Pinotsembrini efektiivsus ja ohutus bleomütsiini põhjustatud kopsufibroosi lambamudelis

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne

EsmaneflavonoidPinotsembriinil arvatakse olevat mitmesugused meditsiinilised kasutusalad, mis on seotud selle antioksüdandiga,põletikuvastane, antimikroobsed ja vähivastased omadused. Mõned uuringud on teatanud, et sellel flavonoidil on fibroosivastane toime. Selles uuringus uurisime, kas pinotsembriin takistab fibroosi, summutab põletikku ja parandabkopsufunktsiooni kopsufibroosi suurel loomamudelil. Iga uuringus osalenud 10 lamba puhul kutsuti esile fibroos kahes lokaliseeritud kopsusegmendis. See saavutati kahe bleomütsiini infusiooniga, mis manustati bronhoskoopiliselt kahenädalase intervalliga. Teine kopsusegment samal lambal jäeti ravimata ja seda kasutati terve kontrollina. Loomi hoiti veidi üle 5 nädala pärast viimast bleomütsiini infusiooni. Eukalüpti lehtedest eraldatud pino-tsembrini manustati ühele kahest bleomütsiini kahjustatud kopsusegmendist annuses 7 mg. Seda annust manustati üks kord nädalas 4-nädala jooksul, alustades üks nädal pärast viimast bleomütsiini infusiooni. Kopsude sobivus (jäikuse mõõtena) paranes oluliselt pärast pinotsembrini neljanädalast manustamist bleomütsiini kahjustatud kopsusegmentidele. Pinotsembriiniga töödeldud bleomütsiiniga infundeeritud kopsusegmentide bronhoalveolaarses loputuses oli neutrofiilide ja põletikuliste rakkude arv oluliselt väiksem. Võrreldes bleomütsiini kahjustatud kopsusegmentidega ilma ravimita, seostati pinotsembrini manustamist kopsu parenhüümis oluliselt väiksema immunopositiivsete CD8t ja CD4 pluss T-rakkude arvuga. Histopatoloogilised punktiandmed näitasid, et ravi pinotsembriiniga oli seotud põletiku ja üldiste patoloogia skooride olulise paranemisega. Hüdroksüproliini analüüs näitas, et pinotsembrini manustamine ei vähendanud selles mudelis bleomütsiini poolt esile kutsutud suurenenud kollageenisisaldust. Massoni trikroomiga värvitud lõikude analüüsid näitasid, et pinotsembriinravi vähendas oluliselt sidekoe sisaldust bleomütsiiniga kokku puutunud kopsusegmentides, võrreldes bleomütsiiniga infundeeritud kopsudega, mis ei saanud pinotsembriini. Pinotsembrini manustamise silmatorkav põletikuvastane ja tagasihoidlik antifibrootiline ümberkujundamisefekt oli tõenäoliselt seotud ühendi võimega parandada kopsupatoloogiat ja funktsionaalset vastavust selles kopsufibroosi loommudelis.

Lisateabe saamiseks klõpsake

Sissejuhatus

Esmaneflavonoid, pinotsembriin, on tuvastatud ja isoleeritud paljudest taimeliikidest. Arvatakse, et sellel bioaktiivsel molekulil on mitmesuguseid meditsiinilisi kasutusalasid, mis on seotud selle antioksüdandiga,põletikuvastane, antimikroobsed ja vähivastased omadused [1-7]. Oluline on see, et pinotsembriinil on mitmete erinevate haiguste loommudelite puhul antifibrootilised omadused. Näiteks vähendab pinotsembriin vatsakeste fibroosi [8] depressiooni rotimudelis ja kodade fibroosi müokardiinfarkti rotimudelis [9]. Sarnaselt vähendas pinotsembriini suukaudne manustamine kloroformist põhjustatud maksafibroosi eksperimentaalses rotimudelis kollageeni ja alfa-SMA (kasutatakse müofibroblastide diferentseerumise markerina) ekspressiooni fibroosi mõõtmiseks [10]. Hiljutine uuring näitas

Pinotsembriin leevendab bleomütsiini poolt indutseeritud nahafibroosi hiirtel ning pärsib keloidsete fibroblastide ja hiire primaarsete dermaalsete fibroblastide proliferatsiooni, migratsiooni ja invasiooni in vitro [11]. Pinotsembriin kutsus esile need fibroosivastased toimed NF-x ja TGF- 1/Smad signaaliradade allareguleerimise kaudu [10,11].

Arvestades pinotsembrini teadaolevaid fibroosivastaseid toimeid, püüdsime välja selgitada, kas pinotsembriin takistab fibroosi ja parandabkopsude funktsioonkopsufibroosi suurel loomamudelil. Kopsufibroosi füsioloogiliselt ja farmakoloogiliselt oluline mudel töötati välja vahendina inimese haigusseisundi idiopaatilise kopsufibroosi (IPF) põhihaiguse mehhanismi(de) uurimiseks[12,13]. See on olnud kasulik ka uute kopsufibroosi ravimeetodite testimisel [14-16].

Idiopaatiline kopsufibroos (IPF) on laastav krooniline kopsuhaigus, mida iseloomustab progresseeruv kopsuarmistumine, mis on tingitud ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) ülemäärasest kuhjumisest kopsu parenhüümi [17]. IPF-i prognoos on väga halb, patsientide keskmine elulemus pärast diagnoosimist on 3-5 aastat [18]. Praegu saadaval olevad farmakoloogilised ravimeetodid piirduvad pirfenidooni ja nintedaniibiga – ravimitega, mis on näidanud, et need ainult aeglustavad haiguse progresseerumist ilma seda peatamata. Lisaks on nende kahe ravimiga seotud märkimisväärsed kõrvaltoimed. Seetõttu on selle seisundi jaoks vajadus uute tõhusate ravimeetodite järele rahuldamata.

Selle uuringu eesmärk oli hinnata pinotsembrini terapeutilist efektiivsust ja ohutust meie laboris välja töötatud bleomütsiinist põhjustatud kopsufibroosi lambamudelis (12). Täpsemalt, viidi läbi uuring, et teha kindlaks, kas pinotsembrini lokaalne kopsu manustamine nõrgendas märkimisväärselt fibroosi, põletikku ja histopatoloogiat spetsiifilistes kopsusegmentides pärast fibroosi esilekutsumist bleomütsiiniga. Oluline on see, et tegime kindlaks, kas pinotsembrini kohalik manustamine parandas oluliselt bleomütsiini poolt indutseeritud fibroosiga spetsiifiliste kopsusegmentide füsioloogilist funktsiooni.

materjalid ja meetodid

Fibroosi esilekutsumine lamba kopsusegmentides

Selles uuringus kasutasime kokku 10 lammast. Me indutseerisime fibroosi iga lamba kahes kopsusegmendis sarnaselt varasemate uuringutega [12, 13]. Seda kehtestatud protseduuri (vt üksikasju allpool) kasutades piirdus fibroos kopsude väikeste, isoleeritud piirkondadega, jättes ülejäänud 90-95 protsendile tervetest puutumata kopsudest normaalse hingamisfunktsiooni.

Kõigile uuringus osalenud lammastele manustati 2 ühekordset bleomütsiini annust (3 ühikut) kopsusegmendi kohta 2-nädalase vahega ja loomi peeti veidi üle 5 nädala pärast lõplikku bleomütsiini annust. Manustamisprotseduur hõlmas bronhoskoobi sisestamist kopsu segmentidesse. paremas ja vasakus kopsus ning seejärel aeglaselt bronhoskoobi biopsiapordi kaudu infundeerides bleomütsiini kaheks segmendiks, nagu on näidatud joonisel 1.

Bleomütsiini infusioonide ajastus, vereproovide võtmine, bronhoalveolaarse loputuse proovide võtmine ning kopsufunktsiooni testimine ja pinotsembrini kasutamine on üksikasjalikult kirjeldatud jaotises Eig2. Kõik katseloomade protseduurid kiitis heaks Melbourne'i ülikooli loomaeetikakomitee (loomaeetika heakskiidu ID number: 2015209.1). Need loomatööga seotud katseprotseduurid ja ajakavad loodi selleks, et leevendada ja minimeerida uuringus kasutatud lammaste kannatusi. Eelkõige vähendati bronhoskoopiliste protseduuride arvu miinimumini, mis võimaldaks andmeid edukalt tõlgendada.

Pinotsembrini isoleerimine ja struktuurne kinnitus

Pinotsembriin puhastati kolmeaastaste Eucalyptus pressiana subsp. lehtede metanooliekstraktidest. pressiana seemikud kasvatati Melbourne'i ülikooli Dookie ülikoolilinnakus (36 kraadi 23'3"S, 145 kraadi 42'52"E) katseplatsil. Ettevõttest Nindethana Seed Company (King River, Austraalia) ostetud seemned koguti Lääne-Austraaliast Woodenellupist ning seemikud kasvatati üles ja siirdati proovitükile, nagu on kirjeldatud punktis [19]. Proovilehti kuivatati ahjus 5{{40}} kraadi juures 48 tundi, seejärel jahvatati 1 mm võrgusilmaga veskis IKA MF10 peeneks pulbriks. Jahvatatud kude (100 g) pandi Kinesis XK tselluloosi sõrmkübaratesse (Antylia Scientific, Chicago, USA) ja ekstraheeriti Soxhletiga 100% MeOH-ga (200 ml) 8 tundi. Seejärel kontsentreeriti MeOH ekstraktid rotaatoraurustiga ligikaudu 50 ml-ni. Kontsentreeritud ekstraktide alikvoodid (2 ml) allutati kiirkromatograafiale Revelers X2 süsteemis (Buchi AG, Flawil, Šveits), mis oli varustatud FlashPure C18 RP-WP 12g kassetiga (Buchi). Kasutatud lahustisüsteem oli atsetonitriili (MeCN) ja vee gradient 30-100 protsendist MeCN-ist 5 minuti jooksul 1-minutise tasakaalustamisajaga (S1 joonis fig). Pinotsembrini sisaldav fraktsioon tuvastati 283 nm juures ja koguti. Mitmete Flash-katsete fraktsioonid ühendati, MeCN eemaldati pöördaurustamisega ja pinotsembriin kuivatati lüofiliseerimisega. Pinotsembrini struktuur kinnitati ESI-LCMS ja NMR-spektroskoopia abil, nagu on kirjeldatud punktis [19], võrreldes kaubandusliku standardiga (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Pinotsembriin: MeCN/H kahvatukollased kristallid, O.UVλmax MeCN（nm）∶ riba-1325 nm, riba-II289 nm. 'H NMR (600 MHz, CDCl) ∶ 5,36 (1H, dd, J13,0, 3,0 Hz, H{43}}), δ2,76 (1H, dd, J17,1, 3,1 Hz, H{ {51}}a）, δ3,02 (1H, dd, J17,1, 13,1 Hz, H-3b), δ5,92 (1H, d, 2,2 Hz, H-6), δ5,94 (1H, d, 2,2 Hz, H{71}}). ESI-MS (fragmentaator 150 V, koorija 65 V) m/z (suhteline protsent): 255,0673 ([MH], 100), 213,0565 ([M-42-H], 19), 151,0037 ([M-104-H], 16), 257,0811 ([M pluss H], 100), 153,0167 ([M-104 pluss H],2). Eraldatud pinotsembriin massipõhine puhtus määrati vähemalt 96 protsenti, kasutades HPLC-PDA-d, võrreldes kaubandusliku standardiga (S2A ja S2B, joonis fig.).

Pinotsembrini manustamine lamba kopsusegmentidele

Iga annustamisrežiimi nädala jaoks infundeeriti iga uuringus osalenud lamba ühte saba-kopsu segmenti 7 mg pinotsembriini (joonis 1). Pinotsembrini annuse kaal põhines varem avaldatud uuringul, mis näitas, et 50 mg pinotsembriini kehakaalu kg kohta oli kõige tõhusam annus haiguse sümptomite leevendamiseks selles loommudelis [20]. Pinotsembrini annus 7 mg võimaldas tõsiasja, et ainult ligikaudu 150 g kopsusegmenti lamba kohta raviti annusega ~ 50 mg/kg. Bioaktiivne aine lahustati 10% DMSO-s ja manustati kord nädalas nelja nädala jooksul, nagu on näidatud joonisel 2. Kontrolli eesmärgil kasutati vastaskopsu kopsusegmenti bleomütsiin-positiivse, ilma ravimita kontrollainena. 1, nagu näidatud joonisel 1. Vehiikulis olevad bioaktiivsed molekulid manustati 5 ml infusioonina läbi bronhoskoobi biopsiapordi. Pange tähele, et vasaku ja parema kopsu vaheliste väikeste (nt füsioloogiliste või anatoomiliste jne) erinevuste tühistamiseks randomiseeriti pinotsembrini infusioonid vasaku ja parema kaudaalse kopsusegmendi vahel. Pooled loomad (n=5 lammast) said pinotsembriini paremasse kaudaalsesse kopsusegmenti, teised (n=5 lammast) aga vasakusse kaudaalsesse kopsusegmenti. Parempoolne mediaalne kopsusegment jäeti töötlemata ja seda kasutati terve kopsu kontrollkoe jaoks, millest võeti lahkamisel proovid (joonis 1).

Bronhoalveolaarse loputuse proovide võtmise protseduurid

Iga bronhoalveolaarse (BAL) proovivõtu korral joonisel 2 loetletud ajahetkedel manipuleeriti endoskoobiga proovide võtmiseks spetsiifiline kopsusegment, mis tavaliselt läbis umbes 3 kuni 4 hingamisteede haru. BAL-i proovide võtmiseks infundeeriti 10 ml steriilset soolalahust läbi endoskoobi biopsiapordi konkreetsesse kopsusegmenti ja seejärel koguti sama pordi kaudu süstlasse. Selle protseduuri käigus saadi 3–5 ml BAL-vedelikku. Proovivõtumeetodiga koguti analüüsimiseks rakke konkreetse kopsusegmendi väikestest hingamisteedest ja alveolaarsetest luumenist, kuhu bronhoskoop navigeeriti. Iga segmendi BAL-rakud tsentrifuugiti slaididele ja värviti põletikuliste rakkude diferentsiaalseks loendamiseks Hem-Quikiga, nagu eelnevalt kirjeldatud [13].

Kopsufunktsiooni testid ja analüüsid

Kopsufunktsiooni mõõdeti kirjeldatud kopsusegmentides joonisel 2 näidatud ajahetkedel. Kopsufunktsiooni hinnati kõigis testitavates kopsusegmentides (iga lamba vasak ja parem sabaosa ning mediaalne sagar). Kopsusegmentide funktsionaalset võimekust mõõdeti läbi endoskoobi, kasutades avaldatud protseduuri [12,13]. Selles uuringus hinnatud kopsufunktsiooni parameetrit nimetati vastavuseks kopsusegmendis (lühendatult Cseg). Üldiselt on vastavus mõõt, kui lihtne on kopsu täis puhuda. Halvasti ühilduvat kopsu nimetatakse jäigaks kopsuks, mida on tavaliselt raskem täis puhuda.

Vereproovide võtmine

Täisveri koguti algtasemel enne fibroosi esilekutsumist ja katse lõpus enne katseloomade eutanaasiat, nagu on näidatud joonisel 2, tõmmates verd kägiveenist hepariini sisaldavasse torusse. Verd töödeldi vererakkude arvu analüüsimiseks.

Kopsukoe isoleerimine ja analüüsid

Lambad surmati veidi üle 5 nädala pärast viimast bleomütsiini annust (12. nädala alguses), nagu on näidatud joonisel 2. Eutanaasia kutsuti esile barbituraadi üledoosiga, mis manustati IV annuses ml 2 kg kehamassi kohta, nagu tootja soovitas (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd. Pärast eutanaasiat eemaldati kopsud ning sihitud kopsusegmendid tuvastati ja lõigati ettevaatlikult lahti ümbritsevast). Seejärel pumbati üksikud segmendid rõhul ligikaudu 20 cm/H, O[13] OCT (Optimal Cutting Temperature, Tissue-Tek) ja steriilse PBS lahuse 1:1 seguga täis. täispuhutud segment fikseeriti 10% neutraalse puhverdatud formaliiniga ja töödeldi histopatoloogiliseks hindamiseks parafiinis.Ülejäänud kopsulõigud sisestati OCT-sse ja külmutati vedelal lämmastikus hõljuvatel alumiiniumpaatidel krüovormides.

Parafiiniga manustatud koelõigud (5 μm) värviti üldise histoloogia jaoks hematoksüliini ja eosiin Y-ga (H&E) ning Massoni trikroomvärvimisega, et tuvastada kollageenisisalduse muutusi kopsu parenhüümis.

Immunohistokeemia

Külmutatud lõikudel viidi läbi CD4 * ja CD8 T lümfotsüütide immunohistokeemiline lokaliseerimine. Kopsukoe lõigud (5 μm) fikseeriti jääkülma etanooliga; endogeensed peroksiidid blokeeriti H, O lahuse abil ja seejärel inkubeeriti sektsioone primaarsete antikehadega (monoklonaalne hiire anti-CD4 (puhas) ja monoklonaalne hiire anti-CD8 (puhas)) niiskes kambris 2 tundi toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist primaarsete antikehadega,

sektsioone pesti seejärel kolm korda PBS-ga ja inkubeeriti sekundaarse antikehaga (küüliku antihiire IgG(HRP)(ab6728)) (1:100; Abcam, Melbourne, Austraalia) 1 tund toatemperatuuril. Spetsiifilisuse kontrollimiseks lisati IHCruni ajal isotüübi kontrollid, kasutades sama isotüübiga bioloogiliselt ebaolulist SBU-3 antikeha. Sektsioone värviti 20 sekundi jooksul Mayeri hematoksüliini lahusega. Antigeen-antikeha kompleks visualiseeriti 3,3'-diaminobensidiiniga. Lõpuks dehüdreeriti sektsioonid etanooliga, puhastati ksüleenis ja paigaldati DPX-i.

Histopatoloogilised punktid

Kopsu parenhüümi histopatoloogiat hinnati poolkvantitatiivse punktisüsteemi abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [12,13]. Lühidalt öeldes pimestati kõik histoloogilised slaidid, nii et hindaja ei teadnud ravirühmi. Iga H&E-värvitud lõigu jaoks hinnati 10 järjestikust mittekattuvat välja 200-kordse suurendusega fibroosi, põletiku ja üldiste patoloogiaskooride hindamiskriteeriumide alusel, nagu varem teatatud [12, 13]. Piirkonnad valiti suurtest hingamisteedest ja suurtest veresoontest eemal. Seejärel keskmistati kõigi kümne välja skoorid, et saada representatiivsed skoorid jagatud kopsusegmendis hinnatud parameetrite kohta.

Kollageeni valgu kontsentratsiooni analüüsi, kasutades hüdroksüproliini testi, kasutati iga segmendi kollageenisisalduse ja kontsentratsiooni ekstrapoleerimiseks, nagu eelnevalt kirjeldatud (4, 5). Lühidalt öeldes lüofiliseeriti iga segmendi külmutatud kopsukoed kuivmassini, hüdrolüüsiti 6 M HCl-s ja hinnati hüdroksüproliini sisaldust, mõõtes taastatud proovide neeldumist (0,1 M HCl-s) lainepikkusel 558 nm, kasutades Beckmani seadet. DU-64 spektrofotomeeter (Beckman Coulter Inc, Brea, CA). Hüdroksüproliini sisaldus määrati trans-L-hüdroksü-L-proliini (Sigma-Aldrich) standardkõvera alusel. Kollageenisisaldus ekstrapoleeriti, korrutades hüdroksüproliini mõõtmised 6,94-ga (põhineb hüdroksüproliinil, mis moodustab ~14,4 protsenti kollageeni aminohappelisest koostisest enamikus kudedes [21]) ja seejärel väljendati kuivkoe osakaaluna, et saada kollageeni kontsentratsioon (mis väljendati protsentides).

Sidekoesisalduse analüüs fibroosi astme hindamiseks kvantifitseeriti, hinnates parenhüümi koe üldise sidekoe sisalduse muutusi, kasutades eelnevalt kirjeldatud meetodit [13]. Selle analüüsi tegemiseks värviti lamba kopsukudede parafiinilõigud Massoni trikroomvärviga, mis värvib sidekoe siniseks. Seejärel jäädvustati mikroskoobi ja arvutiga ühendatud digitaalkaamera abil kujutised Massoni trikroomiga värvitud kopsuosast. Kümme välja jäädvustati juhuslikult x400 suurendusega, välja arvatud suured veresooned ja bronhid. Seejärel analüüsiti pilte kasutades Image-Pro Plusi (Windowsi versioon 6.3, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA), kasutades värvivaliku tööriista, et mõõta igal väljal siniseks värvunud kudede (kollageen ja muud sidekoed) pindala. vaatest. Seejärel keskmistati iga kümne pildi väärtused iga slaidi jaoks. Sinisega värvunud koepindala osa väljendati protsendina kogu põllupinna kohta (sinisega värvunud koe pindala protsent põllu kogupindala kohta). Pildi jäädvustamine ja analüüs viidi läbi kodeeritud slaididel pimesi.

Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades GraphPad Prism for Windowsi versiooni 5.01 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA, Ameerika Ühendriigid). Parameetreid hinnati Gaussi järgi

jaotus D'Agostino normaalsuse ja Pearsoni omnibustesti abil. Parameetriliste andmete jaoks viidi läbi paaris kahepoolsed t-testid, et võrrelda kopsusegmente, mis said bleomütsiini ainult soolalahusega infundeeritud kontrollsegmentidega ja kopsusegmente, mis said bleomütsiini ja pinotsembriini infusiooni. Andmete jaoks, mis ei vastanud Gaussi jaotuse eeldustele, kasutati Wilcoxoni sobitatud paaride märgistatud auaste testi. Kõigil juhtudel määratleti olulise erinevusena p-väärtus, mis oli väiksem kui 0,05. Kõik väärtused on esitatud keskmistena (± SEM).

Tulemused

Loomade tervis ja pinotsembrini manustamise ohutus

Tervisekontrolle viidi regulaarselt läbi kogu raviperioodi ja uuringu jooksul kuni eutanaasiani. Selle eesmärk oli teha kindlaks, et ravi pinotsembriiniga ei põhjustanud uuringus osalenud lammastele ebasoodsaid terviseprobleeme ega kahjulikke kõrvalmõjusid. Kõik loomad püsisid tervena kogu pinotsembriinravi perioodi (nädal 8 kuni nädal 12, joonis 2). Selle perioodi jooksul jätkas loomade kaalus juurdevõtt nende lammaste eeldatavas normaalses vahemikus, nende valgevereliblede arv oli normaalne ja muid tervisega seotud kõrvalnähte ei esinenud.

Pinotsembrini manustamine parandab kopsufunktsiooni langust, mis on seotud bleomütsiini poolt indutseeritud kopsufibroosi tekkega

Joonisel fig 3 on näidatud erinevate kopsusegmentide kopsufunktsioon pärast kord nädalas neljanädalast ravi pinotsembriiniga. Mõõdetud kopsufunktsiooni parameeter oli vastavus kohalikele kopsusegmentidele ja seda nimetatakse segmentaalseks vastavuseks (Cseg). Üldjuhul tähendab madalam vastavuse tase kopsusegmendi halvemat funktsiooni (st raskem pumbata ja kops on jäigem). Ootuspäraselt oli kopsusegmentidel, mis said ainult kahjustavat ainet bleomütsiini, ilma pinotsembriinita, oluliselt madalam keskmine segmentaalne vastavus kui ravimata tervetel kontrollkopsusegmentidel (joonis 3A). Kopsusegmentidel, mis said pinotsembrini manustamisega kahjustavat ainet bleomütsiini, oli suurem keskmine segmentaalne vastavus, mis ei erinenud oluliselt ravimata tervete kontrollkopsu segmentidest (joonis 3A). Teine kasutatud kopsufunktsiooni hindamine oli vastavuse protsentuaalne muutus võrreldes algtasemega (Eig 3C). Sellega mõõdeti vastavuse muutust uuringu algusest (enne bleomütsiini ja pinotsembriinravi) kuni viimase pinotsembriinravi lõpetamiseni. Hindamine näitas, et ravisoostumus pinotsembriiniga töödeldud kopsusegmentides oli pärast pinotsembrini kord nädalas manustamist 4-nädalase raviperioodi jooksul oluliselt paranenud (joonis 3C).

Pinotsembrini manustamine vähendab bleomütsiini poolt indutseeritud põletikuliste rakkude akumulatsiooni BAL vedelikus

Joonisel 4 on näidatud BAL-rakkude andmed pärast pinotsembriiniga kord nädalas infusioonravi 4-nädalase raviperioodi jooksul. BAL-rakkudest võeti proovid kopsusegmentidest katse 12. nädalal, kaks päeva enne lammaste tapmist. BAL vedelikus hinnati rakkude arvu ainult neutrofiile ja peamiste põletikuliste rakkude summat, mis hõlmasid neutrofiile, eosinofiile ja lümfotsüüte. Nagu oodatud, oli tervetel kontroll-kopsu segmentidel, mida ei ravitud, BAL-vedelikus suhteliselt vähe põletikulisi rakke (joonis 4).

Seevastu bleomütsiini poolt vigastatud kopsusegmentides ilma pinotsembriinita oli BAL vedelikus märkimisväärselt palju neutrofiile ja muid põletikulisi rakke võrreldes tervete kontrollsegmentidega (Eig 4). Kopsusegmentides, mis said kahjustavat ainet bleomütsiini ja mida oli ravitud pinotsembriiniga, oli neutrofiilide ja põletikuliste rakkude arv oluliselt väiksem, võrreldes rakkude arvuga, mis võeti kopsusegmentidest, mis said ainult bleomütsiini ilma pinotsembriinita (joonis 4).

Pinotsembrini mõju kopsu parenhüümi T-rakkudele

Joonisel 5 on näidatud T-rakkude andmed pärast nelja infusiooniravi pinotsembriiniga, mida manustati üks kord nädalas. T-rakke hinnati erinevalt töödeldud kopsusegmentide parenhüümis, millest võeti proove post mortem (12. nädalal). Nagu oodatud, oli tervetel kontroll-kopsu segmentidel, mida ei ravitud, kopsu parenhüümis suhteliselt vähe CD8t ja CD4* T-rakke (joonis 5).

Seevastu ilma pinotsembriinravita bleomütsiiniga vigastatud kopsusegmentides oli kopsu parenhüümis oluliselt suurem CD8 ja CD4* T-rakkude arv võrreldes tervete kontrollsegmentidega (Eig 5). Kopsusegmentides, mis said kahjustavat ainet bleomütsiini ja mida oli ravitud pinotsembriiniga, oli kopsu parenhüümis oluliselt väiksem CD8t ja CD4 pluss T-rakkude arv võrreldes rakkude arvuga, mis võeti kopsusegmentidest, mis said ainult bleomütsiini ilma pinotsembriinita (Eig 5 ).

iga testitud parameeter (Eig⑥). Oluline on see, et kopsusegmentidel, mis said vigastavat ainet bleomütsiini ja mida raviti pinotsembriiniga, olid iga hinnatud parameetri keskmised hinded madalamad (Eig ⑥). Pinotsembriinravi vähendas oluliselt põletikku ja üldist patoloogia skoori võrreldes segmentidega, mis said ainult bleomütsiini infusiooni (joonis 6). Kuigi kopsusegmentidel, mis said bleomütsiini ja pinotsembriini infusiooni, olid madalamad fibroosi skoorid võrreldes segmentidega, mis said ainult bleomütsiini infusiooni, ei olnud erinevus statistiliselt oluline (joonis 6).

Pinotsembrini mõju sidekoe sisaldusele

Massoni trikroomiga värvitud lõikude mikroskoopilised vaatlused näitasid, et pinotsembriinravi vähendas bleomütsiini infusiooniga indutseeritud sidekoe hulka (joonis 7A). EigZB näitab Massoni trikroomiga värvitud sidekoe piirkonna protsendimäärasid pärast nelja kord nädalas pinotsembriiniga töötlemist. Joonisel 7B olevad andmed näitasid, et ravi pinotsembriiniga vähendas oluliselt sinise värvumise protsenti bleomütsiiniga kokku puutunud kopsusegmentides, võrreldes bleomütsiiniga infundeeritud kopsudega, mis ei saanud pinotsembriinravi (joonis 7B). Joonisel ZC on näidatud kollageenisisalduse hüdroksüproliini testi andmed pärast nelja nädalast pinotsembriiniga töötlemist. Joonisel 7C olevad andmed koguti kõigilt 10 katses osalenud loomalt ja need näitasid, et bleomütsiini infusioon üksi (ilma pinotsembrinita) suurendas märkimisväärselt kollageeni valgu kontsentratsiooni võrreldes vastavate mõõtmistega tervetest kopsu kontrollsegmentidest, mis ei saanud ei bleomütsiini ega pinotsembriini. Pinotsembrini manustamine ei vähendanud aga bleomütsiini poolt indutseeritud kollageeni kontsentratsiooni suurenemist (joonis 7C).

Arutelu

Selles uuringus kasutati pinotsembrini efektiivsuse kindlakstegemiseks füsioloogiliselt ja farmakoloogiliselt olulist kopsufibroosi lambamudelit [12,13]. Üldiselt leidsime, et ravi pinotsembriiniga oli tõhus eksperimentaalselt esile kutsutud kopsupatoloogia leevendamisel ega põhjustanud kahjulikke tervisemõjusid kõigil kümnel uuringus osalenud lambal.

iga testitud parameeter (joonis ⑥). Oluline on see, et kopsusegmentidel, mis said vigastavat ainet bleomütsiini ja mida raviti pinotsembriiniga, olid iga hinnatud parameetri keskmised hinded madalamad (Eig ⑥). Pinotsembriinravi vähendas oluliselt põletikku ja üldist patoloogia skoori võrreldes segmentidega, mis said ainult bleomütsiini infusiooni (joonis 6). Kuigi kopsusegmentidel, mis said bleomütsiini ja pinotsembriini infusiooni, olid madalamad fibroosi skoorid võrreldes segmentidega, mis said ainult bleomütsiini infusiooni, ei olnud erinevus statistiliselt oluline (joonis 6).

Pinotsembrini mõju sidekoe sisaldusele

Massoni trikroomiga värvitud lõikude mikroskoopilised vaatlused näitasid, et pinotsembriinravi vähendas bleomütsiini infusiooniga indutseeritud sidekoe hulka (joonis 7A). EigZB näitab Massoni trikroomiga värvitud sidekoe piirkonna protsendimäärasid pärast nelja kord nädalas pinotsembriiniga töötlemist. Joonisel 7B olevad andmed näitasid, et ravi pinotsembriiniga vähendas oluliselt sinise värvumise protsenti bleomütsiiniga kokku puutunud kopsusegmentides, võrreldes bleomütsiiniga infundeeritud kopsudega, mis ei saanud pinotsembriinravi (joonis 7B). Joonisel ZC on näidatud kollageenisisalduse hüdroksüproliini testi andmed pärast nelja nädalast pinotsembriiniga töötlemist. Joonisel 7C olevad andmed koguti kõigilt 10 katses osalenud loomalt ja need näitasid, et bleomütsiini infusioon üksi (ilma pinotsembrinita) suurendas märkimisväärselt kollageeni valgu kontsentratsiooni võrreldes vastavate mõõtmistega tervetest kopsu kontrollsegmentidest, mis ei saanud ei bleomütsiini ega pinotsembriini. Pinotsembrini manustamine ei vähendanud aga bleomütsiini poolt indutseeritud kollageeni kontsentratsiooni suurenemist (joonis 7C).

Arutelu

Selles uuringus kasutati pinotsembrini efektiivsuse kindlakstegemiseks füsioloogiliselt ja farmakoloogiliselt olulist kopsufibroosi lambamudelit [12,13]. Üldiselt leidsime, et ravi pinotsembriiniga oli tõhus eksperimentaalselt esile kutsutud kopsupatoloogia leevendamisel ega põhjustanud kahjulikke tervisemõjusid kõigil kümnel uuringus osalenud lambal.

Pinotsembrini mõju histopatoloogiale

Eig6 näitab histopatoloogilise skoori andmeid pärast nelja kord nädalas toimuvat pinotsembriinravi. Hinnatud histopatoloogilised parameetrid olid põletik, fibroos ja üldine patoloogia. Nagu normaalse terve kopsu puhul eeldati, olid ravimata jäetud kontroll-kopsusegmentidel madalad skoorid iga hinnatud patoloogiaparameetri kohta (joonis 6). Seevastu ilma pinotsembriinravita bleomütsiiniga vigastatud kopsusegmentide keskmised tulemused olid oluliselt kõrged.

iga testitud parameeter (Eig⑥). Oluline on see, et kopsusegmentidel, mis said vigastavat ainet bleomütsiini ja mida raviti pinotsembriiniga, olid iga hinnatud parameetri keskmised hinded madalamad (Eig ⑥). Pinotsembriinravi vähendas oluliselt põletikku ja üldist patoloogia skoori võrreldes segmentidega, mis said ainult bleomütsiini infusiooni (joonis 6). Kuigi kopsusegmentidel, mis said bleomütsiini ja pinotsembriini infusiooni, olid madalamad fibroosi skoorid võrreldes segmentidega, mis said ainult bleomütsiini infusiooni, ei olnud erinevus statistiliselt oluline (joonis 6).

Pinotsembrini mõju sidekoe sisaldusele

Massoni trikroomiga värvitud lõikude mikroskoopilised vaatlused näitasid, et pinotsembriinravi vähendas bleomütsiini infusiooniga indutseeritud sidekoe hulka (joonis 7A). EigZB näitab Massoni trikroomiga värvitud sidekoe piirkonna protsendimäärasid pärast nelja kord nädalas pinotsembriiniga töötlemist. Joonisel 7B olevad andmed näitasid, et ravi pinotsembriiniga vähendas oluliselt sinise värvumise protsenti bleomütsiiniga kokku puutunud kopsusegmentides, võrreldes bleomütsiiniga infundeeritud kopsudega, mis ei saanud pinotsembriinravi (joonis 7B). Joonisel ZC on näidatud kollageenisisalduse hüdroksüproliini testi andmed pärast nelja nädalast pinotsembriiniga töötlemist. Joonisel 7C olevad andmed koguti kõigilt 10 katses osalenud loomalt ja need näitasid, et bleomütsiini infusioon üksi (ilma pinotsembrinita) suurendas märkimisväärselt kollageeni valgu kontsentratsiooni võrreldes vastavate mõõtmistega tervetest kopsu kontrollsegmentidest, mis ei saanud ei bleomütsiini ega pinotsembriini. Pinotsembrini manustamine ei vähendanud aga bleomütsiini poolt indutseeritud kollageeni kontsentratsiooni suurenemist (joonis 7C).

Pinotsembrini efektiivsus mitmete haiguse parameetrite parandamiseks eksperimentaalse kopsuhaiguse lambamudelis

Käesolevas uuringus leidsime, et pinotsembriin suutis leevendada mitmeid haiguse parameetreid kopsufibroosi lambamudelis. Meie peamised järeldused olid, et pinotsembrini manustamine suutis parandada kopsufunktsiooni, nõrgendada kopsupõletikku ja vähendada bleomütsiini kahjustuse põhjustatud üldist patoloogia skoori. Oluline on see, et andmete statistilised analüüsid näitasid, et need haigusnäidud olid pinotsembriiniga töödeldud kopsusegmentides märkimisväärselt paranenud, võrreldes bleomütsiiniga vigastatud ja ravimata kopsusegmentide vastavate andmetega.

Bleomütsiini poolt indutseeritud kopsufibroosi lambamudelis põhjustab bleomütsiini vigastus lokaliseeritud kopsude ühilduvuse (kopsu jäikuse mõõt) kaotust bleomütsiiniga infundeeritud kopsusegmentides [12-14,16,22,23]. Käesolevas uuringus , leidsime, et ravi pinotsembriiniga parandas oluliselt bleomütsiini poolt vigastatud kopsusegmentide funktsionaalset vastavust. See näitas, et pinotsembriinravi vigastatud kopsusegmentides põhjustas nende segmentide toimimise kõrgemal tasemel kui ravimata jätmise korral.

Käesolevas uuringus näitas kopsusegmentidest taastunud kopsuloputuse põletikuliste rakkude tuvastamine, et pinotsembriinravi vähendas oluliselt alveoolide ja väikeste hingamisteede liminaalseid ruume hõivavate põletikuliste rakkude arvu. Peamine põletikuline rakutüüp, mis kopsuloputusvedelikus vähenes, olid neutrofiilid, mis langesid 7,4 protsendilt BAL-rakkude koguarvust bleomütsiini ilma ravimravita kopsusegmentides 3,7 protsendini pinotsembriiniga töödeldud bleomütsiiniga vigastatud kopsusegmentides. Pinotsembriiniga seotud CD4 ja CD8 T-rakkude vähenemine kopsu parenhüümis oli täielikult kooskõlas pinotsembriiniga ja bleomütsiiniga eksponeeritud kopsusegmentide kopsuloputusvedelikust taastunud põletikuliste rakkude vähenemisega. CD4 ja CD8 pluss T-rakud on paljude immuunvastuste rakuharu olulised komponendid. Üldiselt toetavad need andmed arvamust, et pinotsembriinil oli uuritud haigusmudelis tugevad põletikuvastased omadused.

Histopatoloogiliste skooride osas paranesid pärast pinotsembriinravi vigastatud kopsusegmentides keskmised põletiku ja üldised patoloogia skoorid. Oluline on see, et need näidud olid pinotsembriiniga töödeldud kahjustatud kopsudes statistiliselt madalamad, võrreldes pinotsembriinravita eksperimentaalselt vigastatud kopsudega. Kuigi keskmised fibroosipatoloogia skoorid olid pinotsembriiniga töödeldud kahjustatud kopsudes madalamad, võrreldes pinotsembriinravita eksperimentaalselt vigastatud kopsudega, ei saavutanud need statistilist olulisust.

Kuna fibroosipatoloogia skoori andmed ei olnud pinotsembrini kohta lõplikud, viidi hüdroksüproliini test läbi erinevalt töödeldud kopsusegmentide koeproovidega. Hüdroksüproliini test mõõdab kollageeni taset valguproovis ja on kuldstandardi näidu mõõt fibroosi taseme määramiseks kudedes. See test näitas, et pinotsembriin ei vähendanud bleomütsiini kahjustusega seotud ekstratsellulaarse kollageeni ladestumist. Massoni trikroomanalüüs (teine ​​näit, mida sageli kasutatakse fibroosi ulatuse hindamiseks) näitas, et sinise värvumise protsent (st sidekoe sisalduse mõõt) oli oluliselt madalam bleomütsiiniga eksponeeritud ja pinotsembriiniga töödeldud kopsulõikudes võrreldes bleomütsiiniga eksponeeritud kopsuosadega. kopsulõigud, mis ei saanud ravimiravi. Kokkuvõttes näitasid nii hüdroksüproliini kui ka Massoni trikroomanalüüsi andmed, et pinotsembriinil oli võime redutseerida mõningaid ekstratsellulaarse maatriksi valke (näidatud Massoni trikroomi andmetest), kuid mitte tingimata kollageeni (nagu kinnitavad hüdroksüproliini andmed). Üldiselt näitasid fibroosi skooride, Massoni trikroomi ja hüdroksüproliini analüüside andmed, et pinotsembriinil on ainult tagasihoidlikud fibroosi- ja ümberkujunemisvastased omadused.

Varem on näidatud, et paljudel bioaktiivsetel ühenditel on põletikuvastased ja fibroosivastased omadused tänu mitmete profibrootiliste ja põletikueelsete biomarkerite moduleerimisele, nagu TNF, TGF-endoteliin-1, IFN-y, interleukiinid, VEGF, FGF. -2, PDGF MMP-9, TIMP-id, NF-kB ja kollageen-I [24]. Lisaks on leitud, et põletikuvastaste ühendite manustamine bleomütsiiniga infundeeritud kopsufibroosi hiiremudelitele põhjustas sageli fibrootilise patoloogia vähenemise. See oli eriti nii, kui põletikuvastaseid molekule kasutati nende mudelite puhul varakult pärast bleomütsiiniga kokkupuudet patoloogia põletikulise (profibrootilise) staadiumiga [25]. Oluline on aga see, et kui paljusid põletikuvastaseid molekule testiti kliinikus fibrootiliste seisundite raviks, leiti, et need olid ebaefektiivsed [25]. Loommudelites, kus pinotsembriin pidurdas tõhusalt teistes elundites esile kutsutud fibroosi, Pinotsembriin inhibeeris ka põletikueelseid tsütokiine TNF-c, IL-1 ja IL-6 ning summutas põletikulisi reaktsioone NF-K signaaliraja 9, 10 pärssimise kaudu. Täiendavad mehhaanilised uuringud hiire LPS-i ja bleomütsiiniga mudelid näitasid, et TLR4 (maksutaoline retseptor 4) ja põletikud on põhjuslikult seotud NF-K põletikuliste signaalide pinotsembriinide pärssimisega [2]. Nagu kõigi bleomütsiini poolt indutseeritud kopsufibroosi mudelite puhul, on ravimite sekkumise ajastus ülioluline, et määrata kindlaks ravi suhteline fibroosi- ja põletikuvastane toime [25. Pinotsembriinravi ajastus käesolevas uuringus oli 7 päeva pärast viimast bleomütsiini infusiooni, mis on selle mudeli fibrootilise faasi alguses [12, 13]. Kuigi põletik oli sel päeval{37}} palju madalam, oli see siiski olemas, seega ei saa välistada, et pinotsembrini mõned nõrgad fibroosivastased toimed olid tingitud selle põletikuvastasest toimest.

Varem oleme seda kopsufibroosi lambamudelit kasutanud kahe teise ravimi terapeutilise potentsiaali hindamiseks, mille tulemused võivad olla kasulikud praeguses uuringus leitud pinotsembrini toime võrdlemisel. Oleme testinud KCa3.1 ioonikanali inhibiitorit nimega senicapoc [15,16] ja uurisime ka FDA poolt heaks kiidetud ravimi pirfenidooni efektiivsust mudelis[14]. Avaldatud uuringuplaanid olid sisuliselt sarnased praeguse pinotsembriinuuringuga, kusjuures igas uuringus kasutati 10 lammast rühma kohta. Raviperioodid olid sarnase kestusega, iga ravimi puhul neli kuni viis nädalat. Peamine erinevus seisnes selles, et senicapoci ja pirfenidooni uuringutes manustati ravimeid suukaudselt, samal ajal kui pinotsembrini manustati kopsusiseselt kohalikesse kopsusegmentidesse. Veelgi enam, kogu kops ei saanud praeguses uuringus pinotsembriini, samas kui pirfenidooni ja senicapoci uuringutes puututi ravimitega kokku kogu kops. Nende uuringute vahelised andmete analüüsid näitavad, et kopsude ravisoostumuse, üldiste patoloogiate skooride ja põletiku paranemise tase oli pinotsembriinuuringus sarnasel tasemel võrreldes teiste lammaste mudeliga läbi viidud ravimiuuringutega. Üks peamisi erinevusi nende uuringute vahel oli see, et varem avaldatud uuringutes põhjustas pirfenidooni või senikapoki manustamine hüdroksüproliini testiga hinnatuna märkimisväärselt kollageenivalgu kontsentratsiooni vähenemist [14, 16]. ravimid viitab sellele, et kopsu funktsiooni ja patoloogia oluline paranemine tuleneb peamiselt pinotsembrini põletikuvastasest toimest ja vähemal määral selle fibroosivastasest toimest.

Käesolevas uuringus leiti, et neli 7 mg pinotsembrini annust, mida manustati kopsudesse nädalaste intervallidega, olid hästi talutavad ja neil ei olnud kõrvaltoimeid. See on kooskõlas 58 terve patsiendiga tehtud randomiseeritud topeltpimeda platseebokontrollitud uuringu andmetega, mis näitasid, et pinotsembriini intravenoosne süstimine oli hästi talutav kuni annuseni 120 mg päevas [26]. Uuringus hinnati nii ühe- kui ka mitmeannuselisi režiime ja leiti, et puuduvad suured ohutusprobleemid, mis välistaks pinotsembrini süstimise teel manustamise edasise kliinilise arengu [26]. Käesoleva uuringu andmed näitasid, et pinotsembrini otsene kopsusisene manustamine ei olnud mitte ainult ohutu ja elujõuline, vaid toetas ka arvamust, et see flavonoid võib olla kasulik mitmete kopsupõletikuliste haiguste raviks. Astma on oluline allergiline hingamisteede haigus, mille puhul pinotsembriin jõuab kopsudesse. Pinotsembrini astmavastast toimet toetavaid esialgseid tõendeid on näidatud uuringus, kus pinotsembriini intraperitoneaalsed süstid inhibeerisid hiirtel allergilisi hingamisteede haigusi [20]. Seega võib mõistlikult eeldada, et pinotsembrini lokaalne kohaletoimetamine ainult kopsudesse on astmataoliste seisundite ravimisel kliinikus tõhusam.

Järeldus

Kokkuvõtteks võib öelda, et sellest uuringust saadud tugevad ja olulised andmed olid kooskõlas sellega, et pinotsembriin on bioaktiivne ja parandab loommudeli seadistuses peamisi haiguse parameetreid. Pinotsembrini manustamise silmatorkav põletikuvastane ja tagasihoidlik antifibrootiline ümberkujundamisefekt oli tõenäoliselt seotud selle võimega parandada kopsupatoloogiat ja funktsionaalset vastavust.