dactylifera L. sisalduvat hüdroksütolueeni tuleks uurida, et mõista, kuidas stilbeen võib avaldada vananemisvastast toimet.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja see suudab eemaldada reaktiivseid hapniku liike ja takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist, samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake rou cong rong eeliseid

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Märksõnad:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); antioksüdantne toime; türosinaasivastane aktiivsus; proteasoomi aktiveerimine; LC-MS/MS analüüs; stilbeeni derivaadid

1. Sissejuhatus

Datlipalm (Phoenix dactylifera L.) on mitmeaastane üheiduleheline põõsaste sugukonnast arecaceae. See puu on Lõuna- ja Kagu-Maroko Sahara elanikkonna elus ülimalt oluline nii majanduslikult kui ka sotsiaalselt. Bayoud' tõbi, mille põhjustab mullaseen Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], on viimastel aastatel märkimisväärselt vähendanud Maroko datlipalmide saaki [2]. Arvatakse, et FoA kadus kahest kolmandikust Maroko phoenicicoli pärandist, kuid hävitab jätkuvalt 4,5–12 protsenti kõrgeima kvaliteediga kaubanduslikest datlipalmide kultivaridest [2]. Selle haigusega võitlemiseks ja datlipalmi kaitsemehhanismide selgitamiseks on tehtud palju jõupingutusi [3]. Esimesed uuringud datlipalmi võimalike kaitsemehhanismide kohta on toonud esile fenoolsete ühendite ja antioksüdantse võime rolli FoA taluvuses [4,5]. Resistentsete ja tundlike juure fenoolsete ühendite kultivaride biokeemiline analüüs oli esimene biokeemiline uuring, mis selgitas datlipalmi kaitsemehhanismide eeliseid. Tõepoolest, kirjandus näitab, et resistentsete juurtega kultivarid on 5-kofeoüülšikimiinhappe ja selle asendiisomeeride poolest rikkamad kui tundliku juurega kultivarid [5]. Need ühendid on tõhusalt näidanud potentsiaalset seenevastast toimet in vitro FoA vastu [6].

Looduslike antioksüdantide suurepärane võime vabu radikaale eemaldada on see, mis põhjustab nende populaarsuse kasvu toidu- ja meditsiiniuuringutes [7–10].

Näiteks on reaktiivsed hapniku liigid rakukahjustusi ja vananemisprotsesse raskendavad tegurid [11] ning on seega seotud paljude haigustega. Selle tulemusena võivad antioksüdantide molekulid aidata inimeste tervist, ennetades degeneratiivseid haigusi ja aeglustades vananemise tagajärgi [12]. Selles uuringus oleme huvitatud antioksüdantide võimest soodustada 20S-proteasoomi aktiveerimist ja kaitsta selle oksüdatiivsete kahjustuste eest. Proteasoom aitab tõepoolest kaasa raku homöostaasi säilitamisele, võimaldades rakul kahjustatud valkude puhastamise protsessi ja lühiajaliste valkude kontrollitud hävitamist [13]. Seetõttu võib proteasoomi aktiveerimine antioksüdantidega osutuda uueks vananemisvastaseks strateegiaks [14]. Lisaks kavatseb see töö uurida FoA-le resistentsete juurte fenoolisisalduse potentsiaali aktiivsete bioloogiliste ühenditena.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Taimeproov

Uuring viidi läbi iga proovi puhul, kasutades materjali, mis pärineb 1 0 täiskasvanud datlipalmisordist (Phoenix dactylifera L.), mis on kasvatatud Maroko kaguosas Palmaria Figuigis asuvatelt saastunud või saastumata maatükkidest. Peamised juured (kaasa arvatud nende õhku hingavad juured) ulatuvad 0,5–2 cm läbimõõduga vastuvõtlikel sortidel, näiteks charas Bouffegous infected (BI) või nakatumata (BNI). Lisaks koguti FoA-resistentne kultivar Taabdount (TAAR) ja kahe ravimtaime lehti kasutati lokaalselt FoA vastase fülaktilise ravina. Lisaks koguti samasse saastumata maatükki ka rosmariin (R, Rosmarinus officinalis) ja granaatõun (G, Punica granatum L.) [15], mille käigus neid analüüsiti ja kasutati kontrollina. Proove võeti kahel perioodil aastas, septembris ja jaanuari lõpus (2013–2015) ning neid säilitati hermeetiliselt toatemperatuuril. Kuna proovid saadi palmerist, on need Maroko põllumajandusministri poolt nõuetekohaselt sertifitseeritud (identifitseerimine ja klassifitseerimine) [16].

2.2. Väljavõtete valmistamine

Pärast põhjalikku veega pesemist kuivatati juured või lehed varjus, seejärel jahvatati segistis. Iga proovi (BI, BNI, TAAR, R ja G) jaoks lisati 1 g kuivale materjalile 10 ml metanooli ja jäeti seejärel 4 tunniks toatemperatuuril segama. Seejärel need filtriti ja aurustati 37 °C juures pöördaurustiga. Kuivekstrakt pandi metanoolilahusesse lõppkontsentratsiooniga 10 mg/ml või 50 mg/ml (kasutati hiljem bioloogilise aktiivsuse määramiseks in vitro). Bioloogilise aktiivsuse analüüside jaoks viidi iga proovi jaoks läbi kolm sõltumatut ekstraheerimist.

2.3. Bioloogiline tegevus

2.3.1. Fenoolisisaldus ja antioksüdantide aktiivsus

Nacoulma jt poolt kirjeldatud protseduur. kasutati iga ekstrakti üldfenoolide ja flavonoidide kogusisalduse hindamiseks [17], kusjuures lõplikud mahud kohandati 200 µL juures, et neid saaks kasutada mikroplaadilugeris. Neelduvus lainepikkustel vastavalt 760 nm ja 510 nm määrati metanooliga pimekatse suhtes. Gallushappe (0–300 mg/L) (y=0,0083x pluss 0,9106, r2=0,978) ja kvertsetiini (0–100 mg/L) (y {{14) standardsed kalibreerimiskõverad Kasutati vastavalt }},0008x pluss 0,0597, r2=0,994).

Kasutades 1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasüüli vaba radikaali, uuriti antioksüdantide eemaldamise aktiivsust (DPPH). Kasutades lõplikku mahtude kohandamist vastavalt 300 µl ja 275 µl juures, et kasutada mikroplaadilugejat, hinnati ekstraktide võimet vähendada raua (III) sisaldust, nagu on kirjeldanud Nacoulma et al. [17]. Võrreldes metanooliga tühikatsega mõõdeti neeldumist vastavalt lainepikkustel 517 nm ja 700 nm. Seejärel, kasutades järgmist võrrandit, hinnati iga lahuse vabade radikaalide püüdmise aktiivsust inhibeerimise protsendina:

Standardne kalibreerimiskõver saadi, kasutades antioksüdandi standardina askorbiinhapet ({{0}}–100 mg/L) (y=0,0014x pluss 0,0875, r2=0,998).

2.3.2. FoAMyc heeliumi kasvu inhibeeriv test

Väikese modifikatsiooniga kasutati Neri et al. [18] kasutati selleks, et määrata, mil määral inhibeerisid puhtad kemikaalid FoA mütseeli kasvu. FoA 7-päevases kultuuris asetati Petri tassidele viiemillimeetrised seeneniidistiku kettad PDA söötmega, millele oli lisatud ülalloetletud puhtaid kemikaale 50, 75 ja 100 µg/ml. Plaate inkubeeriti 5 päeva temperatuuril 28 °C. FoA seeneniidistiku kasvu pärssimise hindamiseks kasutati koloonia keskmist läbimõõtu, mis mõõdeti kahe täisnurga all. Iga ravi koosnes kolmest testist, milles kasutati kolme erinevat FoA tüve: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgia) ja FoA Local (Palemeraie of Figuig, Maroko), samuti negatiivset kontrolli, kasutades söödet, mida polnud lisatud.

2.3.3. Rakkude elujõulisus ja 20S proteasoomi aktiivsus

Kasutati {{0}}-aastase mehe (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Saksamaa) normaalseid inimese nahafibroblaste, kusjuures rakud paigutati tihedusega 100,{{3 }} rakud/ml RPMI-s 10 protsenti, millele on lisatud 10 protsenti (mass/maht) FBS, 1 protsenti (mass/maht) L-glutamiini, 100 ühikut/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini. Neid hoiti valgetel või läbipaistvatel 96-mikrokaevude plaatidel 24 tundi temperatuuril 37 ◦C inkubaatoris, kus niisutatud keskkond oli 5 protsenti CO2. Proteasoomi aktiivsuse testiks, samuti hüpokloritist põhjustatud kahjustuste kaitsva toime hindamiseks töödeldi rakke seejärel testmaterjalidega (puhas ühend 5 kuni 50 µg/ml, positiivne kontroll 0,5 ja/või 1 µM, ja metanoolsed taimeekstraktid 15 kuni 50 µg/mL) 24 tunni jooksul maksimaalselt 0,3 protsendi DMSO-ga lõppkontsentratsioonis, samaaegselt ilma muutusteta negatiivse kontrolli osas. TAAR-i ekstrakti või puhaste ühendite kaitsva toime uurimine proteasoomi aktiivsusele tähendas, et fibroblastirakud allutati hiljem 35 minutiks 50 µM OCl− (valitud kui optimaalne, ilma raku toksilisuseta, 20S proteasoomi seisundi oksüdeerija-inhibiitor) [19]. Järgmised katseetapid viidi lõpule tarnija metoodikaga (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, USA): Esiteks, samaaegne rakkude elujõulisuse katse, milles kasutati kristallvioletset kolorimeetrilist või MTT analüüsi, mis viidi läbi absoluutselt sarnastes tingimustes. kasutati selle rakkude bioluminestsentsi testi normaliseerimiseks. Kuvatakse kahe erineva testi (n=6) kolmes korduses proovide standardhälbed ja keskmine fluorestsents. Kõik mõõtmised ja sõltumatud katsed (n=2) viidi läbi kaks korda.

2.3.4. Rakuvaba seente türosinaasi pärssiv toime

Et uurida mõju ensüümi aktiivsusele, eelinkubeeriti katsematerjale (puhtad antioksüdandid või metanoolsed taimeekstraktid) ensüümidega toatemperatuuril fosfaatpuhvris. Lühidalt, 300 ml 5 mM L-DOPA lahust 50 mM fosfaatpuhvriga (pH 6,5) koos või ilma erinevates kontsentratsioonides testitavate materjalideta. 96-süvendiga mikroplaat koos 100 ml seene türosinaasi vesilahusega (20 ühikut). 40 minutit inkubeeriti analüüsisegu temperatuuril 25 °C. Pärast inkubeerimist mõõdeti reaktsioonisegu dopakroomi tootmistaset spektrofotomeetriliselt 492 nm juures [20]. Standardne kalibreerimiskõver joonistati gallushappe (0–1000 µg/ml) abil (y=–0,087 × pluss 0,45; r2=0,97). Iga sõltumatu mõõtmine ja katse (n=2) viidi läbi kaks korda.

2.4. Analüüsid, isoleerimine ja struktuuri selgitamise protseduurid

Jahvatatud juur (20 g) ekstraheeriti 200 ml metanooliga, loksutati 24 tundi toatemperatuuril, filtriti, tsentrifuugiti 10,000 × g juures 15 minutit ja seejärel aurustati 35 ◦C juures pöörlevat seadet kasutades. vaakumaurustusseade. Toorekstrakt lahjendati 20 ml destilleeritud veega, ekstraheeriti uuesti 2 x 20 ml etüülatsetaadiga ja seejärel kontsentreeriti, kasutades rootorvaakumpaurutussüsteemi 35 °C juures. Põhiprodukt puhastati preparatiivse HPLC-ga, kasutades Waters C18 kolonni (SymmetryPrep 150 × 19 mm, osakeste suurus 7 µm) samade LC gradiendi tingimustega, mida kasutati eespool, ja voolukiirusega 5 ml/min. Piik toatemperatuuril oli vahemikus 38,8 kuni 40,8 minutit, koguti vahemikus 39,2 kuni 40,2 minutit; kogu kogumaht lüofiliseeriti, saades 27 mg ühendit. Seejärel tuvastasid MS ja NMR 1H ja 13C selle.

Analüüsid viidi läbi kiirresolutsiooniga LC 1200 seeria süsteemiga, kasutades diode massiivdetektorit (DAD), mida kasutati UV-spektrite jälgimiseks lainepikkusel 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Ühendite eraldamine viidi läbi Beckman C18 kolonnis (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, osakeste suurus 5 µm), kasutades 47-minutilist gradienti 10 mM ammooniumatsetaat/0,2% sipelghape vees (maht/maht), pH 2,9 ({{) 13}}lahusti A) ja 30/70 atsetonitriili/metanooli segu (=lahusti B). Voolukiirus oli 0,8 ml/min ja lahusti B tõsteti 5 protsendilt 35 protsendile 45 minutiga ja tasakaalustati uuesti 2 minuti jooksul. DAD-iga seerias kasutati ESI-QTOF 6520 seeriat (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) kõrge eraldusvõimega MS ja suunatud tandem-MS (MS/MS) analüüside jaoks. Spektrid saadi negatiivse ja kõrge eraldusvõimega (4 GHz) võtterežiimis.

1H NMR ja 13C NMR spektrid registreeriti Bruker Avance 300 spektromeetriga, mis töötas sagedusel 300 MHz. Vaba induktsiooni lagunemist töödeldi MestreLab Research SL-i MestreNova 5.3.2 NMR komplektiga.

2.5. Statistiline analüüs

Kõik sõltumatud katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Kõik andmed esitati keskmiste väärtustena ± SD. Kasutades programmi GraphPad Prism versiooni 6, analüüsiti tulemusi mitteparameetrilise Kruskal-Wallise testiga koos Dunni mitmekordse võrdlustestiga. P-väärtusi 0,05 ja madalamaid peetakse olulisteks.

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Metanooliekstraktide fenooli- ja flavonoidide kogusisaldus

Taimsetel fenoolühenditel on oma redoksomaduste tõttu leitud mitmesuguseid bioloogilisi mõjusid, sealhulgas antioksüdantset toimet [21]. Tabelis 1 on kujutatud FoA poolt nakatatud (BI) ja nakatamata (BNI) või Taabdount'ina (TAAR) resistentsete Bouffegous'i vastuvõtlike sortide metanoolijuureekstraktide fenoolisisaldus (500 µg/ml). Nende kontsentratsioon varieerus vahemikus 171 ± 14 kuni 253 ± 47 mg gallushapet ekv./g. Suurim kogus neid ühendeid leiti sordist BNI, madalaim kontsentratsioon aga BI metanoolijuureekstraktist. Flavonoidide arv nendes samades ekstraktides (tabel 1) varieerus vahemikus 240 ± 25 kuni 406 ± 66 mg kvertsetiini ekv./g ja taaskord omistati suurim kogus BNI sordile. Nakatamata (BNI) sortide ja nakatunud (BI) või resistentsete (TAAR) sortide vahelisest polüfenoolide ja flavonoidide koguarvust kaob FoA-le ligikaudu 1/3. Seetõttu on tähelepanuväärne kontrollida, kuidas taime antioksüdantse võimekuse seisukohalt kriitilise tähtsusega ühendite kadu võib mõjutada meid huvitavaid bioloogilisi aktiivsusi.

3.2. Metanooliekstraktide antioksüdantne potentsiaal

DPPH radikaale püüdev aktiivsus on meetod, mida laialdaselt kasutatakse taimeekstraktide antioksüdantse aktiivsuse skriinimiseks [22]. See test määrab, kas ekstraktides leiduvad antioksüdantsed kemikaalid on võimelised hävitama stabiilseid radikaaliliike DPPH. Eksperimentaalsed andmed (joonis 1) näitavad, et kõik metanooliekstraktid (100 või 500 µg/ml) eemaldavad tõenäoliselt vabu radikaale, millel on TAAR juurtes täheldatud kõrgeim DPPH eemaldamisaktiivsus (87,0). protsenti DPPH inhibeerimisest). Tundub, et antioksüdantne toime ei sõltu polüfenoolsete või flavonoidsete ühendite üldkogusest. TAAR-i juure metanooliekstraktide parem aktiivsus võib aga olla tingitud ekstraktis sisalduvatest rohkem vesinikku loovutavatest komponentidest.

Redutseerimisvõimet hinnatakse metanooliekstrakti võime järgi muuta Fe (III) Fe (II)-ks. Seda Fe (III) redutseerimisvõimet võib seostada fenoolsetes ühendites esinevate hüdroksüülrühmade arvu ja positsiooniga ning nende võimega annetada vesinikku [23]. Tabelis 2 on näidatud meie taimeproovide metanooliekstraktide redutseeriv toime võrreldes askorbiinhappega kui standard. TAAR juurte metanooliekstraktid sisaldavad kõrgeid redutseerimisi (95 ± 1 mg askorbiinhapet ekv./g), samas kui madalaim sisaldus saadi BNI juureekstraktidest (27 ± 2 mg askorbiinhapet ekv./g).

Saadud tulemuste korrelatsiooniks (korrelatsioonikordaja (R)) viidi läbi regressioonianalüüs. Leiti oluline lineaarne korrelatsioon üldfenooli- ja flavonoidide sisalduse (R {0}}.849, p < 0.05) ning DPPH ja redutseeriva võimsuse analüüsi vahel (R=0). 816, p < 0,05), kuid metanooliekstraktide fenooli- või flavonoidisisalduse ja nende antioksüdantse toime vahel ei olnud ühtegi. Lõpuks näitasid kõik metanooliekstraktid märkimisväärset antioksüdantset toimet DPPH radikaalide püüdmise ja vähendava võimsuse testi vastu, kuid need antioksüdandid ei tundu olevat seotud fenooli või flavonoidide kogusisaldusega. Seetõttu viitavad need leiud sellele, et vaadeldavate taimeekstraktide antioksüdantse toime eest vastutab tõenäoliselt teatud tüüpi kemikaal, mitte meie erinevates ekstraktides leiduvate fenoolsete või flavonoidsete ühendite kogus. Mõned fenoolsed komponendid, mida on eelnevalt kirjeldatud ja mis on väga aktiivsed isikud, võivad samuti mõjutada taimeekstraktide antioksüdantset aktiivsust: Sõltumata nende kontsentratsioonist võivad laagerdunud punases veinis leiduvad fenoolsed ühendid omada mitmesuguseid nende struktuuriliste aspektidega seotud antiradikaalseid omadusi. 24].

TAAR FoA-resistentsel sordil on erinevate datlipalmi sortide seas kõrgeim antioksüdantne aktiivsus. Kirjandusele viidates võib nende konkreetsete datlipalmide resistentsuse teket seostada kofeoüülšikimiinhappe erinevate positsiooniliste isomeeride hulga suurenemisega [5].

3.3. Seene türosinaasi aktiivsus

Seene türosinaasi difenolaasi aktiivsus katalüüsib kahe dopakinooni derivaadi oksüdatsiooni, mis viib melaniini sünteesini. Tabelis 3 esitatud tulemused näitavad TAAR, BI ja BNI metanooliekstraktides sisalduvate ühendite võimet häirida l-DOPA hüdroksüülimist seente türosinaasi aktiivsuse pärssimise kaudu. Lisaks näitavad need tulemused, et TAAR-i metanooliekstrakt on seente türosinaasi aktiivsuse suhtes statistiliselt aktiivsem kui BI (p < 0.05) ja BNI (p < 0,05) ekstraktid. Seega näib, et palmi datli juureekstraktide võime inhibeerida türosinaasi aktiivsust järgib sama suundumust, mis antioksüdantsete võimete puhul.

Türosinaase seostatakse peamiselt naha, silmade ja juuste pigmentatsiooniga. Tõepoolest, türosinaasid on melanogeneesi ensüümid, mis osalevad melaniini biosünteesi esimestes etappides, ja melaniini seostatakse kaitsega ultraviolettkiirguse (UV), päikese- või gammakiirguse eest, rakkude tundlikkuse vähenemisega ja rakuseina resistentsusega hüdrolüütiliste ensüümide vastu [20]. Seevastu melaniini ületootmine võib mängida rolli nahaanomaaliate või raskemate haiguste, nagu vähktõve (nt melanoom) korral, ning dopakinooni liig võib põhjustada neurodegeneratiivset haigust (nt Parkinsoni tõbi) [20,25]. Lisaks on teatatud, et melanogenees toodab vesinikperoksiidi ja muid ROS-e, jättes inimese melanotsüüdid kokku kõrge oksüdatiivse stressi tasemega [26]. Mitmed taimedest saadud looduslikud antioksüdandid (fenoolid, flavonoidid ja teised) pärssisid türosinaasi fenolaasi aktiivsust [27,28]. Siin näib TAAR-i ekstrakt sisaldavat ühendeid, mis võivad pärssida naha vananemist ja melanogeneesi.

3.4. Metanoolsete datlipalmi ekstraktide proteasoomne aktiivsus

On teatatud, et 20S proteasoomi kõrgenenud tase suurendab oksüdatiivse stressi taluvust [13]. Seetõttu uuriti proteasoomi aktiivsuse reguleerimist kultivaride BI, BNI ja TAAR juureekstraktidega. Mõõdetud 20S proteasoomi aktiivsus on seotud kümotrüpsiinitaolise (CT-L) aktiivsusega NHDF-iga vananenud rakkudes (vt Materjalid ja meetodid). Nagu on näidatud joonisel fig 2A, ilmnesid 24 tunni jooksul 50 µg/ml metanooliekstraktidega töödeldud rakkudel BI- ja TAAR-ekstraktide CT-L märkimisväärne aktiveerimine ja BNI inhibeerimine, tekitamata rohkem kui 30 protsenti raku toksilisust. TAAR juureekstrakt näitas kaasahaaravat proteasoomi aktivatsiooni võrreldes 1 µM lipoehappega (Ct pluss) (vastavalt 212 protsenti ja 248 protsenti). Proteasoom on silindriline proteinaasikompleks, mis sisaldab nelja virnastatud tsükli südamikku, mis vastutavad ebanormaalselt lagunenud (26S) proteasoomi ja oksüdatiivselt (20S proteolüütilise tuuma kompleksi) kahjustatud valkude eemaldamise eest (Ciechanover, 1998). Nagu on näidatud Hwangi töös [29], võib proteasoomi düsfunktsioon aidata kaasa inimese naha vananemisele. Tõepoolest, on näidatud, et vananevatel ja replikatiivsetel vananevatel rakkudel on vähenenud proteasoomi aktiivsus ja proteasoomi subühikute valgu tase. Asjaolu, et neisse rakkudesse kogunesid sagedamini nii oksüdeeritud kui ka/või kahjustatud rakuvalgud, viitab sellele, et ubikvitiini-proteasoomi valgu lagunemise rada on seotud sisemiste vananemisprotsessidega. Joonised fig 2B ja C näitavad TAAR metanooliekstrakti võimet kaitsta NHDF-iga vananenud rakke 20S proteasoomi aktiivsuse pärssimise eest OCl-oksüdandi poolt. Tõepoolest, OCl− oksüdant inhibeerib 50 protsendi ulatuses kontrollrakkude (Ct) proteasoomi aktiivsust, samas kui kõrgeim 20S-proteasoomi aktivaator (lipoehape 1 µM juures, Ct pluss), mille inhibeerimisaktiivsus on üle 50 %, ei suuda inhibeerimist tagasi pöörata. 20S proteasoomi aktiivsusest OCl− poolt, samas kui kõik teised testitud kontsentratsioonid (15, 50 ja 75 µg/mL) TAAR metanooliekstrakti näivad selle inhibeerimise ümber pööravat (0 kuni 19 protsenti inhibeerimisest). Need tulemused viitavad sellele, et TAAR-i juureekstraktid võivad sisaldada molekule, mis võivad naha vananemist edasi lükata mitte ainult proteasoomide aktiivsuse suurendamise, vaid ka oksüdeerivate ainete inhibeeriva toime vastu. Nende molekulide hulgas on kõige tõenäolisemalt kofeoüülšikimiinhapet, aga ka muid ühendeid. Lisaks on ekstraktide peamiste ühendite tuvastamiseks läbi viidud LC-DAD-MS (MS) ja NMR analüüsid ning neid käsitletakse järgmises osas.

3.5. Spektromeetrilised analüüsid

3.5.1. Metanooliekstraktide LC-DAD-MS analüüs

Datlipalmi juurte võrdlev uuring ei näidanud kvalitatiivseid erinevusi, kuid selle asemel täheldati teatud määral poolkvantitatiivseid erinevusi (DAD ja MS kromatogrammides) kultivaride vahel (joonis 3A, D). Tõepoolest, praegused tulemused ei võimalda seost datlipalmide vastupidavuse vahel kofeoüülšikimiinhappe erinevate positsiooniliste isomeeride koguse suurenemise vahel, kuna resistentsel kultivaril (TAAR) on nende ühendite suhteline arvukus madalaim (joonis 3C). Kõik kolm kofeoüülšikimiinhappe positsiooniisomeeri (m/z=335.0768 veaga 1,2 ppm) tuvastati nende MS/MS spektrite järgi (joonis S6) fragmendiga m/z 179,0340, mis vastab kohvhappe fragmendile A (C9H7O4) ja fragmendile m/z juures 135,0443, mis vastab kohvhappe dekarboksüülimisele (C8H7O2). Sellegipoolest näib erinevate kultivaride vahel selgelt eristuvat veel üks ühend, mis ei vasta kofeoüülšikimiinhapetele (joonis 3C) ja mille retentsiooniaeg on 29 min m/z=259.0607 (või TFA adukti puhul 373,0543 korral). (Joonis 3D). Selle ühendi akumuleerumise erinevus tundlike ja resistentsete kultivaride juurtes (0,135 protsenti) suhtega umbes 1:35 (alates m/z=259.06, MS andmed) võib seletada silmapaistvat bioloogilist põhjust. selle juure metanooliekstrakti puhul täheldatud tegevused.

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】