Perifeerse treenitud immuunsuse esilekutsumine kõhunäärmes stimuleerib kasvajavastast aktiivsust, et kontrollida kõhunäärmevähi progresseerumist, 1. osa

Vaatamata immunoteraapia märkimisväärsele edule paljude vähitüüpide puhul, ei ole pankrease duktaalne adenokartsinoom veel kasu toonud. Kaasasündinud immuunrakud on kasvajavastases immuunseires kriitilise tähtsusega ja hiljutised uuringud on näidanud, et neil populatsioonidel on teatud tüüpi mälu, mida nimetatakse treenitud kaasasündinud immuunsuseks, mis tekib transkriptoomilise, epigeneetilise ja metaboolse ümberprogrammeerimise kaudu.

Siin demonstreerime, et pärmist saadud tahked -glükaan, treenitud immuunsuse indutseerija, liigub kõhunäärmesse, mis põhjustab CCR2-sõltuva monotsüütide/makrofaagide sissevoolu pankreasesse, millel on treenitud immuunsuse tunnused. Neid rakke saab aktiveerida kokkupuutel kasvajarakkude ja kasvajast pärinevate teguritega ning neil on suurenenud tsütotoksilisus pankrease kasvajarakkude suhtes. Pankrease duktaalse adenokartsinoomi ortotoopilistes mudelites on -glükaaniga ravitud hiirtel kasvajakoormus oluliselt vähenenud ja elulemus on pikenenud, mis suureneb veelgi, kui seda kombineerida immunoteraapiaga. Need leiud iseloomustavad perifeerse treenitud immuunsuse dünaamilisi mehhanisme ja lokaliseerimist ning tuvastavad treenitud immuunsuse rakenduse vähi vastu.

Immuunsusel on palju funktsioone, näiteks vanade ja kahjustatud rakkude puhastamine: immuunsüsteem suudab puhastada ka vanu ja kahjustatud rakke, sealhulgas kasvajarakke, et kaitsta keha haiguste eest. Samuti suudab see hoida keha tasakaalu: immuunsüsteem suudab tasakaalustada ka keha sisekeskkonda, säilitada tasakaalu immuunrakkude vahel ning vältida selliste haiguste teket nagu ülereageerimine või immuunpuudulikkus, seega on immuunsus inimorganismile väga oluline.

Samal ajal avastasime, et Cistanche deserticola võib parandada ka immuunsust. Cistanche on rikas mitmesuguste bioloogiliselt aktiivsete koostisosade, näiteks polüsahhariidide, flavonoidide, steroolide jne poolest. Need koostisosad võivad stimuleerida immuunrakkude aktiivsust organismis, tugevdada rakulist immuunsust ja humoraalset immuunsust ning pärssida viiruste ja viiruste kasvu ja paljunemist. bakterid. Parandada organismi vastupanuvõimet ja immuunsust. Lisaks on Cistanche'il ka antioksüdantne, põletikuvastane ja rahustav toime, mis võib aidata leevendada füüsilist väsimust ja kõrvaldada stressi, et tugevdada immuunsust.

Klõpsake, et teada saada cistanche deserticola toidulisandit

Pankrease ductal adenokartsinoomi (PDAC) diagnoos on laastav, ainult 10 protsenti patsientidest on viimase 5 aasta jooksul ellu jäänud1. Kuigi ellujäämise määr on alates 2014. aastast kasvanud 6 protsendilt 10 protsendile, on kõhunäärmevähk enamiku praegu saadaolevate ravimite suhtes vastupidav.

Lisaks eeldatakse, et Ameerika Ühendriikide demograafilise muutuse tõttu saab kõhunäärmevähk 2030. aastaks teiseks vähiga seotud suremuse põhjuseks ja on seega arstidele oluline tuleviku väljakutse2. Kõhunäärmevähk on eriti surmav, kuna varajases staadiumis esineb harva kliinilisi sümptomeid, mistõttu 75–80 protsendil patsientidest diagnoositakse kaugelearenenud, mitteopereeritav haigus3,4. Isegi patsientidel, kellel on õigus resektsioonile, on 5-aastane elulemus vaid 20–25 protsenti 4. Lisaks on kõhunäärmevähk vähe reageerinud immunoteraapiatele, mis on näidanud märkimisväärset mõju teiste tahkete kasvajate korral5–9. I ja II faasi kliinilised uuringud, milles kasutati CTLA-4 ja PD-1 inhibiitoreid nii eraldi kui ka kombinatsioonis, on peetud PDAC ravis ebaefektiivseks, mis on tõenäoliselt seletatav PDAC10 mitteimmunogeense olemusega. 12.

Immunoteraapia eduka rakendamise suur väljakutse PDAC-is on immunosupressiivse pankrease kasvaja mikrokeskkonna (TME) ületamine. PDAC-d iseloomustab tihe kasvajat soodustav desmoplastiline strooma, immunosupressiivsete rakkude alamhulkade rohkus selles stroomas, nagu kasvajaga seotud makrofaagid (TAM), regulatoorsed T-rakud (T-reg) ja müeloidist pärinevad supressorrakud (MDSC) , aktiveeritud kasvajavastaste immuunrakkude puudus ja hüpervaskulaarsus, mis loob hüpoksilise mikrokeskkonna 13–16. Üheskoos muudavad need tingimused erakordselt keeruliseks immuunteraapiate tõhusa toimetamise kõhunäärmesse ja nende ravimite eduka aktiveerimise kasvajavastase immuunvastuse korral, kui need sinna jõuavad. Seetõttu on hädasti vaja uudseid ravimeid, mis ei saa mitte ainult spetsiifiliselt sihtida kõhunääret, vaid võivad tungida ka tihedasse desmoplastilisse strooma ja on võimelised esile kutsuma tugevaid kasvajavastaseid immuunvastuseid vaatamata immunosupressiivsele TME-le.

Treenitud kaasasündinud immuunsus on evolutsiooniliselt iidne immunoloogilise mälu programm, mida on hiljuti põhjalikult uuritud. On näidatud, et treenitud kaasasündinud immuunrakud läbivad transkriptoomilise, epigeneetilise ja metaboolse ümberprogrammeerimise pärast kokkupuudet spetsiifiliste esialgsete stiimulitega ning kui need kaasasündinud immuunrakud puutuvad uuesti kokku sekundaarse heteroloogse stiimuliga, "koolitatakse" neid paremini reageerima sellele stiimulile, mis väljendub suurenenud põletikulises vastuses17–19. Paljud bioloogilised ravimid võivad esile kutsuda treenitud immuunsuse, sealhulgas Bacillus Calmette-Guérini (BCG) vaktsiin ja looduslik ühend - glükaan. Kuigi enamik koolitatud immuunsust käsitlevaid uuringuid keskendub sekundaarse stiimulina patogeenidele, nagu bakterid ja viirused, näitavad uued uuringud, et kasvajarakud võivad ka treenitud immuunrakud uuesti aktiveerida. Kõik senised uuringud on kasutanud nahaaluseid vähimudeleid, mistõttu ei ole teada, kas koolitatud kaasasündinud immuunrakkude olemasolu võib avaldada kasvajavastast toimet tahkete organite kasvajatele, näiteks kõhunäärmevähile20, 21.

Selles uuringus avastasime ootamatult, et intraperitoneaalselt (IP) süstitud pärmist pärinevad tahked glükaanid liiguvad suures osas kõhunäärmega. Glükaani otsene kaubitsemine kõhunäärmesse toob esile seni kirjeldamata raja perifeerse treenitud immuunsuse esilekutsumiseks. Lisaks kontrollisime hüpoteesi, et see inimkaubandus võib põhjustada kasvajavastase immuunsuse teket kõhunäärmevähi vastu. Arvestades enamiku ravi- ja immunoteraapiate ebaõnnestumist üksi ja kombinatsioonis PDAC-i ravimisel ning nende ravimite suunamise raskust kõhunäärmele, pakuvad meie leiud ühiselt potentsiaalset läbimurret mitte ainult otseselt kõhunäärme sihtimisel, vaid ka kasvajavastaste ravimite värbamisel. kaasasündinud immuunrakud immunoloogiliselt külma PDAC TME suhtes.

Tulemused

Pärmist saadud tahked osakesed -glükaan liigub eelistatavalt kõhunäärmesse.

On hästi dokumenteeritud, et bakteritest ja seentest pärinevate -glükaanide manustamine suurendab müeloidse liini suunas kalduvate vereloome eellaste ja multipotentsete eellasrakkude arvu ja sagedust, mis lõppkokkuvõttes toimib olulise sammuna tsentraalse ja perifeerse treenitud immuunsuse esilekutsumisel22. . Siiski ei ole veel näidatud, kus täpselt -glükaan pärast manustamist neid mõjusid avaldab.

Nendes uuringutes kasutati Saccharomyces cerevisiae'st saadud terveid glükaani osakesi (WGP), mis on 2–4 mikronit õõnsad pärmirakud, mis on valmistatud väga kontsentreeritud (1,3) -glükaanidest. WGP-glükaani üksikasjalikku iseloomustust on kirjeldatud ühes meie teisest uuringust. Erinevalt teistest treenitud immuunsuse jaoks kasutatavatest -glükaani vormidest on see preparaat ainulaadne selle poolest, et see on osakeste sisaldusega ja nõuab oma mõju avaldamiseks aktiivset fagotsütoosi. Selle osakeste -glükaani kaubitsemise hindamiseks märgistati WGP-ga (5-(4,6- Dichlorotriazinyl) Aminofluorestsein) (DTAF) ja süstiti metsiktüüpi (WT) C57BL/6 hiirtele IP. Kolm päeva pärast IP manustamist (3-päev WGP) koguti kops, põrn, kubeme- ja mesenteriaalsed lümfisõlmed, kõhuõõne rakud ja kõhunääre, pesti jääkülma PBS-ga, et pesta DTAFWGP kõhukelmest, mis võib on kleepunud elundi pinnale ja DTAF-WGP olemasolu igas elundis hinnati voolutsütomeetria abil. Kuigi DTAF-WGP kaubitsemine toimus mõningal määral põrna, mesenteriaalsete lümfisõlmede ja DTAF-WGP jääkainetega kõhuõõnes, ilmnes kõhunäärmes silmatorkav ja ootamatu DTAF-WGP esinemine (joonis 1a).

Selle kaubitsemise edasiseks hindamiseks ja veendumaks, et DTAF-märgis ei osalenud kaubitsemismehhanismis, märgistati WGP radioaktiivselt 89Zr-ga ja süstiti IP (joonis 1b) või inkubeeriti peritoneaalsete makrofaagidega, millele seejärel süstiti IP (joonis 1c). Hiiri pildistati PET/CT-skaneerimisega 48 tundi pärast süstimist ja 89Zr-WGP täheldatud eelistatud kuhjumise näitamiseks kõhunäärmes kasutati rohelisi ringe. Seejärel viidi läbi nekroskoopia ja mõõdeti iga organi radioaktiivne signatuur. Voolutsütomeetria andmete kohaselt viidi 89Zr-WGP suurtes kogustes pankreasesse ja seda leiti madalamal tasemel põrnas, maksas ja soolesüsteemis. Kõhukelme makrofaagidel, mida kultiveeriti 89Zr-WGP-ga ja seejärel süstiti IP-ga, oli sarnane, kuigi veidi mitmekesisem kaubitsemine kui puhtal 89Zr-WGP-l, ning need kogunesid kõige silmatorkavamalt kõhunäärmesse (joonis 1d). WGP-ga koormatud kõhukelme makrofaagide kaubitsemine pankreasesse näitab, et nii paljas WGP kui ka makrofaagid, mis on fagotsütoosinud WGP, avaldavad kõhunäärme suhtes tropismi.

Et hinnata rolli, mida WGP teadaolev retseptor WGP kaubitsemisel mängis, süstiti hiirtele, kellel puudus C-tüüpi lektiini retseptor Dectin-1 (Dectin-1−/− hiired). DTAF-WGP. Võrreldes WT hiirtega, vähenes Dectin-1−/− hiirtel pankreasesse transporditud WGP kogus voolutsütomeetriaga hinnatuna viiekordselt (joonis 1d). 89ZrWGP on süstinud IP-d ka WT hiirtele ja Dectin{7}}−/− hiirtele. Võrreldes WT loomadega oli Dectin{10}}−/− hiirte pankreasesse 89Zr-WGP kaubitsemine oluliselt väiksem (joonis 1e). Selle protsessi glükaani spetsiifilisuse tagamiseks süstiti IP polüstüreenil põhinevat lateksist 3 μm fluorestseeruvat osakest, mis oli sama suur kui WGP osakesel ja mille kogunemine kõhunäärmesse ei leitud (täiendav joonis 1a). Need andmed koos toovad esile varem iseloomustamata dektiinist{16}} sõltuva tropismi, mille puhul -glükaan liigub kõhunäärmesse.

Joonis 1 Osakesed -glükaani liikumine pankreasesse dektiinist-1-sõltuval viisil. DTAF-WGP süstiti IP ja 3 päeva hiljem koguti erinevad koed (n=3) ja hinnati DTAF-WGP olemasolu voolutsütomeetria abil. Kuvatakse tüüpilised punktdiagrammid ja summeeritud andmed. *p=0.032, **p=0.0057, ****p < 0,0001. b WGP märgistati 89Zr-WGP-ga või c peritoneaalseid makrofaage inkubeeriti 89Zr-WGP-ga ja pesti, millele järgnes IP süstimine. PET/CT-kuvamine näitab 89Zr-WGP kaubitsemist 48 tunni pärast. Organite radioaktiivsust hinnati individuaalselt pärast nekroskoopiat, kasutades gammaloendurit. Punktis c esitatakse olulisus võrreldes kõhunäärmega (n=3). ****p < 0,0001. d Dectin-1−/− hiirtele või WT hiirtele süstiti DTAF-WGP-d ja DTAF-WGP akumuleerumist kõhunäärmes hinnati voolutsütomeetria abil (WT PBS n=3, WT WGP n {{ 27}}, KO pluss PBS n=3, KO pluss WGP n=4). e Dectin-1−/− hiirtele või WT hiirtele (n=4) süstiti 89Zr-WGP-d ja 48 tundi hiljem kasutati PET/CT-d, et hinnata selle kogust kõhunäärmes. Signaali kvantifitseerimiseks saadi pankreasesse süstitud annuse protsent (ID protsent). *p=0.046. A–d puhul kasutati ühesuunalist ANOVA-d Tukey mitmekordse võrdlusega ja e-s kasutati paaritu, kahepoolse õpilase t-testi. Andmed esitati kui keskmine ± SEM. ns ei ole oluline; Iga proov esindab bioloogiliselt sõltumatut looma, mis on saadud ühe sõltumatu katse käigus, mida korrati tulemuste kontrollimiseks vähemalt kaks korda.

- Glükaan, mis liigub kõhunäärmesse, kutsub esile kaasasündinud immuunrakkude sissevoolu, millel on treenitud immuunsuse fenotüüp.

Pärast avastamist, et -glükaanil on kõhunäärme suhtes tropism, täheldati ka, et pärast WGP-ravi muutus pankrease immuunmaastik oluliselt. WGP saabumisega pankreasesse kaasnes 3. päevaks selge CD11b pluss müeloidrakkude sissevool pankreasesse, millest mõnel oli WGP fagotsüteeritud (joonis 2a).

See leid ajendas meid uurima, kuidas pärast IP WGP-ravi mõjutavad kõhunäärme üldised immuunpopulatsioonid. Kuna varem on täheldatud, et BM-i treenitud immuunsusega seotud immuunmuutused on kõige selgemad 1-nädalal pärast kokkupuudet -glükaan22-ga, uuriti pankrease immuunprofiili hiirtel, keda raviti 3 μm polüstüreeni mikroosakestega või WGP 7 päeva pärast manustamist. Esiteks täheldati, et CD45 pluss immuunrakkude üldine absoluutarv kõhunäärmes suurenes pärast WGP-ravi umbes seitse korda (joonis 2b). 3 μm polüstüreeni mikroosakeste kontrollil selliseid toimeid ei olnud (täiendav joonis 1b), mis näitab, et see immuunrakkude sissevool on WGP-spetsiifiline. Lisaks täheldati CD45 pluss immuunrakkude protsendi suurenemist (täiendav joonis 1c).

Et täiendavalt klassifitseerida, millised rakutüübid põhjustasid CD45 pluss immuunpopulatsiooni selle laienemise, müeloidrakkude (CD11b pluss ), T-rakkude (CD3 pluss) absoluutarv (joonis 2b) ja suhteline protsent (täiendav joonis 1c) , hinnati B-rakke (CD19 pluss) ja NK-rakke (NK1.1 pluss). Kõhunäärme kumulatiivsed muutused on kujutatud sektordiagrammidega, mis näitavad, et müeloidse sektsiooni laienemine on vastutav teiste rakupopulatsioonide protsendi suhtelise vähenemise ja CD45 pluss populatsiooni üldise suurenemise eest pärast WGP-ravi (joonis 2c). . Järgmisena uurisime, kas see CD11b pluss immuunrakkude sissevool oli mööduv, nii et pärast IP süstimist mõõdeti CD45 pluss rakkude ja CD11b pluss rakkude protsenti kõhunäärmes 7, 10, 18 ja 30 päeva pärast.

Joonis. {{0}}glükaan stimuleerib treenitud müeloidrakkude sissevoolu kõhunäärmesse. CD45 pluss CD11b pluss DTAF pluss rakkude protsent kõhunäärmes 3 päeva pärast seda, kui WT hiired said IP DTAF-WGP. b Seitse päeva pärast PBS või WGP süstimist absoluutarvud CD45 pluss (n=15), CD11b pluss (n=18), CD3 pluss (n {{1{{30} }}}), CD19 pluss (n=10) ja NK1.1 plus (n=14) rakud on näidatud. ****p < 0.0001. c Sektordiagrammid, mis näitavad peamiste immuunrakkude populatsioonide sageduse muutusi pärast WGP-ravi. d WT hiirtele süstiti PBS (n=5) või WGP (n=5) ning CD45 pluss ja CD45 pluss CD11b pluss rakkude protsent mõõdeti 7, 10, 18 ja 30 päeva hiljem ( n=3). **p=0,0034, ****p < 0,0001 (CD45), **p=0,0023 (CD11b). e F4/80 pluss (n=10), Ly6C pluss (n=10) ja Ly6G pluss (n=8) absoluutarvud CD11b pluss populatsioonis. **p=0,003, ****p < 0,0001. f Seitse päeva pärast IP PBS-i või WGP-d taasstimuleeriti pankreas LPS-iga. Mõõdeti TNF tootmist CD11b pluss (n=28), CD11b pluss F4/80 pluss (n=9) ja CD11b pluss Ly6C pluss (n=8) rakkudes. *p=0,024, ***p=0,0001, ****p < 0,0001. g Seitse päeva pärast PBS-i või WGP-d rikastati CD45 pluss CD11b pluss populatsioon (n=4). Rakke taasstimuleeriti LPS-iga või ilma selleta 24 tundi. TNF ja IL{67}} tootmist mõõdeti ELISA abil. ****p < 0,0001. h PBS-i ja WGP-ga treenitud hiirte pankrease CD11b pluss rakud sorteeriti. RT-qPCR tehti TNF (n=4), IL-6 (n=4), iNOS (PBS n=4, WGP n=3) kvantifitseerimiseks. , ja IL-10 (PBS n=4, WGP n=5) mRNA ekspressioonitasemed. *p=0,028, **p=0,0018, ****p < 0,0001. I CD11b pluss rakud PBS-i või WGP-ga süstitud hiirtelt (24 tundi) sorteeriti (n=4). Histoonid isoleeriti ja allutati Western blot analüüsile (ülemine) või ELISA-le (alumine) H3K4me3, H3K27Ac, ​​H3K27me3 ja kogu H3 jaoks. ****p < 0,0001. j Seitse päeva pärast IP WGP-d või PBS-i sorteeriti pankrease CD45 pluss CD1b pluss populatsioonid. Viidi läbi RNA-Seq analüüs (PBS n=3, WGP n=3).

Esitatud on diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide p väärtuste jaotus (–log10(p-väärtus)) ja kordne muutused (log2 FC). k t-SNE graafikud CD11b pluss populatsioonist hiirtel, keda treeniti 7 päeva enne PBS-i või WGP-ga ja analüüsiti CyTOF-iga (PBS n=3, WGP n=3). B-s, e-s, f-s ja h-s kasutati paaristamata kahe sabaga õpilase t-teste. Punktides d, g ja i kasutati mitme võrdlusega ühesuunalist ANOVA-d. Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. ns ei ole oluline. Iga proov esindab bioloogiliselt sõltumatut looma, mis on saadud ühe sõltumatu katse käigus.

Kui CD11b pluss rakkude protsent saavutas haripunkti 7. päeval, siis CD45 pluss rakkude protsent näis saavutavat maksimumi 10. päeval, mis võib viidata sellele, et pärast CD11b pluss rakkude sissevoolu pankreasesse võib järgneda teiste immuunrakkude tüüpide sissevool. Immuunrakkude protsent kõhunäärmes vähenes 30. päevaks baastasemeni, mis näitab, et see sissevool on mööduv (joonis 2d). Müeloidsektsioonis täheldasime makrofaagide (F4/80 pluss), monotsüütide (Ly6C pluss) ja neutrofiilide (Ly6G pluss) absoluutarvu (joonis 2e) ja protsendi (täiendav joonis 1c) suurenemist. Immuunrakkude sissevool kõhunäärmesse sõltus ka süstitud WGP annusest, kus suuremaid WGP annuseid seostati üldise CD45 pluss CD11b pluss müeloidrakkude ja CD45 pluss CD11b pluss F4/80 pluss makrofaagide suurenenud sissevooluga. (täiendav joonis 1d).

Kuna pankreatiit ja pankrease saarekeste hävimine on seotud pankrease immuunrakkude infiltratsiooniga, viidi 7 päeva pärast WGP manustamist acini terviklikkuse hindamiseks läbi pankrease H pluss E (täiendav joonis 1e). Seerumi amülaasi, pankreatiidi diagnostilist markerit, mõõdeti ka WGP ja PBS-ga töödeldud hiirtel 7 päeva pärast süstimist (täiendav joonis 1f). WGP-ravi ja täheldatud immuunsuse sissevool ei mõjutanud negatiivselt ei saarekesi ega seerumi amülaasi, mis näitab, et immuunrakkude sissevool selles mehhanismis ei põhjusta pankrease hävimist.

Et uurida, kas rakkudel, mis leiti, et need infiltreerusid pärast WGP-ravi hiire pankreasesse, ilmnes treenitud immuunsuse fenotüüp, kasutasime standardset treeningprotokolli, milles hiiri töödeldi WGP või PBS-ga ja 7 päeva hiljem pankreas koguti ja seejärel taasstimuleeriti LPS-ga. TNF-i tootmist on kasutatud asendusmarkerina treenitud vastuse hindamiseks. Üldiselt näitasid, et CD11b pluss müeloidrakud, CD11b pluss F4/80 pluss makrofaagid ja CD11b pluss Ly6C pluss monotsüüdid toodavad eelneva WGP-ga kokkupuute tõttu rohkem TNF-i, mida hinnati TNF-pluss rakkude protsendi ja MFI järgi (joonis 1). 2f). Nende leidude edasiseks hindamiseks sorteeriti nende hiirte kõhunäärmest CD11b pluss rakud ja taasstimuleeriti ex vivo LPS-iga ning TNF- ja IL-6 tasemeid supernatantides mõõdeti ELISA abil. Võrreldes PBS-hiirte CD11b pluss rakkudega, tootsid WGP-treenitud hiirte rakud, keda taasstimuleeriti LPS-iga, oluliselt rohkem TNF- ja IL-6 (joonis 2g), mis tähendab, et WGP-ga töödeldud pankrease CD11b pluss rakke treeniti.

Neid tulemusi kinnitati täiendavalt RT-PCR abil, kus PBS-ist või WGP-ga treenitud hiirtest sorteeritud pankrease CD11b pluss rakud toodavad rohkem TNF-, IL-6, iNOS-i ja vähem IL-10. WGP-ravi (joonis 2h). Kuna treenitud immuunsus on seotud metaboolse ja epigeneetilise ümberprogrammeerimisega23, mõõtsime laktaadi taset, et uurida, kas see on seotud glükolüüsiga. Tõepoolest, WGP-treenitud CD11b pluss rakud eritasid treenimata rakkudega võrreldes rohkem laktaati (täiendav joonis 1g). Mõõtsime ka WGP-ga koolitatud CD11b pluss rakkude histooni modifikatsioone. Nagu on näidatud joonisel 2I, olid H3K4me3 ja H3K27Ac ekspressioonitasemed WGP-ga treenitud CD11b pluss rakkudes oluliselt suurenenud. Seda näitas nii Western blot analüüs (joonis 2i, ülemine) kui ka ELISA kvantitatiivne analüüs (joonis 2i, alumine). Need leiud koos näitavad, et WGP mitte ainult ei õhuta kõhunäärmesse liikuvates rakkudes treenitud fenotüüpi, vaid läbib ka metaboolse ja epigeneetilise ümberprogrammeerimise.

Seejärel viidi 7 päeva pärast PBS või WGP manustamist läbi FACS-sorteeritud CD45 pluss CD11b pluss rakkudega RNA sekveneerimine (RNA-Seq), et saada kõhunäärme müeloidsete populatsioonide erapooletu ja põhjalik iseloomustus. Kokku avastati 1459 erinevalt ekspresseeritud geeni (DEG), millest 661 oli ülesreguleeritud ja 798 geeni allareguleeritud WGPtrained seades (joonis 2j). Geenikomplekti rikastamise analüüsid (GSEA) kinnitasid veelgi varem uuritud ülesreguleerimist TNF- ja IL{10}} tootmisega seotud radades (täiendav joonis 2a). Täheldatud immuunrakkude sissevoolu tõttu olid leukotsüütide kemotaksise, leukotsüütide migratsiooni (täiendav joonis 2a), monotsüütide kemotaksise, makrofaagide migratsiooni ja müeloidsete leukotsüütide migratsiooniga (täiendav joonis 2b) seotud DEG-d WGP rühmas oluliselt rikastatud. Lisaks rikastati oluliselt Reaktoomi radade CLEC7A dektiini{15}} signaaliülekande ja C-tüüpi lektiini retseptori radu, mis kinnitab veelgi dektiini{17}} osalemist selles protsessis (täiendav joonis 2c).

Arvestades, et täheldati, et müeloidne populatsioon vastutab CD45 pluss populatsiooni laienemise eest ja et müeloidrakud on mitmekesine populatsioon, viidi CyTOF analüüs läbi 7 päeva varem PBS-i või WGP-ga töödeldud hiirte pankreatas. Identifitseeriti pankrease rakupopulatsioonid ja võrreldi neid ravirühmade vahel; t-SNE proovitükid näitasid, et pärast WGP-ravi vähenes makrofaagide populatsioon, mis ekspresseerib kõrgelt M2 markereid, nagu CD206. Samuti täheldasime mitmete müeloidsete populatsioonide ilmumist kõhunäärmes, mis olid määratletud kui Ly6C pluss makrofaagidest pärinevad monotsüüdid, infiltreeruvad põletikulised monotsüüdid, aktiveeritud makrofaagid ja CD206 pluss aktiveeritud makrofaagid (joonis 2k ja täiendav joonis 2d). CD11b pluss populatsioonile suunatud viSNE graafikud näitasid monotsüütide ja makrofaagide selget laienemist, lisaks suurenes dendriitrakkude (DC), neutrofiilide ja NK populatsioonide arv pärast WGP-ravi (täiendav joonis 2e).

Lisaks rõhutavad need analüüsid, et pärast WGP-treeningut ja LPS-i stimuleerimist tootsid TNF-i peamiselt makrofaagid ja monotsüüdid, IL-6-i ja iNOS-i tootsid peamiselt makrofaagid, Granzyme-B-d tootsid NK-rakud ja makrofaagid ning IFN-i peamiselt neutrofiilide poolt toodetud (täiendav joonis 2f). See näitab, et kuigi paljud rakupopulatsioonid on WGP-ravi tõttu muutunud, on WGP-ga treenitud esmased rakud, mida hinnatakse suurenenud TNF-i ekspressiooni järgi, makrofaagid ja monotsüüdid ning et treenitud immuunsuse fenotüübi eest ei vastuta ühtki rakutüüpi. täheldati.

Et hinnata, kas see müeloidrakkude sissevoolu ja aktiveerumise nähtus sõltus teistest immuunpopulatsioonidest või oli täielikult ajendatud müeloidrakkudest endist, ammendasime spetsiifilised immuunpopulatsioonid ja jälgisime treenitud fenotüüpi. Anti-CD4 ja anti-CD8 mAb-sid kasutati üksi ja kombinatsioonis T-rakkude kahanemiseks, hinnati ammendumise tõhusust (täiendav joonis 3a) ja jälgiti müeloidrakkude treenitud fenotüüpi (täiendav joonis 3b, c). NK-rakud kahandati ka mAb PK136 abil, hinnati kahanemise efektiivsust (täiendav joonis 3d) ja jälgiti treenitud fenotüüpi (täiendav joonis 3e, f). T-rakkude ja NK-rakkude puudumisel täheldati siiski, et WGP treenis müeloidrakke. Treenitud fenotüüpi hinnati ka NSG hiirtel, kellel puuduvad B-rakud, T-rakud ja NK-rakud (täiendav joonis 3g, h). Nendel hiirtel oli endiselt selge treenitud immuunsuse fenotüüp.

Lõpuks ammendasime neutrofiilid Ly6G mAb abil. Vaatamata granulotsüütide ammendumisele täheldasime endiselt WGP-indutseeritud treeningut CD11b pluss müeloidsektsioonis (täiendav joonis 3i–k). Kokkuvõttes kinnitavad meie andmed, et pankrease infiltreeruvaid müeloidrakke treenib -glükaan ilma adaptiivsete immuunpopulatsioonide, NK-rakkude või granulotsüütide abita või mõjuta.

Üherakuline RNA sekveneerimine paljastab spetsiifilised põletikueelsete makrofaagide/monotsüütide populatsioonid, mis liiguvad pärast glükaaniga töötlemist pankreasesse.

Kuna meie CyTOF analüüsid on avastanud mitmete varem iseloomustamata populatsioonide ilmumise pankreasesse pärast WGP-ravi, viidi kõhunäärmes esinevate rakupopulatsioonide põhjalikumaks mõistmiseks läbi üherakuline RNA sekveneerimine (scRNA-Seq). sorteeritud CD45 pluss rakkudel PBS-ga töödeldud hiirtelt ja hiirtelt, keda raviti WGP-ga kolm (3-päev WGP) ja seitse päeva enne (7-päev WGP). Kahemõõtmeline UMAP esitus 11 132 rakust, mis on koondatud kolmest proovist koos klastritega, mis tulenevad k-lähimatest naabritest ja Louvaini algoritmidest, mis on jagatud 19 erinevaks klastriks (joonis 3a, b). Hinnati iga klastri suhtelist sagedust igas katserühmas.

Siin täheldati 7. päeval pärast WGP-ravi klastrite 3, 4 ja 10 esinemissageduse olulist suurenemist koos klastri 5 peaaegu kadumisega (joonis 3c). Samuti näidati, et mitme teise populatsiooni suhtelised sagedused vähenevad aja jooksul. See ilmne suundumus on aga tõenäoliselt tingitud teiste populatsioonide esinemissageduse suhtelisest suurenemisest. Üldiselt paistavad klastrid 3, 4, 10 ja 5 WGP-ravi tõttu kõige olulisemalt muutunud (joonis 3d).

Populatsioonid, mis olid varem WGP-ravi tõttu aja jooksul kõige olulisemalt muutunud, kuulusid müeloidse sektsiooni, nagu tuvastas CSF1R ekspressioon (joonis 3d, e). Kuna need andmed koos varasemate leidudega viitavad sellele, et müeloidsed populatsioonid põhjustavad WGP-raviga seotud immuunsüsteemi muutusi, uuriti dünaamilist CSF1R pluss klastreid 3, 4, 10 ja 5 üksikasjalikumalt, nagu on näidatud viiuli graafikutega (joonis 3f) ja punktiga. graafikud, mis esindavad 12 parimat markergeeni iga klastri keskmise Z-skoori järgi (joonis 3g). Klaster 5, mis esines PBS-hiirtel, kuid pärast WGP-ravi praktiliselt kadus, tuvastati residentsete makrofaagidena 24, 25. See klaster väljendas märkimisväärselt ka MAF-i ja APO-d, mis mõlemad on seotud M2 makrofaagide polarisatsiooniga 26–28. Klaster 19 oli aja jooksul suures osas muutumatu, nii et seda ei kirjeldatud üksikasjalikumalt, kuid sellel oli 5. klastriga sarnane ekspressiooniprofiil ja esindab seega ka kudedes elavate makrofaagide alamhulka. Klastril 10, Ly6Clo makrofaagide populatsioonil, oli samuti sarnane ekspressiooniprofiil residentide makrofaagide klastriga 5 ning märkimisväärsed ARG1 ja FABP ekspressioonisignatuurid. Arvestades Ly6C ekspressiooni puudumist, sarnasust püsivate makrofaagide populatsiooniga ja elanike populatsiooni kadumist pärast WGP-ravi, eeldame, et see populatsioon on repolariseeritud makrofaagid. Klastrid 3 ja 4 jagasid üldist fenotüübilist iseloomustust Ly6CHi infiltreeruvate monotsüütide / makrofaagidena. Klastris 4 oli märkimisväärne Chil3 ja Plac8 ekspressioon, mis koos on tuvastanud teine ​​​​rühm Ly6Chi infiltreeruvate makrofaagide tuvastamiseks29.

Lõpuks, 3. klaster, mis puudus naiivsetel hiirtel ja näitas pärast WGP-ravi kõige suuremat suhtelise sageduse suurenemist kõigi klastrite seas, väljendas olulisi TNFAIP2, IL1B, SOD2 ja PRDX5 allkirju, mis viitab tugevalt põletikueelsele fenotüübile. Klaster 3 tuvastati seega Ly6CHi põletikuliste infiltreeruvate monotsüütide / makrofaagidena. Huvitav on see, et müeloidse alamhulga sees on WGP-ravi tõttu suurenevad populatsioonid ainsad TNFAIP2 ekspresseerivad populatsioonid, mis näitab, et kõhunäärmesse sisenevad rakud on tõenäoliselt treenitud müeloidrakud.

Iga nelja dünaamilise müeloidklastri aktivatsiooni oleku edasiseks iseloomustamiseks koostati punktdiagrammid, mis näitavad põletikueelse ja põletikuvastase staatusega seotud geenide suhtelist ekspressiooni (joonis 3h). Näidati, et klastrid 3 ja 4, infiltreeruvad monotsüüdid/makrofaagid, olid põletikuvastased, residendist makrofaagid olid põletikuvastased ja klastri 10 makrofaagid näitasid vahepealset fenotüüpi. Kooskõlas varasemate CyTOF-i ja voolutsütomeetria andmetega iseloomustavad need scRNA-Seq andmed neid äsja tuvastatud müeloidrakke pankreases kui transformeeritud ja repolariseeritud Ly6CLo residentidest makrofaagide ja põletikuvastaste Ly6CHi infiltreeruvate monotsüütidest pärinevate makrofaagide heterogeenset populatsiooni, mis ekspresseerivad signatuure. treenitud immuunsusega.

WGP-st tingitud müeloidrakkude sissevool ja treenimine kõhunäärmes on CCR2-sõltuv ja toimub juba 24 tundi pärast WGP-ravi.

Järgmisena uurisime, millised mehhanismid vastutasid selle rakkude sissevoolu pankreasesse. RNA-Seq andmeid kasutati kemokiinide ja tsütokiinide iseloomustamiseks, mille ekspressioon oli WGP-ravi korral oluliselt ülesreguleeritud (joonis 4a). Kuigi mitmed kemokiinid ja tsütokiinid olid ülesreguleeritud, tekitas meie makrofaagide ja monotsüütide sissevoolu pankreasesse jälgimine CCR2 vastu spetsiifilise huvi, kuna see osaleb monotsüütide ja makrofaagide värbamises ning monotsüütide väljavoolus luuüdist 30–32. CyTOF-i andmed näitasid ka CCR{5}}positiivsete rakkude arvu märkimisväärset suurenemist pärast WGP-ravi (joonis 4b) ja scRNA-Seq näitas CCR2 selget ekspressiooni klastrites 3 ja 4, mis olid kaks kõige selgemat populatsiooni. treenitud immuunsuse fenotüübid (joonis 4c). Lisaks näitasid terve pankrease lüsaadid 24 tundi pärast WGP-ravi CCL2, mis on CCR2 ligand ja osaleb monotsüütide kemotaksise vahendamises, 30-kordset suurenemist (joonis 4d).

RNA-Seq andmed olid näidanud immuunrakkude värbamise ja kaubitsemise selget allkirja ning need andmed näitasid ka, et WGP reguleeris leukotsüütide ja mononukleaarsete rakkude proliferatsiooni (joonis 4e). Et uurida, kas CCR2 pluss müeloidrakud prolifereerusid, kui nad pankreasesse jõudsid, hinnati Ki67 ekspresseerivate CCR2 pluss rakkude protsenti PBS-i ja WGP-ga töödeldud hiirtel. Pärast WGP-ravi suurenes üldine prolifereeruvate rakkude arv (joonis 4f) ja suur protsent neist prolifereeruvatest rakkudest olid CD11b pluss CCR2 pluss (joonis 4g). Seejärel uurisime CCR2 pluss rakkude panust koolitatud fenotüüpi. 7 päeva pärast in vivo töötlemist PBS-i või WGP-ga mõõdeti CCR2 plus ja CCR2- populatsioonides treenitud ravivastust (joonis 4h). Need andmed näitasid, et enamik WGP-ravi järel treenitud rakke olid CCR2 pluss.

CCR2 rolli edasiseks uurimiseks glükaaniga treenitud monotsüütides/makrofaagides treeniti CCR2-/- hiiri WGP-glükaaniga. CCR2−/− hiirtel ei toimunud CD45 pluss (joonis 4i) või CD45 pluss CD11b pluss müeloidrakkude (joonis 4j) sissevoolu kõhunäärmesse ja neil ei ilmnenud treenitud vastust, nagu näitas TNF-i tootmine (joonis 4). 4k). Need andmed näitavad, et CCR2 mängib olulist rolli kaasasündinud immuunrakkude migratsioonis pankreasesse ja perifeerse treenitud immuunsuse esilekutsumisel kõhunäärmes.

Nagu eelnevalt märgitud, on CCR2 oluline monotsüütide varase värbamise jaoks, kuid vähem hilise värbamise jaoks33. Seni olime ka täheldanud, et 7 päeva pärast WGP-treeningut oli CCR2 kriitilise tähtsusega treenitud müeloidrakkude värbamisel kõhunäärmesse. Järgmisena uurisime, kas see sissevool toimus WGP-treeningu alguses ja kas CCR2 pluss müeloidrakud värvati pankreasesse. Selleks töödeldi hiiri PBS või WGP-ga ning pankrease kudesid analüüsiti 24 ja 48 tundi hiljem. Üllataval kombel suureneb juba 24 tundi pärast WGP treeningut CD45 plus (täiendav joonis 4a), CD11b plus (täiendav joonis 4b), F4/80 plus (täiendav joonis 4c), Ly6C plus (täiendav joonis 4d) , ja CD11b pluss CCR2 pluss (täiendav joonis 4e) rakke täheldati.

Lisaks näidati, et neid müeloidrakke treeniti juba 24 tundi pärast WGP-ravi (täiendav joonis 4f). See tähelepanek toob esile erinevused nende tulemuste ja varem täheldatud treenitud immuunsuse fenotüüpide vahel, mida tavaliselt ei alustata enne vähemalt 3 päeva pärast koolitust.

Joonis 4 CCR2 on vajalik immuunrakkude pankreasesse liikumiseks. kemokiinide ja tsütokiinide soojuskaart, mida 7-päevases WGP-ga töödeldud CD11b pluss rakkudes ülesreguleeriti RNA-Seq andmete põhjal. b viSNE graafik CD11b pluss pankrease populatsioonist PBS-is ja 7-päevase WGP-ga treenitud hiirtel, tuues esile CCR2 ekspressiooni. CyTOF andmetega tehtud pildid. c scRNA-Seq andmed, mis näitavad CCR2 ekspresseerivate müeloidklastrite UMAP-i. d CCL2 ekspressioon tervetes pankrease lüsaatides 24 tundi pärast WGP-ravi a mõõdeti RT-PCR-ga (n=6). ****p=0.0001. GSEA genereeris leukotsüütide proliferatsiooniga seotud geenide rikastusdiagrammid CD11b ja pankrease rakkudes 7-päevasest WGP-treeningust, võrreldes PBS-hiirtega. Kontrollina kasutati PBS-i ja võrreldi WGP-ga. f Kokkuvõtlikud andmed nende CD45 pluss pankrease rakkude protsendi kohta, millel on Ki67 pluss PBS-is ja 7-päevase WGP-ga treenitud hiirtel (n=4). ***p=0.0007. g Rakud avati esmalt CD45 pluss Ki67 pluss populatsioonis. Diagrammid näitavad CD45 pluss Ki67 pluss prolifereeruvate pankrease rakkude protsenti, mis on CD11b pluss CCR2 pluss PBS-is ja 7-päevased WGP-ga treenitud hiired (n=4). *p=0.0261. h PBS-i pankreaserakke ja 7-päevase WGP-ga treenitud hiirte (n=5) taasstimuleeriti LPS-iga ning igas seisundis mõõdeti TNF-i tootvate CCR2-positiivsete ja negatiivsete rakkude protsenti. Rakud eraldati esmalt CD45 pluss CD11b pluss alamhulgaga. Näidati tüüpilisi punktgraafikuid ja summeeritud andmeid. *p=0.022, **p=0.0073, ***p=0.0007. i–k WT ja CCR2−/− hiiri töödeldi PBS või WGP-ga ning hinnati I CD45 pluss rakkude protsenti kõhunäärmes (****p < 0,0001) ja j CD45 pluss rakkude protsenti, mis olid CD11b pluss. . **p=0.0013. k TNF-i tootvate CD45 pluss CD11b pluss rakkude protsent. Kuvatakse tüüpilised voolugraafikud ja summeeritud andmed. Iga punkt tähistab ühe hiire andmeid. ***p=0.0002. (i–k: WT PBS n=9, WT WGP n=9, CCR2−/− PBS n=8, CCR2−/− WGP n=8).

Punktides d, f ja g kasutati paaristamata kahe sabaga õpilase t-testi, samas kui h-k puhul kasutati mitme võrdlusega ühesuunalist ANOVA-d. Andmed esitati kui keskmine ± SEM. ns ei ole oluline. F – k puhul esindab iga proov bioloogiliselt sõltumatut looma, mis on saadud ühe sõltumatu katse käigus, mida korrati tulemuste kontrollimiseks vähemalt kaks korda.

WGP-ga koolitatud pankrease infiltreeruvad müeloidrakud reageerivad kõhunäärmevähistest sekreteeritud teguritele ning suurendavad fagotsütoosi ja ROS-vahendatud tsütotoksilisust kasvajarakkudele.

Kuna oleme näidanud, et WGP kasutamine esialgse stiimulina annab kaasasündinud immuunrakud, mis on treenitud tugevamalt reageerima sekundaarsele kokkupuutele LPS-iga ja et need rakud kogunevad pärast ravi kõhunäärmesse, tahtsime teada, kas sekundaarsed stiimulid on seotud pankrease kasvajatega. võib ka selle väljaõppinud reaktsiooni esile kutsuda. Selleks uurisime esmalt, kas pankrease vähirakud ise on võimelised esile kutsuma WGP-indutseeritud treenitud vastuse. Selle küsimuse uurimiseks kultiveeriti peritoneaalseid makrofaage PBS-i või WGP-ga in vitro ja 7 päeva hiljem taasstimuleeriti LPS-iga, supernatant naiivse hiire pankrease rakkudest ja supernatant kultiveeritud KPC-rakkudest, mis on pankrease kasvaja C57BL/6 taustal, mis on tuletatud LSL-KrasG12D/plussist; LSL-Trp53R172H/ pluss ; Pdx1-Cre (KPC) hiired või Pan02 pankreasevähirakud 24 tunni jooksul. TNF-i tootmist supernatandis mõõdeti ELISA abil.

Võrreldes kultiveeritud normaalsete pankreaserakkude supernatandiga, mis ei aktiveerinud eelnevalt treenitud makrofaage, stimuleeris kultiveeritud KPC ja Pan02 pankreasevähirakkude supernatant rohkem TNF- -tootmist glükaaniga treenitud makrofaagides (täiendav joonis 5a). Lisaks sellele, et kontrollida võimalust, et fagotsütoosi protsess ise võib põhjustada rakkude aktiveerumist, kultiveeriti peritoneaalseid makrofaage 3 μm polüstüreeni mikroosakeste helmestega ja seejärel stimuleeriti uuesti PBS või LPS-ga (täiendav joonis 5b). Tulemused näitasid, et TNF-i suurenenud tootmine oli spetsiifiline WGP-treeningule.

Seejärel testiti seda ex vivo keskkonnas, kus hiiri töödeldi PBS-i või WGP-ga ja 7 päeva hiljem koguti pankrease, rikastati pankrease müeloidrakke ja seejärel stimuleeriti uuesti kultiveeritud KPC supernatantidega (täiendav joonis 5c) või Pan02. rakud (täiendav joonis 5d). See näitas, et WGP in vivo treenitud CD11b pluss müeloidrakud kõhunäärmes tekitasid vastusena kasvajaga konditsioneeritud söötmele oluliselt rohkem TNF-i. Kasvajarakud ise eritavad paljusid tegureid, mis võivad spetsiifiliselt toimida treenitud immuunsuse teise stiimulina. On teada, et pankrease kasvajarakud ekspresseerivad kõrgel tasemel kahjustusega seotud molekulaarmustreid (DAMP) ja põletikueelseid tegureid, nagu makrofaagide migratsiooni inhibeeriv faktor (MIF). MIF on tsütokiin, mida teadaolevalt sekreteerivad kõrgetes kontsentratsioonides pankrease kasvajad, mis võivad toimida otse müeloidrakkudele34, 35.

Tõepoolest, ELISA abil hinnati KPC ja Pan02 rakkude supernatandis MIF (täiendav joonis 5e). Seega oletasime, et MIF võib olla potentsiaalne kasvaja poolt eritatav tegur, mis võib toimida teise signaalina WGP-indutseeritud koolitatud immuunsuse seadmisel. Selle uurimiseks stimuleeriti in vivo WGP-ga treenitud hiirte pankrease müeloidrakke sarnase kontsentratsiooniga rekombinantse MIF-iga (rMIF), mis esines kasvajaga konditsioneeritud söötmes. Nagu on näidatud täiendaval joonisel 5f, näitasid pankrease müeloidrakud, mida oli eelnevalt treenitud WGP-ga, rMIF-i taasstimuleerimisel suurenenud TNF-i tootmine. Need andmed viitavad ühiselt kontseptsioonile, et pankrease kasvajarakud võivad nende vabanevate lahustuvate tegurite kaudu toimida teise signaalina WGP poolt koolitatud pankrease müeloidrakkude aktiveerimiseks.

Järgmisena uurisime, kas nendel WGP-ga koolitatud kaasasündinud immuunrakkudel on paranenud sisemised kasvajavastased omadused. RNA sekveneerimise andmed näitasid, et fagotsütoosiga seotud mehhanismid olid WGP seadistuses ülesreguleeritud (joonis 5a), mis meie oletuse järgi võib olla üks kasvajavastase funktsionaalsuse mehhanisme. 20 parimat rikastatud KEGG rada ja geeniontoloogia (GO) bioloogilist protsessi WGP koolitusel on loetletud täiendavates tabelites 1 ja 2. CD45 pluss immuunrakud ja CD11b pluss müeloidrakud WGP-ga treenitud hiire kõhunäärmest koguti ja analüüsiti fagotsütootilise potentsiaali suhtes. WGP-ravi tõi kaasa üldise CD45 pluss immuunrakkude (joonis 5b) ja CD11b pluss müeloidrakkude (joonis 5c) fagotsüütilise potentsiaali olulise suurenemise.

Lisaks näitasid in vivo treenitud müeloidrakud KPC kasvajarakkude fagotsütoosi suurenemist (joonis 5d). Seejärel hindasime, kas WGP poolt treenitud müeloidrakud näitasid KPC rakkudele suurenenud tsütotoksilisust. RNA-Seq andmed näitasid, et DEG-d, mis on seotud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) biosünteesiprotsessidega ja ROS-i metaboolsete protsesside positiivse reguleerimisega, olid WGP-ga töödeldud müeloidrakkudes oluliselt rikastatud (joonis 5e).

Selle tulemusena püstitasime hüpoteesi, et ROS-i tootmise ülesreguleerimine WGP poolt suurendab pankrease müeloidrakkude tsütotoksilisust KPC kasvajarakkudele. Selle hüpoteesi uurimiseks eraldati CD11b pluss pankrease rakud glükaaniga treenitud või treenimata hiirtelt ja plaaditi 24 tunniks lutsiferaasi ekspresseerivate KPC rakkudega (KPCLuc plus). WGP-ga treenitud müeloidrakud näitasid kolm korda suurenenud tsütotoksilisust KPC kasvajarakkude suhtes ja ROS-i tootmise pärssimine ROS-i inhibiitori N-atsetüültsüsteiini (NAC) abil tühistas täielikult WGP-st põhjustatud tsütotoksilisuse suurenemise (joonis 5f). ROS-indutseeritud lipiidide peroksüdatsioon mängib apoptoosi, autofagia ja ferroptoosi korral kriitilist rolli36. Seega kasutasime kahte täiendavat ROS-i inhibiitorit, Troloxi ja deferoksamiini (DFO), et uurida nende mõju tsütotoksilisusele.Troloxi ja DFO lisamine inhibeeris oluliselt WGP-treenitud CD11b pluss rakuvahendatud tsütotoksilisust (joonis 5g), mis viitabet ROS-i poolt indutseeritud lipiidperoksidaas on vähemalt osaliselt seotud selle ROS-vahendatud tsütotoksilisusega.

Joonis fig 5 WGP-ga treenitud pankrease infiltreeruvad müeloidrakud näitavad suurenenud fagotsütoosi ja ROS-vahendatud tsütotoksilisust. Rikastusdiagrammid (GSEA) ja geenide soojuskaart, mis on seotud fagotsütoosi positiivse reguleerimisega CD11b pluss rakkudes 7-päevasest WGP-treeningust, võrreldes PBS-hiirtega. b CD45 pluss pankrease rakkude protsent, mis fagotsüteerisid pHrodo Green Staph Aureuse osakest PBS (n=10) ja 7-day WGP (n=9) hiirtel koos pHrodo MFI-ga Roheline Staph Aureuse osake. Iga punkt tähistab ühe hiire andmeid. *p {{10}},043, ****p < 0,0001. c CD11b pluss müeloidsete pankrease rakkude protsent, mis fagotsüteerisid pHrodo Green Staph Aureuse osakest PBS-is (n=13) ja 7-day WGP (n=13) hiirtel. Rakud eraldati esmalt CD45 pluss populatsioonis. Näidatud on pHrodo Green Staph Aureuse osakese MFI. **p=0.0021, ***p=0.0002. d CD11b pluss müeloidsete pankrease rakkude protsent, mis fagotsüteerisid KPCGFP pluss kasvajarakke PBS (n=5) ja 7-day WGP (n=5) hiirtel. *p=0.0103. Rakud eraldati esmalt CD45 pluss populatsioonis. Kuvatakse ka GFP plusssignaali MFI kokkuvõte. *p=0.0379. e Rikastusgraafikud (GSEA) ja geenide soojuskaart, mis on seotud reaktiivsete hapnikuliikide biosünteesiprotsesside ja reaktiivsete hapnikuliikide metaboolsete protsesside positiivse reguleerimisega CD11b pluss rakkudes alates 7--päevasest WGP-treeningust, võrreldes PBS-hiirtega. f Tsütotoksilisuse testi kokkuvõtlikud tulemused, kus PBS-i CD11b pluss rakud ja 7-päevased WGP-ga treenitud hiired sorteeriti ja inkubeeriti 24 tundi vahekorras 1:20 KPCLuc pluss : CD11b plus rakud. NAC-i kasutati ROS-i ekspressiooni blokeerimiseks ja kasvaja tsütotoksilisust hinnati luminestsentsi järgi (PBS n=3, WGP n=4). g Kokkuvõtlikud andmed tsütotoksilisuse analüüsidest, kus CD11b pluss rakud 7-päevaselt WGP-ga treenitud hiirtelt sorteeriti ja inkubeeriti 24 tundi vahekorras 1:20 KPCLuc pluss : CD11b plus rakud. Lisati Trolox või DFO või vastavad vehiiklikontrollid ja kasvaja tsütotoksilisus määrati luminestsentsi mõõtmise teel (n=3). *p=0.0255, **p=0.0019. B–d puhul kasutati paaristamata kahe sabaga õpilase t-testi ning f jaoks kasutati g ja mitme võrdlusega ühesuunalist ANOVA-d. Andmed esitati kui keskmine ± SEM. ns ei ole oluline. Punktis b – g esindab iga proov bioloogiliselt sõltumatut looma, mis on saadud ühe sõltumatu katse käigus, mida korrati tulemuste kontrollimiseks vähemalt kaks korda.

Lõppkokkuvõttes näitavad need andmed, et pankrease kasvajarakud on võimelised WGP-treenitud infiltreeruvaid müeloidrakke pankreases uuesti aktiveerima ja et need rakud näitavad suurenenud fagotsütoosi ja ROS-vahendatud tsütotoksilisust.

WGP-indutseeritud koolitatud immuunsus vähendab kasvaja kasvu ja pikendab pankreasevähi ortotoopiliste mudelite elulemust.

Järgmisena uurisime, kas glükaani poolt vahendatud kaasasündinud immuunvastused kõhunäärmes tooksid kaasa kasvajavastase mikrokeskkonna loomise, mis võib olla piisav PDAC iseloomuliku immunosupressiivse TME ületamiseks. Vastavalt sellele anti hiirtele päeval −7 1 annus kas PBS-i või WGP-d ja päeval 0 implanteeriti ortotoopiliselt 1 × 105 KPC või KPCLuc pluss rakke kõhunäärme sabasse (joonis 6a). 21. päeval hiired surmati ja mõõdeti kasvaja kaal (joonis 6b). KPCLuc pluss rakkude süstimise ajal süstiti hiirtele lutsiferaasi substraati ja kasvajaid kujutati (joonis 6c).

Mõlemad uuringud näitasid WGP-ravi tulemusel kasvajakoormuse märkimisväärset vähenemist ja elulemus pikenes oluliselt ka WGP-ga treenitud hiirtel (joonis 6d). Kasvajate immunofenotüpiseerimine näitas CD45 pluss immuunrakkude, CD11b pluss müeloidrakkude ja F4/80 pluss makrofaagide arvu püsivat suurenemist WGP-ga koolitatud keskkonnas (joonis 6e). CD11b pluss müeloidrakud (joonis 6f) ja CD11b pluss F4/80 pluss makrofaagid (joonis fig 6g) näitasid samuti WGP-st tingitud TNF-i tootmise olulist suurenemist. Nii CD11b pluss müeloidrakkude arvu suurenemine (joonis 6h, vasakul) kui ka CD11b pluss TNF-d tootvate rakkude protsendi suurenemine (joonis 6h, paremal) korreleerusid oluliselt kasvaja koormuse vähenemisega. Ei CD4 pluss ega CD8 pluss T-rakkudes ei ilmnenud IFN- suurenemist, mis kinnitab veelgi, et kasvaja koormuse vähenemist ajendasid WGP-ga treenitud müeloidrakud (joonis 6i). Sarnast kasvajavastast toimet täheldati ka hiirtel, kellele oli ortotoopiliselt siirdatud Pan02 kasvajad (täiendav joonis 6a).

Et täiendavalt kinnitada, et kaasasündinud immuunrakud vastutavad täheldatud kasvajavastaste immuunvastuste eest, siirdati NSG hiirtele ortotoopilised KPC kasvajad. Sarnaselt WT hiirtele näitasid NSG hiirtel ka kasvaja suuruse olulist vähenemist WGP koolituse tõttu, kinnitades, et WGP kasvajavastaseid toimeid ajendasid kaasasündinud immuunrakud ja need toimisid adaptiivsetest vastustest sõltumatult (täiendav joonis 6b). Kalafati jt. on näidanud, et granulopoeesi kaasasündinud immuuntreening soodustab kasvajavastast immuunsust21.

Kuigi me ei näinud granulotsüütide olulist panust meie treenitud immuunsuse fenotüübisse, uurisime, kas granulotsüüdid on seotud pankrease kasvajate WGP-sõltuva vähenemisega, kahandades neutrofiile ja jälgides kasvaja kasvu PBS-i ja WGP-ga ravitud hiirtel. Hinnati neutrofiilide kahanemise efektiivsust kõhunäärmes (täiendav joonis 6c) koos pankrease kasvaja koormusega (täiendav joonis 6d). Meie tulemused näitasid kasvaja suuruse olulist vähenemist WGP rühmas neutrofiilide puudumisel.

Joonis 6. Treenitud immuunsuse esilekutsumisel kõhunäärmes on kasvajavastane toime. Eksperimentaalne skeem. b C57BL/6 hiired said ühe WGP või PBS IP süsti ja 7 päeva hiirtele implanteeriti ortotoopiliselt KPC kõhunäärmevähi rakud. Näidatud on kasvajate tüüpilised pildid ja kasvaja massi kvantitatiivne analüüs. Kasvaja kaal mõõdeti 21. päeval (PBS n=10, WGP n=12). ***p=0.0004. c C57BL/6 hiired (n=4) said ühe WGP või PBS ip süsti ja 7 päeva hiljem implanteeriti neile ortotoopiliselt KPC pluss Luc pankreasevähirakud. 21. päeval pärast kasvaja implanteerimist anti hiirtele IP lutsiferiini bioluminestseeruv substraat ja need pandi fotonikujutisse, et mõõta kasvaja suurust in vivo. *p=0.0403. d Hiirte ellujäämine punktis a näidatud eksperimentaalses skeemis, kasutades KPC rakke (n=5). **p=0.0018. e Kasvajate fenotüüpimine, mis näitab CD45 plussiga elujõuliste rakkude protsenti, CD45 plussiga populatsiooni protsenti, millel on CD11b pluss ja CD11b pluss rakkude protsenti, millel on F4/80 pluss (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0165 (CD45), ***p=0.0001 (CD11b), **p=0.0034 (F4/80). f TNF tootmine CD11b pluss rakkudes PBS-ist ja 7-päevase WGP-ga treenitud rakkudes, mida taasstimuleeriti LPS-iga. Kuvatakse TNF pluss rakkude protsent ja TNF MFI (PBS n=10, WGP n=9). **p=0.007, ***p=0.0002. g Kokkuvõtlikud andmed TNF tootmise kohta CD11b pluss F4/80 pluss rakkudes PBS-ist ja 7-päevasest WGP-treeningust, mida taasstimuleeriti LPS-iga. Kuvatakse TNF pluss rakkude protsent ja TNF MFI (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0155, ***p=0.0001. h Kasvaja kaal korreleeriti CD45 pluss immuunrakkude protsendiga, mis olid CD11b pluss (vasakul) ja CD45 pluss CD11b pluss TNF pluss rakkude protsendiga (paremal). (PBS n=10, WGP n=9). i Kokkuvõtlikud andmed IFN-i ekspresseerivate CD4 plus ja CD8 plus T-rakkude protsendi kohta (PBS n=10, WGP n=9) Andmed esitati kui keskmine ± SEM. Lineaarsete seoste tugevuse mõõtmiseks kasutati Pearsoni korrelatsioonikoefitsiente ja muul juhul kasutati paarituid, kahepoolseid õpilase t-teste. ns ei ole oluline. Iga proov esindab bioloogiliselt sõltumatut looma, mis on saadud ühe sõltumatu katse käigus, mida korrati tulemuste kontrollimiseks vähemalt kaks korda.

Treenitud CCR2 pluss müeloidrakud on kasvajavastases mehhanismis peamised efektorrakud.

Arvestades kaasasündinud immuunrakkude pankreasesse liikumise täielikku pärssimist ja pankrease müeloidrakkude treenimist pärast WGP-ravi CCR2-/- hiirtel, arvasime, et CCR2-/- hiirtel ei ilmne ka WGP-treeningu kasulikke kasvajavastaseid immuunmõjusid. . Kooskõlas selle hüpoteesiga ei näidanud WGP-d saanud CCR2-/- hiirtel kasvajakoormust (joonis 7a) võrreldes WT-hiirtega.

See näitas, et CCR2 on vajalik väljaõppinud kaasasündinud immuunrakkude WGP-põhise sissevoolu jaoks kõhunäärmesse ja et need on tingitud kasvajavastasest toimest. Kuigi CCL2-CCR2 signaaliülekanne on kindlaks tehtud koolitatud monotsüütidest pärinevate makrofaagide pankreasesse värbamisel kriitilise tähtsusega, tahtsime ka teada, kas treenitud HSC-de olemasolu luuüdis ja tsentraalselt treenitud immuunsuse teke. üksi piisas ortotoopsete pankrease kasvajate kasvu aeglustamiseks.

Infiltreeruvate CCR2 pluss müeloidrakkude otsese kasvajavastase funktsionaalsuse täiendavaks kinnitamiseks sorteeriti WGP-ga treenitud hiirte CCR2 plus ja CCR{3}} müeloidsed populatsioonid, segati KPC kasvajarakkudega ja implanteeriti ortotoopiliselt hiirtele. CCR2 pluss rakkudega segatud kasvajad olid väiksemad kui need, mis olid segatud CCR2- rakkudega, mis kinnitab veelgi, et treenitud CCR2 pluss müeloidrakud ise on kasvajavastases mehhanismis esmased efektorrakud (joonis 7b). Nende kasvajate CyTOF analüüs näitas, et CCR2 pluss segatud kasvajates oli oluliselt vähem CD11b pluss müeloidrakke ja oluliselt suurenenud CD8 pluss T-rakkude arv kasvajas (joonis 7c, d). CD8 pluss T-rakkude: CD11b pluss müeloidrakkude suhe suurenes samuti oluliselt CCR2 pluss segamise tingimustes (joonis 7e).

Joonis 7 WGP-ravi kasvajavastased efektormehhanismid ja kliiniliselt olulised mudelid. WT ja CCR2 - / - hiiri töödeldi PBS või WGP-ga ja 7 päeva hiljem implanteeriti neile ortotoopilised KPC pankrease kasvajarakud. Teatatud on kasvaja kaal 21. päeval. (WT PBS n=5, WT WGP n=6, CCR2 PBS n=6, CCR2−/− WGP n=6). **p=0.0027 (WT PBS vs WT WGP), *p=0.0118 (WT WGP vs CCR2−/− PBS), **p=0.0034 (WT) WGP vs CCR2−/− WGP). b WGP-ga treenitud hiirte sorteeritud CCR2 plus ja CCR2− pankrease CD11b pluss rakud segati KPC rakkudega ja implanteeriti ortotoopiliselt. Kasvaja suurust hinnati 21 päeva hiljem (CCR2 pluss n=5, CCR2−n=5). *p=0.0247. c t-SNE graafikud, mis on genereeritud b) segatud kasvajate CyTOF analüüsiga. Klastrid, mis näitavad olulisi erinevusi rühmade vahel, on tähistatud ringidega. Kuvatakse iga rühma koguandmed (vasakul) ja tüüpilised t-SNE graafikud. d CD8 pluss ja CD11b pluss rakkude summeeritud protsent kombineeritud kasvajates (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.01, **p=0.007. e CD8 pluss:CD11b pluss rakkude suhe segatuumorites (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.0474. f PD-L1 ekspressioon KPC kasvajarakkudel, CD11b pluss ja F4/80 pluss rakkudel KPC kasvajas 21 päeva pärast implanteerimist (KPC n=5, CD11b pluss n=6, F4/80 pluss n=6). g WGP ja anti-PD-L1 ravi eksperimentaalne skeem. Hiiri (n=5) raviti PBS-i või WGP-ga ja 7 päeva hiljem implanteeriti neile ortotoopsed KPC pankrease kasvajad. 3., 7. ja 11. päeval pärast implanteerimist anti hiirtele anti-PD-L1 mAb või anti- roti IgG2b mAb isotüübi kontroll. Ellujäämist jälgiti. **p=0.0018 (WGP vs PBS või PD-L1), **p=0.0021 (WGP vs WGP pluss PD-L1). h Terapeutilises keskkonnas kasutatud WGP eksperimentaalne skeem. Hiirtele siirdati ortotoopilised KPC pankrease kasvajad ja neile manustati WGP-d, kui hiired olid operatsioonist taastunud 4. päeval ja nädal hiljem 11. päeval. *p=0.0163. Andmed esitati kui keskmine ± SEM. A jaoks kasutati mitme võrdlusega ühesuunalist ANOVA-d ning b, d ja e puhul paaritu, kaheosalise õpilase t-testi. g ja h jaoks kasutati log-rank testi. ns ei ole oluline. Iga proov esindab bioloogiliselt sõltumatut looma, mis on saadud ühe sõltumatu katse käigus, mida korrati tulemuste kontrollimiseks vähemalt kaks korda.

WGP sünergiseerub anti-PD-L1 mAb-raviga, et pikendada PDAC mudelite elulemust.

Kuigi WGP-treeningu tõttu ilmnes kasvajakoormuse oluline vähenemine, tekkis kõigil hiirtel surmaga lõppevad kasvajad. Meie uuringud näitasid, et WGP-ravi mõjutas drastiliselt kõhunäärme müeloidsete populatsioonide fenotüüpi.

Kuigi olime tuvastanud, et WGP kasvajavastase toime eest vastutavad esmased efektorrakud on CCR2 pluss infiltreeruvad monotsüüdid/makrofaagid, arutlesime, et need immuunsüsteemi muutused võivad mõjutada ka üldist TME-d viisil, mis võib muuta adaptiivsed immuunrakud vastuvõtlikumaks. kontrollpunkti blokaadi ravi. Täpsemalt, kuna me olime täheldanud CD8 pluss T-rakkude osakaalu suurenemist CCR2 pluss segatuumorites (joonis 7c) ja olime täheldanud ka olulist PD-L1 ekspressiooni KPC kasvajates esinevatel müeloidrakkudel (joonis 7f), oletasime, et WGP-ravi võib tugevdada PD-L1-vastase mAb-ravi toimet.

Et hinnata, kas PD-L1-vastane mAb-ravi sünergiseerub pankrease WGP-indutseeritud treenitud immuunsusega, anti seejärel PBS-i või WGP-ga töödeldud hiirtele, kellele implanteeriti ortotoopsed KCP-kasvajad, kas anti-PD-L1 mAb või roti IgG2b isotüübi kontroll-mAb. Nagu on näidatud mitmetes kliinilistes uuringutes, ei suutnud antiPD-L1 ravi üksi pikendada elulemust isegi kauem kui IgG2b isotüübi kontroll-mAb-ga ravitud hiirtel (joonis 7g). WGP-treenitud hiired elasid oluliselt kauem kui IgG2b isotüüp ja anti-PD-L1 töödeldud hiired. Kuid WGP ja anti-PD-L1 kombinatsioon pikendas elulemust kõige tõhusamalt. See näitab, et WGP kombineerimisel antiPD-L1 immuunkontrollpunkti blokaadiga on kliiniline kasu.

Siiani on WGP kasutamist kirjeldatud olukorras, kus WGP-d manustatakse enne kasvajarakkude implanteerimist. Arvestades selle mudeli kasvaja suuruse vähenemist, testisime ka kliiniliselt olulisemat mudelit, milles hiirtele implanteeriti ortotoopilised KPC kasvajad ja seejärel kasutati WGP-d treenitud immuunsuse esilekutsumiseks, joonis 7h). Terapeutilises keskkonnas pikendas elulemust ka WGP-st tingitud treenitud müeloidrakkude sissevool kõhunäärmesse. Need andmed koos viitavad sellele, et kõhunäärme treenitud immuunsuse käivitamisel WGP-ga on kõhunäärmevähi ravis asjakohased kliinilised rakendused, mis nõuavad edasisi translatsiooniuuringuid ja -uuringuid.

For more information:1950477648nn@gmail.com