Akteosiid kui potentsiaalne ravivõimalus primaarse hepatotsellulaarse kartsinoomi korral: prekliiniline uuring

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen ja Zhiyong Wang

Abstraktne

Taust: Hepatotsellulaarne kartsinoom (HCC) on levinud pahaloomuline kasvaja, millel on halb prognoos, kõrge haigestumus ja suremus kogu maailmas. Eelkõige on kaugelearenenud HCC-ga patsientidele saadaval vaid mõned süsteemsed ravivõimalused, mis hõlmavad sorafeniibi ja hiljuti kirjeldatud atesolizumabi ja bevatsizumabi raviskeemi kui võimalikke esmavaliku ravimeid. Siin pakume välja akteosiidi, fenüületanoidglükosiidi, mis on laialt levinud paljudes ravimtaimedes, kui potentsiaalset kandidaati arenenud HCC vastu.

Meetodid: rakkude proliferatsiooni, kolooniate moodustumist ja migratsiooni analüüsiti inimese kolmes HCC rakuliinis BEL7404, HLF ja JHH-7. Angiogeneesi test viidi läbi HUVES-ide abil. BEL7404 või JHH-7 ksenotransplantaadi karvutute hiirte mudel loodi selleks, et analüüsida akteosiidi võimalikku kasvajavastast toimet. Akteosiidi potentsiaalsete kasvajavastaste mehhanismide paljastamiseks kasutati qRT-PCR ja Western blot analüüsi.

Tulemused:Akteosiid cistanche'istinhibeeris rakkude proliferatsiooni, kolooniate moodustumist ja migratsiooni kõigis kolmes inimese HCC rakuliinis BEL7404, HLF ja JHH-7. Angiogeneesi keelamine akteosiidi poolt ilmnes HUVEC-ide torude moodustumise ja rakkude migratsiooni pärssimisega. Akteosiidi ja sorafeniibi kombinatsioon inhibeeris tugevamalt rakukolooniate moodustumist ja HCC rakkude migratsiooni ning HUVEC-de angiogeneesi. Akteosiidi in vivo kasvajavastast efektiivsust demonstreeriti täiendavalt BEL7404 või JHH-7 ksenotransplantaadiga karvutute hiirte mudelis, kusjuures kombinatsioonis sorafeniibiga paranes JHH-7 ksenotransplantaadi kasvu pärssimine. JHH-7 rakkude edasine töötlemine akteosiidiga näitas kasvaja supressorvalgu p53 taseme tõusu, samuti kallikreiiniga seotud peptidaasi (KLK1, 2, 4, 9 ja 10) geeni taseme langust, ilma et see mõjutas oluliselt. ülejäänud KLK1–15 geenide muutused.

Järeldused:Akteosiid cistanche'istavaldab kasvajavastast toimet tõenäoliselt p53 taseme ülesreguleerimise ning KLK ekspressiooni ja angiogeneesi pärssimise kaudu. Akteosiid võib olla kasulik täiendava vahendina kaugelearenenud HCC ravis kliinikus.

Märksõnad: akteosiid, hepatotsellulaarne kartsinoom, sorafeniib, ksenograft, p53, kallikrein

Taust

Hepatotsellulaarne kartsinoom (HCC) on levinud pahaloomuline kasvaja, millel on halb prognoos ning kõrge haigestumus ja suremus kogu maailmas [1, 2]. On tuvastatud erinevad tegurid, mis aitavad kaasa HCC esinemisele ja progresseerumisele, sealhulgas B- või C-hepatiidi viirusega nakatumine, kasvaja supressorgeenide (nt p53) inaktiveerimine, onkogeenide (nt K-ras) ja mõnede signaalimolekulide ebanormaalne aktiveerimine. nagu PI3K, ERK/MAPK ja Wnt/-catenin, samuti peremeesorganismi immuunsüsteemist kõrvalehoidmine [3, 4]. HCC raviks on resektsioon, maksa siirdamine ja raadiosageduslik ablatsioon võimalused varases staadiumis HCC-ga patsientidele, kuid neil on kõrge retsidiivide ja metastaaside määr [3, 5, 6]. Lisaks on kaugelearenenud HCC-ga patsientidele saadaval vaid mõned süsteemsed ravivõimalused, sealhulgas sorafeniib ja hiljuti kirjeldatud atesolizumabi ja bevatsizumabi režiim kui võimalikud esmavaliku ravimeetodid [7]. Selles kontekstis on oluline ja huvitav töötada välja uued ained, mis on suunatud mitmele molekulaarsele sihtmärgile, või luua uus strateegia, näiteks kombineeritud ravi rakendamine arenenud HCC ravis.

Akteosiid cistanche'iston fenüületanoidglükosiid, mis on laialt levinud paljudes ravimtaimedes, sealhulgas Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] ja Ligustrum purpurascens [10]. Tõendid on näidanud, et akteosiid võib avaldada mitmesuguseid bioloogilisi toimeid, sealhulgas kasvajavastast toimet. Näiteks avaldas akteosiidil tugevat antiproliferatiivset toimet eesnäärmevähi rakkudele [11]. Akteosiidi intraperitoneaalne manustamine pärssis kasvaja kasvu melanoomi hiiremudelis, tõenäoliselt proteiinkinaasi C inhibeerimise kaudu [12]. Lisaks võimendas akteosiid kolorektaalse vähirakkude sensibiliseerimist 5- fluorouratsiili suhtes, suunates PI3K/Akt signaaliülekande [13]. Meie varasemad andmed on näidanud ka melanogeneesi pärssimist akteosiidi poolt B16 melanoomirakkudes [14]. Sellele vaatamata on vähe teavet akteosiidi võimaliku efektiivsuse kohta HCC ravis ja võimalike selle aluseks olevate mehhanismide kohta.

Käesolevas uuringus oleme seda näidanudAkteosiid cistanche'istpärsib rakkude proliferatsiooni, kolooniate moodustumist ja migratsiooni kõigis kolmes inimese HCC rakuliinis BEL7404, HLF ja JHH7. Angiogenees inhibeeritakse ka pärast ravi akteosiidiga, mida näitab tuubi moodustumise ja HUVEC-de rakkude migratsiooni pärssimine. Akteosiidi in vivo kasvajavastast efektiivsust demonstreeritakse täiendavalt BEL7404 või JHH-7 ksenotransplantaadiga karvutute hiirte mudelis, kusjuures sorafeniibiga kombineerituna JHH-7 ksenotransplantaadi kasvu pärssimine paraneb. Akteosiidi kasvajavastaseid toimeid võib seostada selle p53 ülesreguleerimisega, samuti KLK-de ja angiogeneesi pärssimisega.

meetodid

Rakukultuur

Inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) rakuliinid BEL7404, HLF ja JHH7 saadi Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist ja neid kultiveeriti rutiinselt DMEM söötmes, mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit, millele oli lisatud 100 ühikut/ml penitsilliini G ja 100 ug/ml streptomütsiini. niisutatud inkubaatoris 37 kraadi juures 5% süsinikdioksiidiga. Inimese nabaveeni endoteelirakud (HUVEC-id) eraldati inimese nabanööri veenidest (pakkuja ScienCell Research Laboratories, San Diego, USA) ja neid hoiti endoteeliraku söötmes, nagu eelnevalt kirjeldatud [15].

ReaktiividAkteosiid cistanche'ist (A01) osteti ettevõttelt Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Hiina; partii nr 100581; puhtus HPLC järgi 99 protsenti või suurem). Sorafeniib saadi ettevõttelt Selleck Chemicals (Houston, USA). Lahustasime akteosiidi 0,9 protsendilises soolalahuses. Sorafeniibi põhilahus valmistati dimetüülsulfoksiidis (DMSO; 10 mM), jaotati alikvootideks ja säilitati -20 kraadi juures.

Loomad

Uuringus kasutati isaseid BALB/c (Nu/Nu) hiiri (18-20 g, saamise ajal 6–8 nädalat) (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, Hiina). Loomi on hoitud individuaalselt ventileeritavates polüsulfoonpuurides temperatuuri ja valgusega reguleeritavas ruumis (12 h valguse- 12 h pimeduse tsükkel, valgus põleb kell 7:00 hommikul), kus on vaba juurdepääs toidule ja veele. . Kõik katseprotokollid kiitis heaks institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee ning need viidi läbi vastavalt Rahvusvahelise Valuuuringute Assotsiatsiooni juhistele laboriloomade kasutamise kohta.

Rakkude proliferatsiooni test Proliferatsioonivastane toime viidi läbi, kasutades MTT testi. Lühidalt, rakud plaaditi 96-süvendplaatidele tihedusega 4–5 × 103 rakku süvendi kohta. Pärast üleöö kinnitamist töödeldi rakke mitme akteosiidi kontsentratsiooniga. Pärast ravimiga töötlemist näidatud ajahetkel inkubeeriti rakke 3-(4,5- dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidiga (MTT). Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Lõppkontsentratsioon: 5 ug/ml) 3–4 tundi 37 kraadi juures. Formasaani produkt lahustati DMSO-s kvantifitseerimiseks lainepikkusel 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>Valgusmikroskoobi all loendati 10 rakku (× 100 suurendus; Olympus, Tokyo, Jaapan).

Haava paranemise test Rakud külvati {{0}}süvendiga plaatidele (1 × 105 rakku süvendi kohta) ja kultiveeriti 90-protsendilise konfluentsuseni. Rakukihti kriimustati steriilse 200 ul pipetiotsaga, et tekitada haavapilu. Rakkude migratsioon haavapiirkonda visualiseeriti näidatud ajahetkedel (0, 10 ja 24 h) pööratud valgusmikroskoobi all suurendusega × 100. Iga katse viidi läbi kolmes eksemplaris.

Toru moodustumise test HUVEC-sid kultiveeriti eelnevalt kirjeldatud viisil [15]. Lühidalt, 96-kaevuplaadid kaeti vastavalt tootja juhistele Matrigeliga (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) ja viidi seejärel tagasi inkubaatorisse 30–40 minutiks polümeriseerumiseks. Seejärel külvati HUVEC-id tihedusega 2 × 105 rakku / ml ja töödeldi erinevate ravimitega 8 tundi. Toru moodustumist pildistati näidatud ajahetkedel pööratud mikroskoobiga ja analüüsiti ImageJ tarkvara abil.

Western blot analüüs

Raku kogulüsaadid valmistati radioimmunosadestamise analüüsi puhvriga (RIPA) (50 mM Tris HCl pH väärtusel 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% naatriumdesoksükolaati, 0,1% SDS, 10 ug ug/ml leupeptiini, 10 ug/ml aprotiniini ja 2 mM PMSF-i). Võrdsete kogustega (20 ug/raja kohta) valguproovid eraldati SDS-PAGE geelil ja kanti üle PVDF membraanidele (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraane inkubeeriti üleöö p53 antikehaga (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Laadimiskontrollide jaoks loputati membraane eemaldamispuhvriga ja sondeeriti uuesti -aktiini antikehaga (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Valgud tuvastati ECL-tuvastussüsteemi abil (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

qRT-PCR

Kogu RNA ekstraheeriti rakuliinidest, kasutades Trizol reagenti (Invitrogen, USA) ja läbis pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR), et sünteesida cDNA, kasutades kaubanduslikult saadavat komplekti. Reaalajas qRT-PCR, kasutades 2xSYBR rohelist qPCR Supermixi, viidi läbi Stratagene Mx3000P PRC masinas (Agilent Technologies, USA). Praimeri järjestused on näidatud allpool: senss 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' ja antisenss 5'-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' KLK1 jaoks; senss 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ ja antisenss 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ KLK2 jaoks; senss 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ ja antisenss 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ KLK3 jaoks; senss 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ ja antisenss 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ KLK4 jaoks; senss 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ ja antisenss 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ KLK5 jaoks; senss 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ ja antisenss 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ KLK6 jaoks; senss 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ ja antisenss 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ KLK7 jaoks; senss 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ ja antisenss 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ KLK8 jaoks; senss 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ ja antisenss 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ KLK9 jaoks; senss 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ ja antisenss 5′-CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ KLK10 jaoks; senss 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ ja antisenss 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ KLK11 jaoks; senss 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ ja antisenss 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ KLK12 jaoks; senss 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ ja antisenss 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ KLK13 jaoks; senss 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ ja antisenss 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ KLK14 jaoks; senss 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ ja antisenss 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ KLK15 jaoks; senss 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ ja antisenss 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ GAPDH jaoks. Iga KLK geeni tsükli läve (Ct) väärtused normaliseeriti GAPDH omadega ja analüüsiti MxPro tarkvaraga.

A01 kasvajavastane toime in vivo üksinda või kombinatsioonis sorafeniibiga Valmistati BEL7404 rakususpensioonid (3 × 106 rakku) ja süstiti subkutaanselt raku paremasse külge. tüümuseta alasti hiired. Kümme päeva pärast inokuleerimist skriiniti kasvajaga hiiri (kehakaal (g): 22–26; keskmine ± SEM: 23,8 ± 0,14) ja valiti randomiseerimiseks 7 ravirühma, võttes arvesse kasvaja mahtu ({ {12}} mm3). Erinevatesse ravirühmadesse määrati kokku 38 hiirt (n=5 rühma kohta, välja arvatud mudelrühm (n=8)). Seejärel raviti loomi suukaudse sondiga akteosiidiga (A01; 12,5, 25 ja 50 mg/kg), sorafeniibiga üksi (50 mg/kg) või kombinatsioonis A01-ga (50 mg/kg) üks kord päevas 14 päeva jooksul. Lisaks manustati intravenoosselt ka annus 20 mg/kg A01. Annused valiti varasemate uuringute ja meie esialgsete andmete põhjal [15]. Kasvaja kasvu jälgiti iga 3 või 4 päeva järel, kasutades elektroonilist nihikut, mille maht arvutati 0,5 x pikkus x laius (mm3). Lisaks lisati paralleelkatse JHH-7 inokulatsiooniga. Seitse päeva pärast inokuleerimist skriiniti kasvajaga hiiri (kehakaal (g): 20–26; keskmine ± SEM: 24,0 ± 0,20) ja valiti randomiseerimiseks ravirühmadesse vastavalt kasvaja mahule (80-130 mm3). ). Kokku 23 hiirt määrati 4 ravirühma (n=5 rühma kohta, välja arvatud mudelrühm (n=8)). Seejärel said loomad A01 (20 mg/kg, iv), sorafeniibi üksinda (50 mg/kg, ig) või koos A01-ga (20 mg/kg, iv) üks kord päevas 14 järjestikuse päeva jooksul. Kõik hiired anesteseeriti kloraalhüdraadiga (350 mg/kg) ja surmati vaatlusperioodi lõpus kaela dislokatsiooniga. Ja kasvaja mass eemaldati ja pildistati digikaameraga.

Statistiline analüüs

Kõik andmed on väljendatud keskmisena ± standardhälbe (SD). Kui pole öeldud teisiti, viidi statistilised analüüsid läbi dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes posthoc Tukey test. Kasvaja mahu väärtused on näidatud kui keskmine ± keskmise standardviga (SEM). Kasvaja mahu andmete analüüsimiseks kasutati kahesuunalist ANOVA-d, millele järgnesid Tukey testid. Statistilisteks analüüsideks kasutati GraphPad Prism tarkvara. Väärtust p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Tulemused

A01 mõju HCC-de proliferatsioonile ja kolooniate moodustumisele in vitro

Rakkude proliferatsiooni testis kasutati kolme HCC rakuliini (BEL7404, HLF ja JHH7). Nagu on näidatud joonisel 1, näitas MTT test, et A01 inhibeeris kõigi kolme HCC raku proliferatsiooni. Et täiendavalt küsida, kas A01 antiproliferatiivne aktiivsus oli tingitud selle võimest inhibeerida rakkude klonogeensust, viidi läbi kolooniate moodustumise test. A01 kontsentratsioonil 100 µM näitas tugevat kolooniate moodustumise pärssimist BEL7404 rakkudes (joonised 2a ja b). Kombineerituna sorafeniibiga (2 μM) oli inhibeerimisvõime tugevam kui A01 või sorafeniibi üksinda. Sarnaseid tulemusi nähti ka kahes teises HCC rakus, HLF ja JHH-7 (joonised 2c ja d).

A01 mõju üksi või kombinatsioonis sorafeniibiga HCC-de rakkude migratsioonile in vitro

Järgmisena hindasime rakkude migratsiooni, kasutades kriimustushaava testi. Nagu on näidatud joonisel 3, takistas A01 (100 või 500 µM) ja sorafeniibi (10 µM) kombinatsioon kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärselt haavade paranemist kõigis kolmes HCC rakus. BEL7404 rakkude puhul põhjustasid nii A01 (100 või 500 μM) kui ka sorafeniib (10 μM) haavade paranemise ennetamise tendentsi, millel polnud statistilist tähtsust (joonised 3a ja d). HLF-rakkude puhul inhibeeris A01 500 μM ja sorafeniib 10 μM juures haava paranemist. Täpsemalt, A01 (500 µM) koos sorafeniibiga (10 µM) pärssis haavade paranemist tugevamalt kui sorafeniib üksi (joonised 3b ja e). JHH rakkude puhul takistasid haavade paranemist A01 (500 μM) ja sorafeniib (10 μM). A01 (100 μM) ja sorafeniibi (10 μM) kombinatsioon inhibeeris haavade paranemist tugevamalt kui A01 (100 μM) või sorafeniib (10 μM) üksi. Veelgi enam, A01 kontsentratsioonis 500 μM koos sorafeniibiga (10 μM) inhibeeris haavade paranemist tugevamalt kui A01 (500 μM) või sorafeniib (10 μM) üksi (joonis 3c ja f).

A01 mõju üksi või kombinatsioonis sorafeniibiga angiogeneesile in vitro

Angiogenees on tihedalt seotud kasvaja kasvu, progresseerumise ja metastaasidega [16] ning seetõttu peetakse seda vähiravi üheks vahepealseks sihtmärgiks. Esmalt viisime läbi toru moodustumise testi, et analüüsida potentsiaalset angiogeneesi in vitro. Nagu on näidatud joonisel 4, hakkas 3-tunnine töötlemine ainult sorafeniibiga (10 μM) või A01 (100 ja 500 μM) ja sorafeniibi (10 μM) kombinatsiooniga avaldama pärssivat toimet veresoonelaadsete struktuuride tekkele, st. HUVEC-ide pikenemine ja joondamine (joonised 4a ja c). Pärast 8-tunnist töötlemist inhibeerisid A01 (100 ja 500 μM), sorafeniib (10 μM) ning A01 ja sorafeniibi kombinatsioon märkimisväärselt veresoonesarnaste struktuuride moodustumist, kusjuures A01 ja sorafeniibi kombinatsioon pärssis tugevamini kui A01 või sorafeniib üksi (joonis 4a ja c). Lisaks on HUVEC-ide rakkude migratsioon angiogeneesi ajal uute veresoonte moodustamise võtmesamm ja seetõttu uuritakse seda. Nagu on näidatud joonistel 4b ja d, inhibeerisid A01 (500 μM), sorafeniib (10 μM) ning A01 (100 ja 500 μM) ja sorafeniibi (10 μM) kombinatsioon märkimisväärselt HUVEC-ide rakkude migratsiooni. A01 (500 μM) koos sorafeniibiga (10 μM) andis tugevama inhibeerimise kui A01 (500 μM) või sorafeniib (10 μM) üksi.

A01 mõju üksi või kombinatsioonis sorafeniibiga BEL7404 ja JHH-7 HCC ksenotransplantaatide kasvaja kasvule in vivo

A01 eraldi või sorafeniibiga kombineeritud efektiivsuse edasiseks hindamiseks HCC kasvaja in vivo kasvu suhtes koostasime subkutaanse ksenotransplantaadi karvutu hiire mudeli, kasutades BEL7404 või JHH-7 rakud. Nagu on näidatud joonisel 5, vähenes kasvaja maht oluliselt pärast ravi A01-ga (25 ja 50 mg/kg, suukaudse sondiga; 20 mg/kg, sabaveeni kaudu; kõik p < 0,01="" vs.="" mudelrühm)="" või="" sorafeniib="" (50="" mg/kg,="" suukaudse="" sondiga;="" p="">< 0,01="" vs.="" mudelrühm)="" üksi="" (joonised="" 5a="" ja="" b).="" a01="" (50="" mg/kg)="" ja="" sorafeniibi="" (50="" mg/kg)="" kombinatsioon="" näitas="" kasvaja="" kasvu="" tugevamat="" pärssimist="" võrreldes="" ainult="" sorafeniibiga="" (p="">< 0,01),="" kuid="" andis="" sarnase="" toime="" kui="" a01="" üksinda="" (joonised="" 5a="" ja="" c).="" ).="" järgmisena="" kasutasime="" jhh-7="" ksenotransplantaadiga="" karvutute="" hiirte="" mudelit,="" et="" täiendavalt="" testida="" a01="" võimalikku="" kasvajavastast="" toimet.="" nagu="" on="" näidatud="" joonisel="" 6,="" põhjustas="" ravi="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" või="" sorafeniibiga="" (50="" mg/kg,="" ig)="" jhh-7="" ksenotransplantaadi="" kasvaja="" kasvu="" olulise="" pärssimise="" (p="">< 0,01="" vs="" mudelrühm="" ),="" suurema="" inhibeerimisega,="" kui="" neid="" kombineerida="" (joonised="" fig="" 6a="" ja="" b;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" või="" sorafeniibi="" rühm="">

Kallikreiiniga seotud peptidaasi ja p53 võimalik moduleerimineAkteosiid cistanche'ist

Kallikreiiniga seotud peptidaasi (KLK) on pakutud vähi biomarkerina erinevate vähivormide, sealhulgas hepatotsellulaarse kartsinoomi diagnoosimisel ja prognoosimisel selle düsreguleeritud ekspressiooni tõttu [17–19]. Selle stsenaariumi korral tuvastasime KLK1–15 geeniekspressiooni HCC JHH-7 rakuliinis. Nagu on näidatud joonisel 7, inhibeeris ravi akteosiidiga KLK1, 2, 4, 9 ja 10 mRNA tasemeid (joonised 7a–e), ülejäänud KLK1–15 osas olulisi muutusi ei toimunud (andmeid ei ole näidatud). ). Lisaks tuvastasime ka tuumori supressorvalgu p53 taseme ja tuvastasime tõusu akteosiidiga töötlemisel (joonis 7f).

Arutelu

Kaugelearenenud HCC juhtimine on olnud pikka aega raskesti lahendatav, kuna varasemates staadiumides ei ole võimalik diagnoosida ja kasvaja kemoresistentsus [5, 6]. Sorafeniib, multikinaasi inhibiitor, mis inhibeerib rakkude proliferatsiooni ja angiogeneesi, koos teise suukaudse multikinaasi inhibiitoriga lenvatiniib on muutunud arenenud HCC standardseks raviks [3, 5, 20, 21]. Üldine elulemus on siiski tagasihoidlik, arvestades madalat ravivastuse määra ja sobimatust kliinilistes tingimustes [3, 22]. Hiljutine uuring näitas, et atesolisumab ja bevatsizumab andsid mitteopereeritava HCC-ga patsientidel paremaid kliinilisi tulemusi kui sorafeniib, muutes selle kombinatsiooni võimalikuks uueks esmavaliku ravivõimaluseks kaugelearenenud HCC jaoks [7]. Selles kontekstis oleme tuvastanud, et fenüületanoidglükosiid,Akteosiid cistanche'istinhibeeris rakkude proliferatsiooni, kolooniate moodustumist ja migratsiooni inimese kolmes HCC rakuliinis BEL7404, HLF ja JHH-7, samuti keelas HUVEC-de angiogeneesi. Akteosiidi ja sorafeniibi kombinatsioon inhibeeris tugevamalt rakukolooniate moodustumist ja HCC rakkude migratsiooni ning HUVEC-de angiogeneesi. Acteoside näitas kasvajavastast efektiivsust BEL7404 või JHH-7 ksenotransplantaadi karvutute hiirte mudelis koos sorafeniibiga kombineerituna JHH-7 ksenotransplantaadi kasvu pärssimisel. Edasised analüüsid näitasid p53 suurenemist ja mõnede KLK geenide vähenemist. Sellest lähtuvalt tuleks kaaluda akteosiidi võimalikku kasutamist täiendavate ainetena kaugelearenenud HCC ravis kliinikus.

Tõendid on näidanud kasvajavastast toimetAkteosiid cistanche'isterinevates kasvajarakkudes, nagu B16 melanoomirakud, glioblastoomirakud, kolorektaalvähirakud, suu lamerakk-kartsinoomirakud, eesnäärmevähi rakud ja inimese rinnanäärme adenokartsinoomirakud [11–13, 23–25] või kasvajatega loomadel [12]. Sellele vaatamata on vähesed uuringud keskendunud akteosiidi mõjule HCC-le in vitro või in vivo, välja arvatud üks uuring, milles kasutati kantserogeenina dietüülnitrosamiini, et indutseerida rottidel hepatokartsinogeneesi ja paljastada akteosiidi kemopreventsioon [26]. Käesolevas uuringus näitasime rakkude proliferatsiooni, kolooniate moodustumise ja migratsiooni inhibeerimist akteosiidide poolt HCC rakuliinides, samuti kasvaja kasvu hiirtel, kellel on HCC rakuliini ksenotransplantaadid, näidates sellega otseselt akteosiidi kasvajavastast toimet HCC-s. Lisaks andis akteosiidi ja sorafeniibi kombinatsioon veelgi tugevama kasvajavastase toime. Koos tõenditega, et akteosiid kaitseb maksakahjustuste eest [27–29], millel puudub toksiline toime loomadele ja puudub mutageensus [30], näib olevat võimalik rakendada tulevikus akteosiidi ja sorafeniibi kombinatsioonravi kaugelearenenud patsientidel. HCC kliinikus.

Inimese kallikreiini perekond koosneb 15 homoloogsest üheahelalisest sekreteeritud trüpsiini- või kümotrüpsiinitaolisest seriiniproteaasist (KLK1–15) ja see on seotud kasvaja kasvu, neoplastilise progresseerumise, angiogeneesi ja metastaaside reguleerimisega [18, 31]. Eelkõige on KLK-sid soovitatud vähi biomarkeriteks mitmesuguste vähivormide, sealhulgas hepatotsellulaarse kartsinoomi diagnoosimisel ja prognoosimisel selle düsreguleeritud ekspressiooni tõttu [17–19]. Näiteks pakutakse KLK1-d maovähi biomarkerina tänu KLK1 taseme tõusule mao kasvajas ja kasvaja kasvu ennetamisele maovähi korral, inhibeerides KLK1 aktiivsust kallikreiini siduva valguga (KBP) [32]. Selle stsenaariumi korral täheldasime akteosiidi (KLK1, 2, 4, 9 ja 10) KLK mRNA taseme olulist pärssimist. Teatati, et KBP, mis seondub spetsiifiliselt koe kallikreiiniga ja inhibeerib kallikreiini aktiivsust, kasutamine pärsib hiirtel HCC kasvu, tõenäoliselt selle angiogeneesivastase toime kaudu [33], mis viitab KLK-de võimalikule osalemisele HCC progresseerumisel. Lisaks on kasvaja supressorvalk p53 võimeline indutseerima vananemist, apoptoosi ja rakutsükli peatamist. Suurenenud p53 ekspressioon suurendab vähirakkudes kemosensitiivsust [34]. Sellega seoses näitasid meie lääne tulemused p53 taseme tõusu pärast ravi akteosiidiga. Kokkuvõttes on mõistlik järeldada, et akteosiid avaldab kasvajavastast toimet HCC-le, tõenäoliselt p53 ülesreguleerimise ning KLK ja angiogeneesi inhibeerimise kaudu.

Tuleb märkida, et otsene molekulaarne sihtmärk, milleleAkteosiid cistanche'istvõib otseselt siduda, on endiselt ebaselge. Meie esialgsed andmed molekulaarse dokkimise abil näitasid akteosiidi otsest seondumist kallikreiiniga (andmeid pole näidatud). Selle eelduse selgitamiseks oleks vaja täiendavaid katseid. Lisaks sellele, mis puudutab uuringus rakuanalüüsis kasutatud akteosiidi annuste puhul, mis olid 10–50 korda suuremad kui sorafeniibil (10 μM), valisime need akteosiidi annused kõigepealt vastavalt annuse-vastuse suhe MTT testis. Teiseks olid meie kasutatud annused (100, 500 μM) võrreldavad varasemate uuringutega [35], milles akteosiid (100 μM) pärssis kolorektaalse vähi rakkude proliferatsiooni. Lõpuks, hoolimata rakuanalüüsi suuremast annusest, põhjustas akteosiid meie uuringus HCC ksenotransplantaadi karvutute hiirte mudelis kasvaja kasvu märgatava pärssimise (25 ja 50 mg/kg), kusjuures toime oli sarnane sorafeniibiga (50 mg/kg). Sorafeniibi puhul kasutati seda meie uuringus rakutasandil annuses 10 μM. See annus on võrreldav varasemate uuringutega, milles leiti, et sorafeniib pärsib rakkude elujõulisust IC50 väärtusega 4,0–6,5 μM PLC/PRF/5 ja HepG2 rakkude HCC rakuliinides. Seevastu sorafeniibi annus, mida kasutati HCC ksenotransplantaatide kasvu pärssimiseks emastel SCID-hiirtel, oli 30 mg/kg (poos sondiga) [36]. Kliinikus on sorafeniibi soovitatav annus patsiendile 400 mg korraga (2*0,2 g), kaks korda päevas (kokku 800 mg päevas). See kliinikus kasutatav sorafeniibi annus on vastupidine rakuanalüüsis kasutatavale annusele (IC50 väärtus μM tasemel), mis võib olla tingitud selle halvast imenduvusest in vivo tingimustes. Akteosiidi puhul, lähtudes selle annusest hiirtel (50 mg/kg, ig), on selle ekvivalentdoos inimestele (60 kg kehamassi) ligikaudu 250 mg. See annus on võrreldav kliinikus kasutatava sorafeniibi annusega ja peaks olema patsientidele vastuvõetav.

Järeldused KokkuvõtteksAkteosiid cistanche'iston võimeline avaldama kasvajavastast toimet HCC rakuliinidel ja karvututel hiirtel, kellel on HCC rakuliini ksenotransplantaadid, mis võib olla tingitud p53 taseme tõstmisest, samuti KLK ja angiogeneesi keelamisest. Akteosiid võib olla kasulik täiendava vahendina kaugelearenenud HCC ravis kliinikus.

Viited

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Globaalne vähistatistika 2018: GLOBOCANi hinnangud esinemissageduse ja suremuse kohta kogu maailmas 36 vähi puhul 185 riigis. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatotsellulaarne kartsinoom. Nat Rev Dis krundid. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Hepatotsellulaarne kartsinoom immunoteraapia ajastul. Curr Probl Vähk. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Hepatotsellulaarne kartsinoom: progresseerumise mehhanismid ja immunoteraapia. Maailma J Gastroenterool. 2019; 25 (25): 3151–67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Vastuolud hepatotsellulaarse kartsinoomi ravis. JHEP Vabariik 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Hepatotsellulaarse kartsinoomi diagnoosimine ja ravi. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO jt. Atesolisumab pluss bevatsizumab mitteopereeritava hepatotsellulaarse kartsinoomi korral. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Monoterpenoid- ja fenüületanoidglükosiidid taimest Ligustrum peduncular. Fütokeemia. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC määramineakteosiidaastal Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Ligustrum purpurascens'i fenüületanoidglükosiidide antioksüdatiivne toime. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Looduslike fenüületanoidglükosiidide üldine sünteetiline strateegia ja eesnäärmevähi rakuliinide proliferatsioonivastased omadused. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I jt. Taimse aine akteosiidi selektiivne tsütotoksilisus kasvajarakkude vastu ja selle mehaanilised arusaamad. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbaskosiid: kolorektaalsete vähirakkude tuvastamine, kvantifitseerimine ja võimalik sensibiliseerimine 5-FU suhtes, sihites PI3K/AKT rada. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Osmanthus fragrans lillede vesiekstrakt ja selle rikastatud akteosiid pärsivad melanogeneesi ja ultraviolettkiirguse põhjustatud pigmentatsiooni. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Uudne PI3K inhibiitor S1 sünergiseerub sorafeniibiga mitteväikerakk-kopsuvähirakkudes, kaasates Akt-S6 signaaliülekande. Uute ravimite uurimine. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Vähi tunnused: järgmine põlvkond. Kamber. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Kallikreiiniga seotud peptidaaside (KLK) kasulikkus vähi biomarkeritena. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostic and prognostic biomarker potentsiaal of kallikrein family genes in different cancer types. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) in gastrointestinal cancer: mehhaanilised ja kliinilised aspektid. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS jt. Sorafeniibi efektiivsus ja ohutus kaugelearenenud hepatotsellulaarse kartsinoomiga Aasia ja Vaikse ookeani piirkonna patsientidel: III faasi randomiseeritud topeltpime platseebokontrollitud uuring. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A jt. Sorafeniib kaugelearenenud hepatotsellulaarse kartsinoomi korral. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Laul MJ. Maksaarteri infusioonikemoteraapia kaugelearenenud hepatotsellulaarse kartsinoomi korral. Maailma J Gastroenterool. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Anisomeles India vesiekstrakt ja selle puhastatud ühend avaldavad metastaatilise toimega NF kappaB/AP-1-sõltuva MMP-9 aktivatsiooni pärssimise kaudu inimese rinnavähi MCF-7 rakkudes. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B jt. Verbaskosiidi mõju apoptoosile ja metastaasidele inimese suuõõne lamerakulise kartsinoomi korral. Int J Vähk. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Akteosiidil ja temosolomiidil põhineva glioblastoomi keemiaravi sünergistlik vähivastane toime. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Akteosiid vahendab eksperimentaalse maksakantserogeneesi kemopreventsiooni STAT-3 reguleeritud oksüdatiivse stressi ja apoptoosi kaudu. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Dieedi akteosiidi metaboliidid: profiilid, isoleerimine, tuvastamine ja hepatoprotektiivsed võimed. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Akteosiid inhibeerib apoptoosi D-galaktosamiini ja lipopolüsahhariidide põhjustatud maksakahjustuse korral. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Akteosiidi kaitsev toime Bacillus Calmette Guerini ja lipopolüsahhariidi poolt põhjustatud immunoloogilisele maksakahjustusele. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Osmanthuse lõhnava lille fenüületanoidglükosiidirikas ekstrakt: ägeda ja subkroonilise toksilisuse uuringud. J Etnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Inimkoe kallikreiinid: uute vähi biomarkerite perekond. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Kudede kallikreiini ja kiniini retseptori ekspressiooni võrdlus maohaavandites ja neoplasmides. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding valk supresseerib hepatotsellulaarse kartsinoomi kasvu antiangiogeense toimega. Cancer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. P53 valgu suurendamine sensibiliseerib mitteväikerakk-kopsuvähi in vitro paklitakseeli ja tsisplatiini suhtes. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbaskosiid soodustab apoptoosi, reguleerides inimese HIPK2-p53 signaaliülekannet pärasoolevähk. BMC vähk. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafeniib blokeerib RAF/MEK/ERK rada, inhibeerib kasvaja angiogeneesi ja kutsub esile kasvajarakkude apoptoosi hepatotsellulaarses kartsinoomi mudel PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.