Ent-11 -hüdroksü-15-okso-kaur-16-en-19-ohappe kõrge sisaldus Adenostemma Lavenia (L.) O. Kuntze leheekstraktis: esialgse in vivo testiga

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Akie Hamamoto, Ryosuke Isogai, Miwa Maeda, Masumi Hayazaki, Eito Horiyama, Shigeo Takashima, Mamoru Koketsu ja Hiroshi Takemori *

Abstraktne:Taust: Ent-11 -hüdroksü-15-okso-Kaur-16-een-19-hape(11 OH-KA) on multifunktsionaalne biokeemiline aine, mida leidub mõne sõnajala Pteris semipinnata ja selle sarnaste liikide puhul. Kuigi on välja pakutud mitmeid 11 OH-KA terapeutilisi rakendusi (nt vähivastane, põletikuvastane janaha valgendamine), 11 OH-KA sisaldus nendes sõnajalgades ei ole kõrge. Adenostemma lavenia (L.)O. Samuti on teatatud, et Kuntze, Asteraceae, sisaldab 11 OH-KA. A. Lavenia tervete taimede keetmist (kuumaveeekstrakti) kasutatakse rahvapärase ravimina põletikuliste haiguste, nagu ashepatiit ja kopsupõletik, raviks, mis viitab sellele, et 11 OH-KA võib olla selle taime raviomaduste eest vastutav koostisosa. Meetodid: A veeekstraktide melanogeenne toime. Lavenia lehte ja Pteris dispar Kunze (P. semipinnata sugulas) lehti võrreldi hiire B16F10 melanoomirakkudes. Summa11 OH-KAmõõdeti vedelikkromatograafia spektromeetria abil. C57BL/6J hiiri töödeldi A. Lavenia lehtede vesiekstraktiga ja mõõdeti 11 uM OH-KA kontsentratsioon veres. A. Lavenialeafi vesiekstrakti in vivo efektiivsust hinnati selle melanogeense vastase toime järgi, jälgides juuksevärvi. Tulemused: Kuigi mõlemad ekstraktid (A. Lavenia ja P. dispar Kunze) näitasid kõrget melanogeenset toimet, sisaldas ainult A. Lavenia suures koguses 11 OH-KA, ligikaudu 2,5 protsenti lehtede kuivkaalust.11 OH-KA saab A. Lavenia lehtedest puhastada kahes etapis: vee ekstraheerimine, millele järgneb kloroformi jaotamine. Hiirte töötlemine A. Lavenia lehtede vesiekstraktiga pärsib nende karvades pigmentatsiooni. Järeldused: Vaatamata uuritud hiirte väikesele arvule viitavad praegused esialgsed tulemused pärsitud karvapigmentatsiooni kohta sellele, et A. Lavenia lehtede vesiekstrakt ja selle tõenäoliselt põhjustav koostisosa – 11 OH-KA – on suukosmeetika uued materjalid. tulemused võivad olla abiks ka funktsionaalsete toitude ja meetodite edasisel väljatöötamisel hüperpigmentatsioonihäirete (nt melasma) all kannatavate patsientide raviks.

Märksõnad: 11 -hüdroksü-15-okso-kaur-16-een-19-hape; anti-melanogenees; naha valgendamine;funktsionaalne toit; meditsiiniline taim; Adenostemma Lavenia; Pteris dispar Kunze;türosinaas; B16F10 melanoom

Cistanche inhibeerib türosinaasi aktiivsust

1. Sissejuhatus

Uuringud melanogeensete reaktiivide kohtanaha valgendamineja vananemisvastased meetmed on muutunud sagedasemaks, eriti toiduainete koostisosade (puuviljad, köögiviljad ja ravimtaimed) puhul [1]. Funktsionaalsete toiduainetena ja toidulisanditena on välja töötatud ja turustatud mitmeid polüfenoole ja terpeene ning nende allikaid.

Diterpeen/kaureen ent-11 -hüdroksü-15-okso-kaur-16-en-19-ohape (11 OH-KA), mida leidub sõnajalgade lehtedes (Pteris semipinnata [2– 5], Pteris livida [6]) ja Compositae (Gochnatia decora [7]), on ka atraktiivne kandidaat melanogeensete reaktiivide jaoks [5]. Vaatamata selle laiale füsioloogilisele toimele (nt vähi- ja põletikuvastane toime) [8–11] on 11 OH-KA in vivo efektiivsuse kohta vaid mõned andmed, sealhulgas selle melanogeensuse vastase potentsiaali kohta, tõenäoliselt selle harulduse tõttu. ja piiratud arv allikaid.

Struktuuri ja aktiivsuse seoste uuringud, nii in vitro kui ka kultiveeritud rakkudes, on tuvastanud 11 OH-KA funktsionaalse aktiivsuse avaldamiseks olulised osad (joonis 1). Karboksürühma asendamine 19. positsioonil11 OH-KAmetüül- või hüdroksürühmade abil muudab selle ühendi suure vähivastase toimega ühendiks, mis näitab, et 19-karboksüülrühm nõrgendab selle ühendi rakulist toksilisust [5,10,12]. Seevastu alkeenrühm 16. positsioonis, ketoonirühm 15. positsioonis ja hüdroksürühm positsioonis 11 suurendavad apoptootilist aktiivsust, aktiveerides kaspaasi signaaliraja [10, 12]. Need osad ei ole aga kaureenide rakusurma signaalide jaoks hädavajalikud. Põletikuvastase toime struktuursed nõuded on sarnased vähivastase toime omadega, mis viitab läbirääkimisele tavaliste rakuliste sihtmärkide, näiteks tuumafaktori kappa B (NF-κB) kaudu [12].

Türosinaason melaniini sünteesi kiirust piirav ensüüm [13,14]. Ensüüm katalüüsib järjestikuseid reaktsioone: türosiini muundamine l-3,4-dihüdroksüfenüülalaniiniks, l-dopaks ja seejärel dopakinooniks. Oleme teatanud, et 11 OH-KA inhibeerib türosinaasi geeni ekspressiooni, mis tulemuseks on allasuruminemelanogeneeshiire B16F10 melanoomirakkudes [5]. 11 -hüdroksü-, 15-okso- ja 16-en-rühmad 11 OH-KA-s on selle jaoks asendamatud.anti-melanogeneesaktiivsus, mis erineb 11 OH-KA struktuurinõuetele võrreldes teiste tegevustega, nagu vähi- või põletikuvastane toime.

Seega on 11 OH-KA oma melanogeense toime poolest ainulaadne ühend kaureenide seas. Kahjuks on meie eelmine allikas Pteris dispar Kunze.11 OH-KA, sisaldas ainult väikeses koguses seda ühendit [5] ja selle sõnajala, nagu ka P. semipinnata (sugulane) [4,15] kohta ei ole andmeid selle kohta, kuidas seda ühendit oleks kasutatud. Veelgi enam, kõigis varasemates katsetes kasutati 11 OH-KA ekstraheerimiseks orgaanilisi lahusteid (metüül- või etüülalkoholi, kloroformi või heksaani), ilma et oleks olnud andmeid vesiekstrakti kasutamise kohta.

Peaaegu 40 aastat tagasi avastas Ameerika rühmitus AdenostemmaLavenia (L.) O. Kuntze (Asteraceae) liigist 11 OH-KA ja selle derivaate [16]. Kuigi A. Laveniat ei ole piisavalt uuritud seoses võimalike saasteainete (nt anorgaanilised saasteained [17] ja seente poolt toodetud sekundaarsed metaboliidid [18, 19]) lehtedes ja muudes osades, müüakse terve taime pulbrit (nimega Ma Zhi Hu) Ameerika Ühendriikidesse arstide loal (tooteid saab hankida ettevõttest QualiHerb, Cerritos, CA, USA: lisamaterjalid, joonis S1). Seetõttu selles uuringus, mõõtes11 OH-KAsisu ja hinnates selle melanogeense toime tõhusust, uurisime A. Lavenia lehtede vesiekstrakti potentsiaali kasutamiseks sisekosmeetikas, samuti uut kategooriat funktsionaaltoite [20–22], mida saab kasutada raviks. patsientidel, kellel on hüperpigmentatsioonihäired, näiteks melasma. Siiani on hüperpigmentatsioonihäirete sisemise ravimina saadaval ainult traneksaamhape (hemostaatiline ravim) [23,24].

Siin teatame, et A. Lavenia lehed sisaldavad kõrgel tasemel 11 OH-KA-d (ligikaudu 2,5 protsenti lehtede kuivkaalust). A. Lavenia lehe veeekstrakt pärsib tõhusaltmelanogeneesB16F10 rakkudes ja11 OH-KAvõib olla vastutav 50 protsendi vesiekstrakti melanogeense toime eest. Hiirte suukaudne töötlemine A. Lavenia lehtede vesiekstraktiga põhjustab nende karvade pigmentatsiooni pärssimist.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. A. lavenia paljundamine

Kuna A. lavenia on enamikus Jaapani piirkondades ohustatud liikide nimekirjas, kasvatasime seda taime oma labori lähedal asuval põllul. A. lavenia paljundati jagamise teel 10 seemikult ja selles uuringus kasutati peaaegu 100 kuivatatud lehte, mis olid koristatud 2019. aasta juunist juulini.

2.2. 11 OH-KA puhastamine veeekstraktidest ja selle analüüs

Puhas 11 -OH KA (autentne) osteti ettevõttelt BioBioPha (Shanghai, Hiina). A. lavenia või P. dispar Kunze lehtedest saadud kuivatatud lehepulbrit (100 mg) leotati 1 ml destilleeritud vees (10-mahu ekstraheerimiseks) 12 tundi ja jäägid eemaldati tsentrifuugimisega temperatuuril 12 °C. 000 pööret minutis 10 minuti jooksul. Saadud ekstrakte analüüsiti kõrgjõudlusega (HP) vedelikkromatograafiaga (LC), kasutades C18 ODS kolonni (4,6 mm × 50 mm: RP-18 GP, Kanto Kagaku, Tokyo, Jaapan) gradiendiga 40 protsenti. metanool/vesi kuni 100% metanoolini 10 minuti jooksul. 11 -OHKA tuvastamine viidi läbi ultraviolettkiirguse (UV) neeldumise määramisega 245 nm juures (A245). 20-, 30- ja 50-mahu ekstraheerimiseks ekstraheeriti 50 mg, 33 mg ja 20 mg kuivatatud lehtede pulbrit 1 ml destilleeritud veega.

A. lavenia {{0}}OH KA struktuuri kinnitamiseks puhastati kaurenoehapet poolsuures mahus. Kokku 100 g kuivatatud A. lavenia lehti ekstraheeriti kaks korda 20 mahust veest, lehtede vesiekstraktile lisati ekvivalentne kogus CHCl3 ja CHCl3 faasist saadi 11 -OH KA. Taastatud CHCl3 faasi aurustamise ajal sadestus 11 -OH KA valgete kristallidena. Need kristallid eraldati paberfiltriga. Saadud kristalle analüüsiti tuumamagnetresonantsi (NMR) abil (1H-NMR (CDCI3) 8 0,95 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,05-2,22 (15H, m), 2,37 (1 H, d, J { {27}},9 Hz), 3,06 (IH, lai s), 4,06 (1 H, d, J=4,6 Hz), 5,27 (1 H, s) ja 5,87 (IH, s)). Kristalli 1H-NMR spekter langes kokku autentse 11 -OH KA spektriga (vt lisamaterjalide joonist S2).

2.3. 11 OH-KA analüüs hiire seerumis

Ülijõudlusega LC (UPLC)-massispektromeetria (MS) analüüside meetodid võeti mitmest dokumendis [25, 26] kasutatud meetoditest. Lühidalt, hiirte (C57BL/6J) raviks ekstraheeriti A. lavenia lehti 30 mahuosa veega. Pärast steriliseerimist temperatuuril 120 ◦C 20 minutit lahjendati ekstrakti veel 2 mahuosa veega ja serveeriti joogiveena. 11 -OHKA farmakokineetika uurimiseks manustati suukaudselt 100 mg/kg ühendit, mis oli suspendeeritud 1% Tween 80-s (Kanto Kagaku, Tokyo, Jaapan). Veri saadi sabaveeni kaudu 15–240 minutit pärast manustamist.

{{0}}OH KA mõõtmiseks hiire veres ekstraheeriti seerum (20 µL) 200 µL atsetonitriiliga. Ekstraheerimise efektiivsuse normaliseerimiseks lisati seerumile enne ekstraheerimist 10 nmol 18 -glütsürretiinhapet (Kanto Kagaku). Pärast atsetonitriili eemaldamist aurustamisega lahustati ühendid 5 µL metanoolis, millele järgnes 5 µL H2O lisamine. Seejärel kasutati LC-MS spektromeetria jaoks 1 µLof lahust (MS: Waters Xevo G2-XS QTof, Waters, Milford, MA). 11 -OH KA eraldamiseks kasutati C18 ODS kolonni (3,0 mm). × 150 mm (5 µm): RP-18 GP, Kanto Kagaku) ​​ja 10 minuti jooksul rakendati gradienti vahemikus 35% atsetonitriil/vesi kuni 100% atsetonitriil. MS-i tingimused olid järgmised: kapillaar (kV), 2,20; proovivõtu südamik, 45; väljatõmbekoonus, 4,0. Kuna meil ei õnnestunud MS/MS analüüside abil tuvastada 11 -OH KA fragmente (lisamaterjalide joonis S3A), kvantifitseeriti 11 -OH KA ainult MS signaalidega, jälgides massi ja laengu suhet (m/). z) 331,1879 0,01 Da teega (lisamaterjalide joonis S3B). Standardkõver valmistati, lisades 11 -OH KA (lõppkontsentratsioonil 0,1–3 µM) 50% metanooli/vee segule, mis oli valmistatud tavalisest hiire seerumist, kasutades sama protseduuri 11 -OH jaoks. KA ekstraheerimine. 18 -glütsürretiinhapet mõõdeti LC-UV abil samadel tingimustel, mida kasutati 11 -OH KA mõõtmisel. Need loomkatsed kiitis heaks Gifu ülikooli loomkatsete komitee (H30-041). Loomade heaolu nõuete täitmiseks kasutasime minimaalset arvu hiiri.

2.4. Melanogeneesi test

Hiire B16F10 melanoomi rakke Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (RIKEN, Tsukuba, Jaapan) kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM-High glucose (4,5 g/l d-glükoosi), WAKO, Kyoto, Jaapan) ja lisati 10 protsenti. veise loote seerum ja antibiootikumid. Rakke inkubeeriti niisutatud atmosfääris 5% CO2-ga temperatuuril 37 °C ja viidi iga kahepäevase viatrüpsiniseerimise järel uutele kultiveerimisplaatidele.

Rakud (2 × 105) plaaditi 6-süvendiga plaadile ja inkubeeriti 12–16 tundi enne induktsiooni.melanogenees. Melanogeneesi kutsus esile 20 µM forskoliini (Fsk) koos A. laveniavee ekstrakti või 11 -OH KA-ga 48 tunni jooksul. Melaniini mõõtmised viidi läbi vastavalt kirjandusele [5]. Lühidalt, rakke pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega ja koguti 2 ml kogumistuubidesse, millele järgnes tsentrifuugimine kiirusel 8000 p/min 1,5 minutit. Iga rakusade suspendeeriti 200 µL destilleeritud vees ja 50 µL kasutati valgusisalduse mõõtmiseks. Ülejäänud 150 µL segati 150 µL 2 M NaOH-ga ja seejärel lüüsiti inkubeerimisega 45 ◦ C juures 2 tundi. Melaniin ekstraheeriti kloroformi-metanooli 2:1 seguga ja mõõdeti spektrofotomeetriga (Glomax Multi, Promega, Madison, WI, USA) 405 nm juures. Rakupelletite valgukontsentratsioon määrati Bradfordi reagendiga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja seda kasutati melaniinisisalduse normaliseerimiseks.

Tistanche ekstrakti toime: pärsib melaniini ja naha valgendamist

2.5. Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi Studenti t-testi abil, kui andmed saadi sama katse käigus. Me ei kasutanud statistilisi analüüse, kui katsed viidi läbi erinevatel päevadel või kui proovide arv oli ainult kaks.

3. Tulemused

3.1. A. Lavenia sisaldab suures koguses 11 OH-KA

Varem teatasime, et P. disper Kunze lehtede etanooliekstrakt, mis oli valmistatud 10 mahuosa kuivmassi (v/w) etanooliga, inhibeeris tõhusaltmelanogeneesB16F10 rakkudes isegi pärast 1/1000 lahjendust [5]. A. lavenia kuivatatud lehtede vesiekstraktide ja P. disper Kunze lehtede vesiekstraktide efektiivsuse võrdlemiseks valmistasime ekstraktid (20 mahuosa vett (v/w kuivatatud lehti)) ja lisasime need koos kultiveerimissöötmesse. forskoliiniga (melanogeneesi indutseerija – acAMP agonist). Mõlemad ekstraktid inhibeerisid tõhusalt melaniini sünteesi isegi lahjenduses 1/1000, kui visuaalselt hinnati themelaniini sisaldust (joonis 2A). Melaniinisisaldus mõõdeti pärast NaOH ekstraheerimist (joonis 2B). Lahjenduses 1/3000 vähendas A. lavenia ekstrakt melaniinisisaldust 69 protsenti võrreldes kontrolliga (ainult Fsk) ja P. disper Kunze ekstrakt vähendas melaniini sisaldust 41 protsenti. Lahjendusel 1/1000 vähendas A. lavenia ekstrakt melaniinisisaldust täielikult, samas kui P. disperKunze ekstraktid vähendasid melaniinisisaldust 60 protsenti. Seda erinevust ei täheldatud, kui ekstraktid lahjendati 1/300.

LC-UV analüüsid näitasid seda11 OH-KAoli A. laveniavee ekstrakti põhikomponent (joonis 2C, vasakul). Seevastu 11 OH-KA selget piiki ei tuvastatud, kui P. Disperg Kunze ekstrakti analüüsiti (joonis 2C, paremal). LC-MS analüüsid näitasid, et noolega tähistatud tipp vastas 11 OH-KA-le (andmeid pole näidatud). Need tulemused näitavad, et 11 OH-KA võib olla peamine komponent, mille eest vastutabmelanogeneesinhibeerimine A. lavenia ekstraktis, samas kui derivaadid nagu glükosüülitud vormid [5] võivad eelistatavalt kaasa aidata melaniini inhibeerimisele P. disperg Kunze ekstrakt.

Järgmisena proovisime puhastada11 OH-KAlevitamise järgi. CHCl3 suutis ülaltoodud A. lavenia veeekstraktist ekstraheerida 11 OH-KA kõrge puhtusega (üle 87 protsendi) (joonis 2D, vasakul). CHCl3-s kristalliseerunud aine NMR analüüside spektrid olid identsed autentse11OH-KA omadega (vt Materjalid ja meetodid). Seevastu P. disper Kunze veeekstraktist ekstraheeriti suur hulk tundmatuid ühendeid (joonis 2D, paremal). LC analüüside kokkuvõte on näidatud joonisel 2E, mis viitab sellele, et A. lavenia on atraktiivne 11 OH-KA allikas.

3.2. Sobiv 11 OH-KA ekstraheerimine A. laveniast

Internetist leitud teabe kohaselt kasutatakse Hiinas ja Taiwanis A. lavenia kõiki osi (leht, vars ja juur) taimsete ravimitena. Et teha kindlaks parimad tingimused 11 OH-KA ekstraheerimiseks A. laveniast, uurisime esmalt, millised taime osad on selle ühendi rikkad. Veeekstraktid valmistati ainult lehtedest või õhust osadest. ThemelanogeneesB16F10 rakkude analüüs näitas, et õhust osadest (varred ja lehed) valmistatud ekstraktil oli vähem melanogeenset toimet kui ainult lehtedest valmistatud ekstraktil (joonis 3A, vasakul). See viitab sellele, et varred (mis moodustavad rohkem kui 90 protsenti kuivaine massist) sisaldavad vähem11 OH-KA, mida kinnitasid LC-UV analüüsid (joonis 3A, paremal).

Järgmisena uurisime, mitu mahtu tuleks ekstraheerimiseks kasutada. Ilmselt võib väike kogus vett (10-korda) rikastada11 OH-KA(Joonis 3B). Spekuleerisime, et 11 OH-KA vähene lahustuvus vees võib aidata seda ühendit jääkides säilitada. 11 OH-KA maksimaalset taastumist vees täheldati, kui kasutati rohkem kui 30 mahuosa vett (joonis 3C). Seetõttu, võttes arvesse 11 OH-KA maksimaalset taastumist ja rikastamist vees, kasutasime hilisemates katsetes 30 mahtu vett.

Hiinas ja Taiwanis ekstraheeritakse A. lavenia kuumas vees, mille kaudu uuriti 11 OH-KA termilist stabiilsust. Vesiekstrakte inkubeeriti temperatuuril 90 °C või 120 °C 10 või 20 minutit ja 11 OH-KA sisaldust analüüsiti LC-UV abil. Need termilised töötlused tekitasid suurel hulgal settimist, mis tõenäoliselt koosnes denatureeritud valgust. The11 OH-KAlahustuva fraktsiooni sisaldus on ilmselt suurenenud (joonis 3D), mis võib olla tingitud nende sedimenteerunud materjalide eemaldamisest.

3.2.1. OH-KA on A. Lavenia veeekstraktis sisalduv ühend, mis vastutab melanogeense aktiivsuse eest B16F10 rakkudes

Kui 1 g lehti ekstraheeriti 3 0 mahus vees, oli 11 OH-KA sisaldus ligikaudu 0,6 mg/ml (1,8 mM). Panuse määra kindlaksmääramiseks11 OH-KAA. lavenia vesiekstraktis antimelanogeense toime suhtes testiti autentse 11 OH-KA erinevaid kontsentratsioone B16F10 rakkudes. Visuaalne uurimine (joonis 4A) ja melaniinisisalduse mõõtmine (joonis 4B) näitasid, et veeekstraktid (joonis 4A, ülemine komplekt), mis näitasid melanogeense toime osas sama efektiivsust kui autentsed 11 OH-KA üksinda (joonis 4A, alumine komplekt) sisaldas ainult pool kogust11 OH-KA. Need tulemused viitavad sellele, et ekstraktis sisalduv 11 OH-KA aitas kaasa peaaegu 50 protsendile ekstrakti melanogeense toime vastasest toimest. Ülejäänud 50 protsenti võivad olla tuletatud 11 OH-KA derivaadist, näiteks glükosiidivormidest, mis võib samuti seletada 11 OH-KA madalat sisaldust P-s. disperg Kunze ekstrakti vaatamata selle kõrgele efektiivsusele melanogeense toime osas (joonis 2).

Tistanche ekstrakti toime: vananemisvastane ja valgendav nahk

3.2.2. OH-KA on A. lavenia ekstraktis sisalduv ühend, mis vastutab melanogeense aktiivsuse eest hiirtel

Esialgsete tulemuste saamiseks A. lavenia kui kosmeetikamaterjali edasise arendamise kohta teostasime in vivo analüüse, kasutades väikest arvu hiiri. Esmalt uurisime 11 OH-KA farmakokineetikat hiirtel. Umbes 25 g kehamassiga hiirtel tarbiti vett umbes 4 ml päevas. 11 OH-KA maksimaalne lahustuvus A. lavenia veeekstraktis (vt joonis 3C, 20–30 mahtu vett: 0,6 mg/ml) võib teoreetiliselt anda 100 mg/kg selle kaureenhappe päevane annus (4 ml 0,6 mg/ml 11OH-KA-st 2,4 mg päevas; 2,4 mg normaliseerimine hiire kehamassi (25 g) järgi andis tulemuseks 96 mg/kg). Seetõttu otsustasime ravida hiiri 100 mg/kg11OH-KA-ga (suspendeeritud 200 µl 1-protsendilises Tween 80-s).

Suuõõne ravi koos11 OH-KApõhjustas selle kiire ilmumise (15 minuti jooksul) veres (joonis 5A). Kontsentratsioon saavutas ja säilitas efektiivse annuse B16F10 rakkudes. See näitab, et 11 OH-KA võib imenduda läbi seedetrakti. Kuid asjaolu, et kontsentratsioon vähenes 60 minuti jooksul, viitab selle ühendi kiirele eritumisele.

Järgmisena uurisime 11 OH-KA kroonilist toimet hiirtel. Kuna isegi 0,6 mg/mL 11 OH-KA sadestub joogivees kiiresti, kui11 OH-KAoli puhas, otsustasime testida A. lavenia vesiekstrakti. Siiski võib A. lavenia veeekstrakt sisaldada tundmatuid kibeda maitsega koostisosi. Seetõttu tuli ekstrakti täiendavalt lahjendada kahe mahuosa veega (lõppväärtusega 0,3 mg/mL 11 OH kohta -KA, ligikaudu 50 mg/kg/päevas). Hiiri töödeldi veeekstraktidega 1 nädal ja seejärel võeti nende vereproovid (joonis 5B). LC-MS analüüsid tuvastasid 11 OH-KA veres poolefektiivses kontsentratsioonis. Uuriti ka P. dispar Kunze veeekstrakti, mis oli valmistatud sama protseduuriga nagu A. lavenia vesiekstrakt. 11 OH-KA sisaldus P. dispar Kunze ekstraktiga ravitud hiirte veres oli 10 korda madalam kui A. lavenia ekstraktiga töödeldud hiirtel.

Täiskasvanud hiirtel peatub karvakasv telogeeni staadiumis mitmeks kuuks ja uus kasv (anageen) tekib erinevates piirkondades juhuslikult vaid mõne päeva jooksul [27]. Seetõttu uurige selle mõjumelanogeneesinhibiitoritega, peaks ühenditega (inhibiitoritega) ravi kestus olema pikk (nt mitu kuud). Seevastu udukarvad asendatakse 3–4-nädalaste (W) faasis sünkroonselt täiskasvanud juustega. Seega, kui 3W hiiri ravitakse 2 nädala jooksul inhibiitoritega, mõjubmelanogeneessaab hinnata äsja kasvanud juuste (st esimese täiskasvanud juuste) pigmentatsiooni (värvi) järgi 5W–6W [28].

Kui hiiri raviti A. lavenia ekstraktiga joogivee kaudu kaks nädalat (3W–4W), siis nende pigmentatsioon äsjakasvanud karvades pärssis (joonis 5C). Seevastu nende silmapigmentatsiooni see ei mõjutanud. P. dispar Kunze ekstraktiga töödeldud hiirtel ei täheldatud karvade pigmentatsiooni pärssimist. Need tulemused viitavad sellele, et A. lavenia lehtede ekstrakt võib sisaldada melanogeenseid aineid, võib-olla 11 OH-KA, mis on in vivo tõhusad, samas kui P. dispar Kunze lehtede ekstrakt, mis on tõenäoliselt rikas11 OH-KAderivaadid, ei pruugi olla in vivo tõhusad.

cistanche eelis: antioksüdatsioon

4. Arutelu

Leidsime, et A. lavenia lehed sisaldavad suures koguses 11 OH-KA-d (ligikaudu 2,5 protsenti lehtede kuivkaalust). Vaatamata selle ühendi hüdrofoobsele olemusele ekstraheeris vesi tõhusalt 11 OH-KA. Kuna 11 OH-KA vees oli stabiilne temperatuuril 120 ◦C 20 minutit, steriliseerisime A vesiekstrakti. lavenia lehest ja manustati seda hiirtele. Tulemused kinnitasid olemasolu11 OH-KAvesiekstrakti tugevus melanogeense reagendina in vivo.

11 OH-KA ja selle derivaatide esinemisest A. lavenias teatati aastatel 1979 [16] ja 1990 [29]. Sellest ajast saadik on ainult ühes Indoneesias tehtud uuringus teatatud A. lavenia koostisosade igakülgsest analüüsist [30]. Siiski ei tuvastatud nendes materjalides 11 OH-KA. Veelgi enam, 11 OH-KA füüsikaliste omaduste kohta, mida saab ekstraheerida A. laveniast puhta veega, ei ole uuritud.

India rahvapäraste ravimeetodite ülevaateartikkel viitab A. lavenia veeekstraktile kui seedesüsteemi häirete ravivahendile [31]. Internetiotsing "A. lavenia" või selle hiinapärase nimetuse põhjal soovitas seda taime mõnelgi kasulikul viisil kasutada põletikuvastase ravimtaimena kuumaveeekstrakti (st lisandina) (nt hepatiidi, kopsupõletiku (allergia ja krooniline obstruktiivne) kopsuhaigus) ja nahapõletik). PubMed ei leidnud aga ametlikke aruandeid A. lavenia ekstraktide bioloogilise aktiivsuse ega selle taime ökoloogilise seisundi kohta. Meie linnas (Gifu, Jaapan) on A. laveniais loetletud ohustatud liikidena. A. lavenia haruldus võib raskendada analüüsi ja selle potentsiaali arendamist taimse ravimi ja funktsionaalse toiduna.

Teisest küljest kasulik potentsiaal11 OH-KA, puhastatud P. semipinnata'st, on määratud in vitro ja in vivo [8–11]. Kuigi me ei uurinud P.semipinnata 11 OH-KA sisaldust, oletame, et see sisaldus ei pruugi olla väga kõrge võrreldes A. lavenia omaga, sestP. semipinnata on tihedalt seotud P. disper Kunzega. Lisaks pole isegi Internetis mingeid andmeid nende sõnajalgade kasutamise kohta inimestel. See taust viitab sellele, et A. lavenial võib olla suurem potentsiaal taimse ravimina kui neil sõnajalgadel, kui on näidatud, et 11 OH-KA-l on kliiniline potentsiaal.

Uuringud potentsiaali kohta11 OH-KAon keskendunud selle tegevusele vähivastase [2,10,11,32] ja põletikuvastase [11,33] ainena. Siiski on tõsi ka see, et nende tegevuste jaoks vajalikud 11 OH-KA annused on üle 20 µM, mis on suhteliselt kõrge. Seevastu kontsentratsioonil alla 1 µM kaureen-ent-11 -hüdroksü-16-karen-15-on, millel on karboksüülrühma asemel 19-asendis metüülrühm. 11 OH-KA rühmas on kõrge apoptootiline aktiivsus inimese HL-60 monotsüütide suhtes [12]. Need erinevused viitavad sellele, et 19-asend võib olla rakulise toksilisuse määraja [5].

Kuigi kasvaja- ja põletikuvastaseid toimeid leidub mitmesugustes kaureenides [7,34–36], on 11 OH-KA eripäraks teatud tüüpi melanogeenne toime [5]. On leitud, et mitmed looduslikud ühendid, nagu flavonoidid ja terpenoidid, moduleerivadmelanogeneesmuutes mikroftalmia transkriptsioonifaktori (MITF) ekspressiooni, mis on melanogeensete programmide jaoks hädavajalik [13, 14]. Erinevalt nendest ühenditest ei ole kaurens- ega kaureenhapetes leitud MITF-i modulaatoreid.

11 OH-KApärsib väljendusttürosinaasKuigi 11 OH-KA ei muuda MITF-i ekspressiooni ega aktiivsuse taset, pärsib 11 OH-KA türosinaasi geeni promootori aktiivsust MITF-i siduvast elemendist sõltuval viisil [5]. Huvitaval kombel põhjustab MITF-i üleekspressioon B16F10 rakkudes türosinaasi promootori aktiivsuse 11OH-KA-vahendatud supressiooni tühistamise, mis viitab sellele, et 11OH-KA võib värvata MITF-i siduvasse elemendisse tundmatu repressori. Veelgi enam, mehhanism, mille abil 11 OH-KA pärsibtürosinaaspromootori aktiivsus võib erineda sellest, mis põhjustab tsütotoksilisust, kuna melanogeenset aktiivsust täheldatakse isegi siis, kui B16F10 rakke töödeldakse 1,2 uM 11OH-KA-ga (joonis 4).

Primaarsetest keratinotsüütidest ja melanotsüütidest koosneva inimese kolmemõõtmelise nahamudeliga seotud uuringud näitavad, et 1 mM paiksel kasutamisel.11 OH-KApärsib täielikult naha pigmentatsiooni [5]. Melanogeense aktiivsuse poolest võrdub 1 mM 11OH-KA ligikaudu 6,6 mg/ml (0,66 protsenti) kuivatatud A. Lavenia lehtedega (joonis 3). Selles kontekstis on A. Lavenia atraktiivne kosmeetikatoodete allikasnaha valgendamine. Lisaks kasutatakse A. Laveniat rahvameditsiinis ning 11 OH-KA efektiivsete annuste (kontsentratsioonide) vahel on melanogeensuse ja tsütotoksilisuse vastane toime.

Oluline on see, et traneksaamhape (hemostaatiline ravim) pärsib melaniini ladestumist inimese nahas ja seda kasutatakse suukaudse ravimina melasma raviks [23, 24]. Huvitaval kombel muutis traneksaamhappega töödeldud hiirte karusnahk mustast pruuniks [37]. Käesolevas uuringus näitasime ka, et A. Lavenia lehtede vesiekstrakt võib suukaudsel manustamisel hiirtel tõhusalt pärssida karvade pigmentatsiooni (mustast pruunini), mis viitab sellele, et A. Lavenia lehte saab arendada nii sisekosmeetikaks kui ka funktsionaalseks toiduks [20– 22] melasma all kannatavatele patsientidele. Täiendavad uuringud on vajalikud A. Lavenia ekstraktide rakuliste sihtmärkide ja11 OH-KA, samuti nende ohutust.

cistanche tabletidjaoksnaha valgendamine