Abstraktne:Kvertsetiini on selle Alzheimeri tõve (AD) ja vananemisvastase toime tõttu põhjalikult uuritud. Meie varasemad uuringud on leidnud, et kvertsetiin ja selle glükosiidvorm rutiin võivad moduleerida proteasoomi funktsiooni neuroblastoomirakkudes. Meie eesmärk oli uurida kvertsetiini ja rutiini mõju aju intratsellulaarsele redoks-homöostaasile (redutseeritud glutatioon / oksüdeeritud glutatioon, GSH / GSSG), selle korrelatsiooni saidi APP lõhustava ensüümi 1 (BACE1) aktiivsusega ja amüloidi prekursorvalguga (APP) ekspressioon transgeensetel TgAPP hiirtel (kandes inimese rootsi mutatsiooni APP transgeeni, APPswe). Lähtudes sellest, et BACE1 valgu ja APP töötlemist reguleerib ubikvitiini-proteasoomi rada ja et GSH-ga täiendamine kaitseb neuroneid proteasoomi inhibeerimise eest, uurisime, kas kvertsetiini või rutiini (30 mg/kg/päevas, 4 nädalat) sisaldav dieet vähendab mitmeid. AD varased tunnused. Loomade genotüpiseerimise analüüsid viidi läbi PCR abil. Intratsellulaarse redoks-homöostaasi määramiseks kasutati spektrofluoromeetrilisi meetodeid GSH ja GSSG tasemete kvantifitseerimiseks, kasutades o-ftaaldehüüdi, ning määrati kindlaks GSH / GSSG suhe. TBARS-i tasemed määrati lipiidide peroksüdatsiooni markerina. SOD, CAT, GR ja GPx ensüümi aktiivsus määrati ajukoores ja hipokampuses. BACE1 aktiivsust mõõdeti sekretaasi-spetsiifilise substraadiga, mis oli konjugeeritud kahe reportermolekuliga (EDANS ja DABCYL). Peamiste antioksüdantsete ensüümide: APP, BACE1, disintegriini ja metalloproteinaasi domeeni sisaldava valgu 10 (ADAM10), kaspaasi-3, kaspaasi-6 ja põletikuliste tsütokiinide geeniekspressioon määrati RT-PCR abil. Esiteks vähendas APPswe üleekspressioon TgAPP hiirtel GSH / GSSG suhet, suurendas malonaldehüüdi (MDA) taset ja üldiselt vähendas peamise antioksüdantse ensüümi aktiivsust võrreldes metsiktüüpi (WT) hiirtega. TgAPP hiirte töötlemine kvertsetiini või rutiiniga suurendas GSH / GSSG-d, vähendas MDA taset ja soodustas ensüümi antioksüdantide võimet, eriti rutiiniga. Teiseks, nii APP ekspressioon kui ka BACE1 aktiivsus vähenesid TgAPP hiirtel kvertsetiini või rutiiniga. ADAM10 puhul kippus see rutiinravi korral TgAPP hiirtel suurenema. Mis puudutab kaspaas-3 ekspressiooni, siis TgAPP näitas tõusu, mis oli rutiiniga vastupidine. Lõpuks vähendasid nii kvertsetiin kui ka rutiin põletikumarkerite IL-1 ja IFN- ekspressiooni suurenemist TgAPP hiirtel. Kokkuvõttes näitavad need leiud, et kahest flavonoidist võib rutiini lisada igapäevasesse dieeti AD-i adjuvantravi vormina.

Klõpsake valikul Antioksüdantide Cistanche Chemist Warehouse

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Märksõnad:kvertsetiin; rutiin; glutatioon; APPswe; BACE1; Alzheimeri tõbi

1. Sissejuhatus

Kognitiivse funktsiooni langus on põhiline kliiniline neurodegeneratsiooni sümptom, mis on rangelt seotud vanusega [1]. Toitumise mõju vanusega seotud kognitiivsele langusele on üha kasvav teema, kuna see on oluline tegur, mida saab kergesti muuta. Kognitiivse languse ajal täheldatud patoloogilised muutused ajus leiavad aset palju enne kliinilist ilmingut, mis esineb enamasti vanemas eas. See annab pikema perioodi ennetusstrateegiate väljatöötamiseks vanusega seotud kognitiivsete funktsioonide languse ja dementsuse kohta, mis on rahvatervise peamine probleem [2]. Kognitiivseid võimeid parandava teraapia osas on aastaid intensiivselt uuritud looduslikku päritolu ühendeid, mida leidub igapäevases dieedis [3].

Üks levinumaid vanusega seotud neurodegeneratiivseid haigusi on Alzheimeri tõbi (AD), mida iseloomustavad kaks neuropatoloogilist tunnust: amüloid- (A ) naastud ja neurofibrillaarsed puntrad. Loomade uurimisel võivad loommudelid simuleerida AD asümptomaatilist faasi, muutes näiteks A prekursorvalku (APP) [4, 5].

Tähelepanuväärne on, et amüloid- (A ) peptiidiga mittekovalentsete komplekside moodustamiseks on sõelutud mitmeid taimedest saadud bioaktiivseid fütokemikaale, mis on seotud erinevate tervisega seotud eeliste ja paljude haiguste vähenenud riskiga [3].

Kuigi paljud traditsioonilised ravimid ja looduslikud dieettooted on näidanud suuri edusamme AD patoloogia leevendamisel, oleme täielikult teadlikud AD loommudelite piirangutest, kuna nende ainete paljutõotavad mõjud ei ole alati inimuuringutes korratavad [6]. Inimeste ajukoe analüüsimise raskuste tõttu, eriti progresseerumise väga varases staadiumis, on aga vajalikud uuringud näriliste mudelitega. Selle tulemusena võivad need eksperimentaalsed mudelid toetada traditsiooniliste ravimite ja ohutute looduslike ühendite väljatöötamist, et aeglustada neurodegeneratiivsete haiguste progresseerumist. Seega peaks prioriteediks olema igapäevases dieedis leiduvate looduslike ühendite testimine haiguste ennetamiseks ja kaitseks AD riski eest.

Nende oluliste looduslike ainete hulgas on kvertsetiin, mis on mitmete puu- ja köögiviljade peamine polüfenoolne flavonoid [7]. Kvertsetiin esineb peamiselt glükosiidi kujul, st rutiinina. Rutiin (kvertsetiin-3-O-rutinosiid) on omalt poolt avaldanud sügavat mõju erinevatele rakufunktsioonidele, mis on mitmete patoloogiliste seisundite aluseks, nimelt antimikroobne, kantserogeenne, antitrombootiline, kardio- ja neuroprotektiivne. Neid farmakoloogilisi toimeid seostatakse peamiselt rutiini põletikuvastase ja antioksüdantse toimega. Tänu oma võimele läbida hematoentsefaalbarjääri ja/või selle metaboliite, on näidatud, et rutiin võib muuta neurodegeneratiivsete haiguste kognitiivseid ja käitumuslikke sümptomeid [8].

Meie varasemad uuringud on leidnud, et nii flavonoidid, kvertsetiin kui ka rutiin, mõjutavad erinevaid signalisatsiooniteid ja molekulaarvõrke, mis on seotud proteasoomi funktsioonide moduleerimisega neuroblastoomirakkudes [9]. Lisaks on näidatud, et BACE1 ekspressiooni ja APP töötlemist reguleerib ubikvitiini-proteasoomi rada [10] ja et täiendamine redutseeritud glutatiooniga (GSH) kaitses neuroneid proteasoomi inhibeerimise eest [11]. GSH vähenemine ajus on tavaline leid neurodegeneratiivsete haigustega (nt AD) patsientidel ja võib enne haiguse algust põhjustada neurodegeneratsiooni [12]. BACE1 ubikvitineerimine ja ubikvitiini-proteasoomi raja blokeerimine inhibeerib BACE1 lagunemist ja viib sellest tulenevalt BACE1 ensümaatilise aktiivsuse suurenemiseni [10].

Tuginedes nendele leidudele ning sellele, et toitumisharjumused ja toidulisandid võivad mõjutada raku redoksseisundit, püüdsime uurida kvertsetiini või rutiini sisaldava dieedi mõju aju rakusisesele redoks-homöostaasile (GSH/GSSG), selle korrelatsiooni BACE1 aktiivsusega, ja APP ekspressioon AD hiiremudelites (kandes inimese rootsi mutatsiooni Amyloid Precursor Protein APP transgeen, APPswe).

Lõpuks, kuna on veenvaid tõendeid flavonoidlisandite mõju kohta spetsiifiliste kognitiivsete domeenide ja/või MRI leidude parandamisel [13], püüdsime loomadel jäljendada sekkumist, pakkudes tervislikku toitumist, mis sisaldab mõõdukas koguses teatud potentsiaalset aktiivset ainet. koostisosa (kvertsetiin või rutiin) kui tõhus strateegia AD-markerite ekspressiooni ennetamiseks.

2. Tulemused

2.1. Hiirte genotüpiseerimine

TgAPP hiirekoloonia töötati välja meie laboris Tg2576 heterosügootsetest isastest ja metsiktüüpi emasloomadest. Transgeensete isendite tuvastamiseks viidi läbi hiirte genotüpiseerimine. Kõigist testitud hiirtest leiti, et ligikaudu 40 protsenti olid transgeensed (TgAPP).

Saadud PCR-produktid eraldati elektroforeesiga 1,5-protsendilistes agaroosgeelides 0,5X TBE (Tris-Borate-EDTA) puhvris pingel 70 V (konstantne pinge) ja seejärel pildistati GelRediga (Millipore) värvides. Nii transgeensete kui ka WT hiirte amplifikatsiooniprofiil on näidatud joonisel 1.

2.2. Glutatioon

Intratsellulaarse redoks-homöostaasi hindamiseks TgAPP hiirte neuronites kvantifitseeriti GSH ja GSSG tasemed ning GSH / GSSG suhe määrati raku redutseeriva jõu markerina nii meestel kui ka naistel (joonis 2).

Transgeeni mõju hindamisel glutatioonisüsteemile täheldati TgAPP hiirtel raku redutseeriva võimsuse (GSH/GSSG) langust WT loomade puhul nii isas- kui emasloomadel ning mõlemal ajupiirkonnal (joonis). 2C3, H3), eriti hipokampuses. Nii WT kui ka TgAPP hiirtel oli GSH/GSSG suhe isastel oluliselt madalam kui emastel (joonis 2C3, H3; p < 0,05). Kui TgAPP naistel on see langus tingitud madalamast GSH tasemest (joonis 2C1, H1), siis TgAPP meestel on see enamasti tingitud GSSG taseme tõusust (joonis 2C2, H2).

TgAPP hiirte GSH ja GSSG taseme muutused kvertsetiini või rutiiniga töötlemisel on meestel silmatorkavamad kui emastel. Näib, et kvertsetiin kipub suurendama GSH taset (joonis 2C1, H1; p < 0.05) ja rutiin alandama GSSG taset (joonis 2C2, H2; p < 0,05).

Kvertsetiini ja rutiiniga ravi nii isastel kui ka emastel suutis tagasi pöörata GSH / GSSG suhte languse hipokampuses (joonis 2H3), kus redoksvõimsuse taastumine oli märkimisväärne võrreldes töötlemata TgAPP hiirtega. Meestel saavutas see indeks samasugused väärtused kui WT hiirtel hipokampuses (H3). Emastel, kuigi seda suhet ei suurendata WT hiirte omaga võrreldes, suurendas kvertsetiini ja rutiiniga töötlemine seda oluliselt võrreldes TgAPP hiirte omaga nende hipokampuses (H3: kvertsetiin, p < 0). 6}}01; rutiin, p < 0,05).

2.3. Tiobarbituurhappega reaktiivsed ained (TBAR)

TBAR-ide tasemed määrati lipiidide peroksüdatsiooni markerina. Kasutades kalibreerimiskõveraid, väljendati tulemused malondialdehüüdi (MDA) kontsentratsioonina (joonis 3).

Pärast APP üleekspressiooni täheldati MDA taseme olulist tõusu võrreldes WT hiirtega nii ajukoores (joonis 3C) kui ka hipokampuses (joonis 3H) ning nii isas- kui ka emasloomadel (p < 0,001) .

TgAPP emasloomadel taastasid nii kvertsetiini kui ka rutiinravi MDA tasemed peaaegu samale tasemele kui WT hiirtel (joonis 3C, H). TgAPP isastel taastavad nii kvertsetiini kui ka rutiinravi MDA tasemed samale tasemele kui WT hiirtel ajukoores (joonis 3C) ja vähenevad veelgi hipokampuses (joonis 3H). Nii ravimata kui ka flavonoiddieediga ravitud WT ja TgAPP hiirtel olid MDA tasemed soost sõltuvad (joonis 3C, H; p < 0,05), välja arvatud kvertsetiiniga töödeldud TgAPP hiirtel hipokampuses.

2.4. Ensüümi aktiivsus ja antioksüdantsete ensüümide ekspressioon

Et selgitada välja, kas kvertsetiini või rutiini dieedil toimub ensümaatilise aktiivsuse või peamiste antioksüdantsete ensüümide geeniekspressiooni reguleerimine või mõlemad, määrati ensümaatiline aktiivsus ja mRNA tase.

Joonisel 4 on näidatud SOD, CAT, GR ja GPx ensüümi aktiivsus, mis on määratud emastel ja isastel hiirtel ajukoores (joonis 4a) ja hipokampuses (joonis 4b).

APP üleekspressiooni tagajärjel täheldati TgAPP hiirtel ainult olulist CAT aktiivsuse langust võrreldes WT hiirtega nii ajukoores (joonis 4a(C2); p < 0.05) ja hipokampus (joonis 4b(H2); p < 0,05).

Kvertsetiinravi ei põhjustanud uuritud ajupiirkondades olulisi erinevusi ensüümi aktiivsuses võrreldes TgAPP hiirtega, isastel ega emastel. Seevastu rutiiniga ravitud loomadel suurenes CAT aktiivsus ajukoores (joonis 4a (C2)) ja GR aktiivsus hipokampuses (joonis 4b (H3)) nii isastel kui ka emastel (p < 0 .05). Lisaks suurendas rutiin hipokampuse CAT aktiivsust TgAPP meestel (joonis 4b (H2)) ja GPx aktiivsust naistel (joonis 4b (H4)).

Joonisel 5 on näidatud peamiste antioksüdantsete ensüümide SOD, CAT, GR ja GPx geeniekspressioon, mis on määratud emastel ja isastel hiirtel ajukoores (joonis 5a) ja hipokampuses (joonis 5b).

Peamiste antioksüdantsete ensüümide puhul ei täheldatud erinevusi geeniekspressioonis TgAPP ja WT hiirte vahel (joonis 5a, b). Rutiiniga ravitud TgAPP isastel ilmnes CAT ekspressiooni märkimisväärne suurenemine hipokampuses (joonis 5b (H2)). Hipokampuse GPx puhul täheldati CAT-ga sarnast mustrit, kuigi suurenemine ei olnud märkimisväärne (joonis 5b (H4)).

2.5. APP töötlemine: BACE1 ja ADAM10

BACE1 ensüümi aktiivsuse tulemused nii isaste kui ka emaste ajukoores ja hipokampuses on näidatud joonisel 6, väljendatuna aktiivsuse protsentides töötlemata TgAPP hiirtel.

Joonisel 6 leiti, et BACE1 ensüümi aktiivsus TgAPP hiirtel suurenes umbes 10 protsenti võrreldes WT hiirtega nii uuritavates ajupiirkondades kui ka mõlemast soost ning leiti, et see on statistiliselt oluline (p < 0,05).

Transgeensetel hiirtel täheldatud aktiivsuse suurenemist vähendasid nii kvertsetiini kui ka rutiinravi nii ajukoores kui ka hipokampuses. Sellegipoolest võis siiski märkida, et rutiini toime oli meestel veidi suurem kui kvertsetiini oma.

Kui BACE1 aktiivsus oli teada, otsustasime läbi viia transgeense loommudeli peamise tunnuse APP ja selle peamiste töötlemisensüümide BACE1 ja ADAM10 geeniekspressiooni uuringu. Joonisel 7 on näidatud tulemused, mis saadi emastel ja isastel hiirtel nii ajukoores kui ka hipokampuses.

Mõlema soo puhul täheldati WT hiirtel APP ekspressiooni olulist suurenemist üle 85%, mis näitab geeni üleekspressiooni mõlemas ajukoores (joonis 7C1; p < 0.05) ja hipokampuses (joonis 7H1; p < 0.05). Kvertsetiini ja rutiiniga töötlemine suutis seda ekspressiooni vähendada rohkem kui 45 protsenti (p < 0,05) nii isaste kui ka emaste hiirte puhul mõlemas uuritavas ajupiirkonnas (joonis 7C1, H1), kusjuures mõju oli märgatavam hipokampuses. Joonis 7H1).

Mis puutub BACE1 valgu ekspressiooni, siis kuigi BACE1 aktiivsust muudeti, ei olnud transgeensete ja mittetransgeensete hiirte vahel olulisi erinevusi, sõltumata soost ja uuritud flavonoidravist.

Seega hindasime ADAM10 ekspressiooni, mis oli seotud APP mitteamüloidogeense töötlemisega. Kuigi muutused ADAM10 ekspressioonis TgAPP hiirtel võrreldes WT hiirtega ei olnud statistiliselt olulised, täheldati kerget langust. Seoses flavonoidraviga näitas rutiin ADAM10 ekspressiooni suurenemist nii meestel kui naistel ning mõlemas ajupiirkonnas (joonis 7C3, H3).

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】