Cistanche ürdi verbaskosiidi kasulikud mõjud

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Verbaskosiid kaitseb hiiri klostriidigaasi gangreeni eest, inhibeerides alfatoksiini ja perfringolüsiin O aktiivsust

Gaasgangreen, mida põhjustab peamiselt anaeroobne bakter Clostridium perfringens (C. perfringens), põhjustab surma 48 tunni jooksul pärast tekkimist. Saadaval on piiratud arv ravistrateegiaid ja see on seotud ülikõrge suremusega. Nii C. perfringens alfa-toksiin (CPA) kui ka perfringolüsiin O (PFO) on gaasigangreeni tekkes olulised virulentsustegurid, mis viitab sellele, et need on terapeutilised sihtmärgid. Siin me leidsime selleverbascoside, a fenüülpropanoidglükosiidaastal laialt levinud Hiina taimsed ravimid Cistanche, võib hemolüütilistes testides tõhusalt pärssida nii CPA kui ka PFO bioloogilist aktiivsust.

Verbaskosiid inhibeeris märkimisväärselt PFO oligomerisatsiooni. Kuigi antibakteriaalset toimet ei täheldatud,verbascosideravi kaitses Caco{0}} rakke CPA ja PFO põhjustatud kahjustuste eest. Lisaks raviti nakatunud hiirtelverbascosidenäitas oluliseltleevendatud kahju, vähenenud bakterite koormusjavähenenud suremus. Kokkuvõttes,verbaskosiidil on tõhus terapeutiline toime C. perfringensi virulentsuse vastu nii in vitro kui ka in vivosihtides samaaegselt CPA-d ja PFO-d. Meie tulemused pakuvad paljutõotavat strateegiat ja potentsiaalset pliiühendit C. perfringensi infektsioonide, eriti gaasigangreeni jaoks.

Märksõnad: alfa-toksiin, infektsioonivastane, Clostridium perfringens, gaasigangreen, perfringolüsiin O, verbaskosiid

Clostridium perfringens (C. perfringens) on grampositiivne anaeroobne bakter, mis on looduses ja inimese soolestikus laialt levinud (Fraser ja Collee, 1975). C. perfringens võib eritada nelja peamist toksiini ( , , ε ja Ì) ning jaguneb vastavalt viide serotüübiks A–E (Titball, 2005). Inimestel võib C. perfringens põhjustada mitmesuguseid haigusi, nagu toidumürgitus ja gaasigangreen, millest viimane võib esineda ka loomadel, nagu kassid, veised, koerad, lambad, hobused ja kitsed (Verherstraeten et al. , 2015). Gaasgangreeni peiteaeg on lühike ja nakkus võib kinnistuda 6–8 tunni jooksul (Uzal et al., 2015). Veelgi tõsisem on see, et enam kui 50 protsendil nakatunutest areneb jätkuvalt välja süsteemne tokseemia, mis viib lõpuks surmani; seega võib gaasigangreen ilma õigeaegse ja tõhusa ravita põhjustada tõsist majanduslikku kahju (Low et al., 2018). Kuid tavalistel ravimeetoditel, nagu antibiootikumravi ja gaasigangreeni kirurgiline ravi, on kõigil teatud puudused, sealhulgas, kuid mitte ainult, antibiootikumiresistentsus ja patsientide amputatsioonivigastused (Park et al., 2010; Osman ja Elhariri, 2013). Seega on vaja leida uusi meetodeid või ideid gaasigangreeni raviks.

Klostriidide gaasigangreen on fulminantne nakkushaigus, mis on põhjustatud peamiselt C. perfringensi toksiini (CPA) ja perfringolüsiin O (PFO) koostoimest (Hifumi et al., 2018). Bakteriaalsete tsink-Metallo fosfolipaasi ensüümide perekonda kuuluvat CPA-d toodavad kõik C. perfringens, seda kodeerivad kromosoomid, see on C. perfringensi peamine toksiin ja sellel on nii fosfolipaas C kui ka sfingomüelinaasi aktiivsus (van Bunderen et al. , 2010; Masataka jt, 2015). 1990. aastatel avaldasid Awad jt. (1995) kasutasid CPA mutante gaasigangreeni hiiremudeli testimiseks ja leidsid, et tüvedel, millel puudus CPA geen, ilmnes pärast nakatumist vähenenud patogeensus ja vähem koekahjustusi. See töö kinnitas, et CPA on gaasigangreeni peamine toksiin. 2000. aastal viis Alberto läbi põhjalikud uuringud, konstrueerides C-terminaalses domeenis a-toksiini ja kolmeahelaliste mutantide molekulaarse mudeli ning mutantide hemolüütiline aktiivsus ja tsütotoksilisus vähenesid võrreldes metsiktüüpi omadega. Näidati, et sfingomüelinaasi aktiivsus ja C-terminaalne domeen on in vivo müotoksilisuse jaoks vajalikud (Alape-Giron et al., 2000). PFO, kolesteroolist sõltuv tsütolüsiin (CDC), interakteerub rakumembraaniga monomeerina ja valmistatud kompleks sisestatakse seejärel oligomerisatsiooni teel membraani kaksikkihti, lõpuks peremeesrakud lüüsides (Johnson ja Heuck, 2014). Kuigi PFO ei ole letaalsuseks vajalik, võib see põhjustada makrofaagide tsütotoksilisust münekroosi varases staadiumis ja on oluline trombide moodustumisel infektsiooni hilises staadiumis, aidates kaasa gaasigangreeni patogeneesile (Verherstraeten et al., 2015). CPA võib kombineerida PFO-ga, et kahjustada nakatunud kohas kogunenud neutrofiile ning esile kutsuda endoteelirakkude düsfunktsiooni, turset ja isheemiat, mis viib lõpuks kudede hüpoksiani ja loob soodsa anaeroobse keskkonna C. perfringensi kasvuks ja paljunemiseks (Bryant ja Stevens, 1996). ). Seega on selle uuringu eesmärk CPA ja PFO ning selle eesmärk on paljastada uus meetod gaasigangreeni raviks.

Selles uuringus skriiniti 17 looduslikust ühendist hemolüüsi teel kahte toksiini inhibiitorit, et leida potentsiaalne gaasigangreeni inhibiitor. Erinevate ühendite hemolüütilised andmed on toodud tabelis 1. 17 loodusliku ühendi tüübi hulgas on verbaskosiidil mõlemat toksiini parim inhibeeriv toime ja seetõttu valisime selle uuringu sihtühendiks verbaskosiidi. Verbaskosiid on laialdaselt levinud erinevates Hiina taimsetes ravimtaimedes, nagu tsitanche, ning see eraldati ja ekstraheeritiVerbascosideItaalia teadlase poolt 1963. aastal (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Uuringud on näidanud, etverbaskosiidil on palju bioloogilisi ja farmakoloogilisi toimeid, nagu näitekspõletikuvastased, antioksüdantsed, antibakteriaalsed, kasvajavastased, seenevastased ja kelaativad omadusedjasaab kasutada nahakosmeetikasjapaiksed preparaadid.Teised aruanded on näidanud, et verbaskosiid võib täielikult imenduda 1 tunni jooksul ja saavutada kõrge kontsentratsioon veres ning et selle biosaadavus erinevate süstimismeetodite kaudu kohaletoimetamisel ei ületa 25 protsenti (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Eespool nimetatud farmakoloogiliste aktiivsuste põhjal leiti ja uuriti selles uuringus inhibeerivat toimetverbaskosiidi mõjugaasigangreeni kohta läbi in vitro ja in vivo katsete.

Verbaskosiid inhibeeris PFO ja CPA hemolüütilist aktiivsust

On teatatud, et mõned flavonoidid on tõhusad inhibiitorid poore moodustavate toksiinide vastu (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Siin leiti, et verbaskosiid, fenüülpropanoid, pärsib C. perfringensi poolt sekreteeritavate PFO ja CPA toksiinide hemolüütilist aktiivsust. Kui verbaskosiidi kontsentratsioonid jäid vahemikku 2 kuni 32 |ig/ml, inhibeeris verbaskosiidiga ravi oluliselt nende toksiinide hemolüütilist aktiivsust annusest sõltuval viisil, mis näitab, et verbaskosiid on nii PFO kui ka CPA tõhus inhibiitor.

Verbaskosiid ei mõjuta C. perfringensi kasvu

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/ml. Samamoodi näitavad bakterite kasvukõvera tulemused (joonis 2B), et verbaskosiid ei mõjuta bakterite normaalset kasvu. Üheskoos näitavad meie tulemused, et verbaskosiidiga töötlemine ei mõjuta C. perfringensi elujõulisust kontsentratsioonidel, mis on vajalikud PFO ja CPA aktiivsuse inhibeerimiseks.

Verbaskosiid kaitseb rakke PFO või CPA poolt põhjustatud kahjustuste eest

Clostridium perfringens alfa-toksiin ja PFO C. perfringensis on peamised toksiinid, mis põhjustavad gaasigangreeni; seega uuriti ka seda, kas verbaskosiid suudab kaitsta rakke nende kahe toksiini eest. Esiteks viisime läbi tsütotoksilisuse testi ravimi verbaskosiidiga, mis ei kahjustanud rakke (joonis 3A). Seejärel lisati see ühend rakkude ja PFO või CPA kooskultuuri süsteemi. Verbaskosiid pärssis nende kahe toksiini tsütotoksilisustlahtrites Caco{{0}}. Võrreldes proovidega, mida verbaskosiidiga ei töödeldud, vähenes toksiinide poolt verbaskosiidiga 0,5 Jig/ml töödeldud Caco-2 rakkudele tekitatud kahjustus annusest sõltuval viisil oluliselt. Eriti PFO valgu puhul olid rakud tõhusalt kaitstud ravimi kontsentratsioonil 0,25 ig/ml (P < 0,05).="" selle="" kaitsva="" toime="" tõestamiseks="" kasutati="" täiendavalt="" järgnevat="" rakkude="" elujõulisuse="" surma="" testi="" (joonised="" 3d-k).="" nagu="" oodatud,="" kaitses="" verbaskosiidiga="" ravi="" nähtavalt="" pfo="" või="" cpa="" poolt="" põhjustatud="" rakukahjustuste="" eest.="" kokkuvõttes="" näitasid="" meie="" tulemused,="" et="" verbaskosiid="" inhibeerib="" oluliselt="" pfo="" või="" cpa="" poolt="" põhjustatud="" rakukahjustusi="" annusest="" sõltuval="">

Verbaskosiid pärsib PFO hemolüütilist aktiivsust, vähendades selle oligomerisatsiooni

PFO hemolüütilise aktiivsusega peab kaasnema oligomerisatsioon ja pooride moodustumine (Johnson ja Heuck, 2014). Siin indutseeriti PFO oligomerisatsioon KCl ja küüliku verega ning tuvastati PFO oligomerisatsioon (joonis 4), mis näitab oligomerisatsiooniriba intensiivsuse vähenemist, kui verbaskosiidi kontsentratsiooni suurendati. Meie tulemused näitavad koos, et ravi verbaskosiidiga pärsib PFO oligomerisatsiooni ja vähendab seeläbi selle toksiini hemolüütilist aktiivsust.

Verbaskosiid kaitseb hiiri C. perfringensi nakkuse eest

Loodi gangreeni hiire jalalihaste mudel, et teha kindlaks, kas in vitro täheldatud kaitset saab jälgida ka in vivo. ATCC{0}}nakatunud hiirte jalad olid seevastu ravimirühmas põletikuliste rakkude arv oluliselt vähenenud ja kude oli pärast verbaskosiidiga töötlemist terve. Lisaks vähenes pärast verbaskosiidiga ravi oluliselt jalalihastes koloniseeritud bakterite arvu. Nagu on näidatud katsetulemustes, suri 93,33 protsenti nakatunud hiirtest 32 tundi pärast nakatumist. Ootuspäraselt suurenes verbaskosiidi saanud hiirte elulemus 33,33 protsenti, kuna ainult 60 protsenti nakatunud hiirtest suri (P=0,015 log-rank testiga). Lisaks lükkas ravi verbaskosiidiga surmaperioodi maksimumi peaaegu 8 tunni võrra edasi (ATCC 13124-nakatunud hiirte puhul 32 tunnilt 40 tunnini verbaskosiidiga ravitud hiirtel) ja võib seega pikendada kliiniliseks päästmiseks kuluvat väärtuslikku aega. Kokkuvõttes näitasid meie tulemused, et hiirtel võib verbaskosiid pakkuda süsteemselt tõhusat kaitset C. perfringensi põhjustatud gaasigangreeni vastu.

Gram-positiivse anaeroobse bakterina on C. perfringens looduses laialt levinud ja võib eritada mitmesuguseid toksiine, mis võivad põhjustada inimestel ja loomadel mitmesuguseid haigusi, sealhulgas gaasigangreeni (Fraser ja Collee, 1975; Verherstraeten et al. ., 2015). Gaasgangreeni põhjustab peamiselt C. perfringensi eritatavate a- ja teetatoksiinide koosmõju, mis võib viia nakatunud loomade surmani, millega kaasneb suur majanduslik kahju. Kuid siiani on tõhusad meetodid gaasigangreeni raviks hüperbaariline hapnik, kirurgia ja antibiootikumid. Nende hulgas võib operatsioon põhjustada patsientidele olulisi füüsilisi kahjustusi ja avaldada väga ebamugavat mõju operatsioonijärgsele elule. Rootsist, Norrast, Taanist ja mujalt pärit C. perfringensi isolaatidest on leitud arvukalt tetratsükliiniresistentsuse geene. Seega on selle bakteriaalse infektsiooni vastu võitlemiseks vaja uusi strateegiaid või aineid (Park et al., 2010; Osman ja Elhariri, 2013). Selles uuringus võib fenüülpropanoidverbaskosiid, mis erineb traditsioonilistest antibakteriaalsetest ravimeetoditest (antibiootikumid), pärssida nii CPA kui ka PFO hemolüütilist aktiivsust, mis on kaks olulist poore moodustavat toksiini, mis aitavad kriitiliselt kaasa C. perfringensi patogeensusele. Rakutasandil võib verbaskosiid ka madalatel kontsentratsioonidel (025-2 ig/mL) tõhusalt kaitsta Caco-2 rakke nende kahe toksiini eest. Eelkõige võib verbaskosiid vähendada toksiinide aktiivsust, pärssides PFO oligomerisatsiooni. Need tulemused võivad anda piisavalt alusandmeid in vivo uuringute jaoks.