Kalorite piiramise vanusetundlik efektiivsus mitokondriaalses biogeneesis ja MtDNA kahjustuses roti maksas

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Kalorite piiramine (CR) on kõige tõhusam raviviis vanusega seotud muutuste, nagu mitokondriaalse düsfunktsiooni, alguse edasilükkamiseks. Mitokondriaalsete markerite tundlikkus CR-i suhtes ja CR-i efektiivsuse vanusega seotud piirid ei ole siiski täielikult välja selgitatud. Kasutasime ad libitum toidetud (AL) rottide maksaproove, mis jaotati: 18-kuused (AL-18), 28-kuused (AL-28) , ja 32-month-old(AL-32) rühmad ning CR-ga ravitud (CR) 28-kuused (CR-28) ja 32- kuuvanused (CR-32) vasted, et analüüsida CR mõju mitmele mitokondriaalsele markerile. Vanusega seotud tsitraadi süntaasi aktiivsuse, TFAM-i, MFN2- ja DRP1-valgu koguste ning mtDNA sisalduse vähenemine AL-28-rühmas hoiti ära CR-28-kaaslastel. Seega vähendas CR oksüdatiivset mtDNA kahjustust, hinnates oksüdeeritud puriinide esinemissagedust spetsiifilistes mtDNA piirkondades CR-28 loomadel. Need leiud toetavad CR vananemisvastast toimet kuni 28 kuud. Vastupidi, CR-28 rottidel ei mõjutanud LonP1, Cyt c, OGG1 ja APE1 valgukogused ning 4,8 kb mtDNA deletsioonisisaldus. Oluliste erinevuste puudumine AL-32 väärtuste ja CR-32 vastete vahel viitab vanusega seotud CRefektiivsuse piirile selles vanuses.puritaanid c-vitamiinKuid see piirab ainult osaliselt CR eeliseid üldise vananemise languse ja sellega seotud mitokondrite kaasamise vastu.

Märksõnad:roti maks; vananemine; kalorite piiramine; mitokondriaalne biogenees; mtDNA kahjustus; CR vanusetundlik efektiivsus

KSL21

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Vastavalt vananemisprotsessi uurivate uuringute muljetavaldavale edenemisele on järjestikku koostatud mitu erinevat protsessi määratlust ning nn vananemise tunnusteks on määratletud radade ja vahendajate kogum [1,2]. Nende hulgas on otsustavate teguritena esile kerkinud mitokondriaalne düsfunktsioon, oksüdatiivne stress ja mitokondrite molekulaarne kahjustus. Vananemise oluline tunnus on koespetsiifilisus, mida on esile tõstetud mitokondriaalse osaluse [3, 4], epigeneetiliste muutuste [5] ja muude muutuste, näiteks telomeeri pikkuse [6] tõttu. Erinevate ravimeetodite hulgas, mille eesmärk on ennetada või edasi lükata vanusega seotud muutuste teket, on kalorite piiramine (CR) vanim välja pakutud strateegia [7] ja see on endiselt kuldstandard selle sekkumisega kaasnevate väga paljude kasulike mõjude jaoks. Tõepoolest, hiljutised uuringud CR poolt esile kutsutud molekulaarsete mehhanismide kohta on näidanud, et see toitumisalane sekkumine mõjutab positiivselt mitmeid viise [8-10].sistancheLisaks toetavad need leiud tugevalt ka vananemise "plastilisuse" [5, 9, 11, 12] olemasolu, mida saab moduleerida keskkonnamõjude kaudu, nagu toitumis- või farmaatsia sekkumised või elustiiliharjumused. On juba näidatud, et CR neutraliseerib mitokondriaalse biogeneesi ja metabolismi vanusega seotud muutusi mitmes roti kudedes, millel on koespetsiifiline toime [3, 13, 14]. Täpsemalt näitasid meie rühma varasemad uuringud roti maksa kohta, mida mitokondriaalsel tasemel vananemine sügavalt mõjutab, organellaarsete markerite uurimisel CR positiivset mõju mitokondriaalse vanusega seotud muutustele. Tegelikult on CR-ravi saanud 28-kuuste rottide puhul mitokondriaalse DNA (mtDNA) sisaldus, mitokondriaalses biogeneesis osalevate või ROS-tundlike valkude hulk ja mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (TFAM) seondumise ulatus. konkreetsetes mtDNA piirkondades olid väärtused, mis erinevad oluliselt vanusega sobitatud ad libitum-toidetud (AL) analoogide väärtustest ega erinenud statistiliselt nooremate 18-kuuste AL-toidetud loomade väärtustest [15]. Hiljuti võimaldas AL-vanuste (28-kuuste) ja äärmiselt vanade (32-kuuste) rottide maksa mitokondriaalse biogeneesi ja mtDNA kahjustuse analüüs uurida mitmekesist massiivi. mitokondriaalseid parameetreid ja soovitada erinevat vananemistempot seoses mitokondrite kaasamisega, kuna vähesed loomad saavutavad loomulikult pikaealisuse, võrreldes enamiku vananevate loomadega [16, 17]. Nende tingimustega püüdsime hinnata CR-i efektiivsust suurel hulgal mitokondriaalseid markereid roti maksas erinevas vanuses. Nendel eesmärkidel kasutasime loomi väga pikaealisest hübriidtüvest Fischer 344× Brown Norway, kelle hulgast valiti kontrollideks 18-kuused ad libitum toidetud rotid (AL-18), võrrelda ad libitum toidetud, ealiste (AL-28) ja üliealiste (AL-32) loomadega ning CR-ravi saanud vanusega sobivate loomadega (CR-28 ja CR{ {39}}). Nendes rotirühmades hindasime: mitokondriaalse ensüümi tsitraadi süntaasi aktiivsust, valkude komplekti, sealhulgas TFAM, Lon proteaasi (LonP1) ja tsütokroom c (Cyt c), mtDNA-d parandavate ensüümide ekspressiooni 8- okso-DNA glükosülaas/apuriin- või apürimidiini (AP) lüaas (OGG1) ja apuriin/apürimidiini endonukleaas 1 (APE1) ning mitokondriaalse dünaamika valgud mitofusiin 2 (MFN2) ja dünamiiniga seotud valk 1 (DRP1). Lõpuks määrati ka mtDNA sisaldus ja oksüdatiivsed kahjustused konkreetsetes piirkondades.

2. Tulemused

2.1. Vanuse ja CR mõju hindamine mitokondriaalse funktsionaalsuse markeritele

Tsitraadi süntaasi aktiivsus, mis on ka mitokondriaalse massi marker, määrati kõigis viies rotirühmas, et hinnata mitokondriaalse funktsionaalsuse tundlikkust vananemise ja CR suhtes (joonis 1).

Vanusega seotud statistiliselt olulist tsitraadi süntaasi aktiivsuse langust täheldati AL{{1} (-41 protsenti) ja AL-32 (-40 protsenti) rottidel võrreldes AL{{ 5}} vanusekontroll. Statistiliselt olulist erinevust AL-28 ja AL-32 rühmade vahel ei leitud. CR-efekti demonstreeris oluliselt kõrgem (pluss 40 protsenti) ensüümi aktiivsus CR-28 rottidel võrreldes vanusega sobiva AL-28 roti väärtusega. Lisaks oli CR-28 aktiivsus sarnane sellega, mida täheldati noorematel AL-18 kontrollrottidel (joonis 1). See efekt oli CR-32 loomadel hoopis nüristunud. Tegelikult ei täheldatud vanemas vanuses 32 kuud statistilist erinevust AL- ja CR-rühmade vahel.

KSL22

cistanche võib vananemisvastane

Et süvendada vanuse ja CR mõju analüüsi mitokondriaalsele funktsionaalsusele, määrati kõigist rotirühmadest isoleeritud mitokondrites TFAM ja LonP1 valgu kogus Western blot analüüsiga, milles kasutati mitokondriaalse välismembraani VDAC valku. sisemine laadimiskontroll (joonis 2).

Joonis 2. TFAM-i ja LonP1 valkude kogused isoleeritud maksa mitokondrites AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 ja CR-32-kuust - vanad rotid. (A). TFAM valgu kogused erinevatest rotirühmadest eraldatud maksa mitokondrites. Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast. Immunoreaktiivsed ribad ülalt alla tähistavad vastavalt TFAM-i ja VDAC-i signaale. Histogramm näitab TFAM-i ribade intensiivsuse kvantifitseerimist, mis on normaliseeritud VDAC.(B).LonP1 valgu kogustes erinevatest rotirühmadest eraldatud maksa mitokondrites. Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast. Ülevalt alla tähistavad immunoreaktiivsed ribad vastavalt LonP1 ja VDAC signaale.mis on cistancheHistogramm näitab LonP1 ribade intensiivsuse kvantifitseerimist, mis on normaliseeritud VDAC intensiivsusega. (A, B) Andmed esindavad kolmekordse Western blot katse tulemusi ja neid analüüsiti ühesuunalise ANOVA testi ja Tukey mitmekordse võrdlustesti abil. . Tulbad tähistavad viie katserühma keskmisi väärtusi ja SD-d. Andmed normaliseeriti AL-18 rottide väärtuse suhtes, fikseeritud väärtusega 1,*p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

KSL23

Et hinnata vananemise ja CR mõju teisele mitokondriaalsele metaboolsele funktsioonile, mis on mitokondriaalse sisemise apoptootilise raja käivitamine, määrasime Western blot katsetega Cyt c mitokondriaalse koguse (joonis 3).

Joonis 3. Cyt c valgu kogused isoleeritud maksa mitokondrites AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 ja CR-32-kuu- vanad rotid. Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast. Ülevalt alla tähistavad immunoreaktiivsed ribad vastavalt Cyt c ja VDAC signaale. Histogramm näitab Cyt c ribade intensiivsuse kvantifitseerimist, mis on normaliseeritud VDAC intensiivsusega. Kõik andmed esindasid kolmekordse Western blot katse tulemusi ja neid analüüsiti ühesuunalise ANOVA testi ja Tukey mitmekordse võrdlustesti abil. Tulbad tähistavad viie katserühma keskmisi väärtusi ja SD-d. Andmed normaliseeriti AL-18 rottide väärtuse suhtes, fikseerituna 1,* p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">Vananemisvastane cistancheCR-efekt ei olnud üldse asjakohane, kuna vanusega sobitatud AL- ja CR-rühmade vahel ei olnud olulisi erinevusi Cyt c valgu kogustes nii 28 kui ka 32 kuu pärast. Vanusega seotud Cyt c koguste vähenemine kahes rühmas näitas suundumust, mis sarnanes AL-28 ja AL-32 rühmades täheldatuga, kusjuures CR-28 loomadel vähenes asjakohasem. osaliselt takistatud vanematel CR-32 rottidel.

2.2. Vanuse ja CR mõju hindamine mtDNA parandamise ensüümidele

Kuna on näidatud, et vananemine on suuresti seotud mtDNA kahjustuste kuhjumisega, mõõtsime Western blot katsetega isoleeritud maksa mitokondrites kahe peamise mtDNA parandamise ensüümi, nimelt 8-okso DNA glükosülaasi/apuriini ekspressiooni. või apürimidiin(AP)lüaas (OGG1) ja apuriin/apürimidiini endonukleaas 1 (APE1), mis mõlemad osalevad aluse ekstsisiooni parandamises (BER), mis on levinud mtDNA parandusmehhanism (joonis 4).

Joonis 4. OGG1 ja APEl valkude kogused isoleeritud maksa mitokondrites AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 ja CR-32- kuust - vanad rotid. (A). Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast. Immunoreaktiivsed ribad ülalt alla tähistavad vastavalt OGGl ja VDAC signaale. Histogramm näitab VDAC (B) intensiivsusega normaliseeritud OGG1 ribade intensiivsuse kvantifitseerimist. Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast.cistanche benefíciosÜlevalt alla tähistavad immunoreaktiivsed ribad vastavalt APE1 ja VDAC signaale. Histogramm näitab APE1 ribade intensiivsuse kvantifitseerimist, mis on normaliseeritud VDAC intensiivsusega. (A, B) Andmed esindasid kolmekordse Western blot katsete tulemusi ja neid analüüsiti ühesuunalise ANOVA testi ja Tukey mitmekordse võrdlustesti abil. Tulbad tähistavad viie katserühma keskmisi väärtusi ja SD-d. Andmed normaliseeriti AL-18 rottide väärtuse suhtes, fikseeriti kui 1. n: analüüsitud loomade arv.

KSL24

Mõlema ensüümi mitokondriaalse valgu kogused olid sarnased vanuse ja CR-i mõjudega. Täpsemalt, OGG1 ja APE1 ei näidanud statistiliselt olulist vanusega seotud muutust nii AL kui ka CR rühmas, mis viitab vanuselisele mõju puudumisele. Ootamatult ei avaldanud ka CR olulist mõju OGG1 ja APE1 kogustele CR-28 rühmas, võrreldes vastava vanusega AL loomadega, samuti 32-kuuste rühmade vahel.

2.3. Vanuse ja CR mõju hindamine mitokondriaalsele dünaamikale

Olles eelnevalt teatanud märkimisväärsest vanusemõjust fusioonis (MFN2) ja lõhustumises (DRP1) osalevate valkude ekspressioonile [16], hindasime siin CR mõju nendele markeritele pika aja jooksul. Seetõttu määrati kõigist rotirühmadest eraldatud maksa mitokondrites Western blot katsetega MFN2 ja DRP1 valgukogused (joonis 5).

Joonis 5. MFN2 ja DRP1 valkude kogused isoleeritud maksa mitokondrites AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 ja CR-32- kuust - vanad rotid. (A). Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast. Ülevalt alla tähistavad immunoreaktiivsed ribad vastavalt MFN2 ja VDAC signaale. Histogramm näitab MFN2 ribade intensiivsuse kvantifitseerimist, mis on normaliseeritud VDAC intensiivsusega.(B). Sissejuhatuses viidi läbi representatiivne Western blot ühe rotiga igast analüüsitud rühmast. Immunoreaktiivsed ribad ülalt alla tähistavad vastavalt DRP1 ja VDAC signaale. Histogramm näitab DRP1 ribade intensiivsuse kvantifitseerimist, mis on normaliseeritud VDAC intensiivsusega. (A, B) Andmed esindavad kolmekordse Western blot katse tulemusi ja neid analüüsiti ühesuunalise ANOVA testi ja Tukey mitmekordse võrdlustesti abil. Tulbad tähistavad viie katserühma keskmisi väärtusi ja SD-d. Andmed normaliseeriti AL-18 rottide väärtuse suhtes, fikseeritud väärtusega 1. *p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

Leidsime AL-28 rottidel MFN2 statistiliselt olulise vanusega seotud languse (-43 protsenti) võrreldes AL-18 kontrollidega. Sellist langust hoiti ära AL-32 rottidel, kellel ilmnes keeruline vanuseefekt, mis sarnanes Cyt c puhul kirjeldatule. Erinevalt Cyt c-st avaldas CR aga väga positiivset mõju 28-kuuste loomadele, hoides ära CR-28 rottidel vanusega seotud AL-28 loomade arvu vähenemise ja mille tulemuseks on MFN2 märkimisväärne märkimisväärne tõus (pluss 52 protsenti) võrreldes AL-i vanuselise vastega. Lisaks ei erinenud MFN2 kogus CR-28 rottidel AL-18 kontrollide väärtusest, mis näitab vanusega seotud mõju tõhusat ennetamist. AL-32 ja CR-32 rühmade vahel olulist erinevust ei leitud, mis näitab CR piiratud mõju vanimatele loomadele. Lisaks ei leitud AL-32 rühmas MFN2 vanusega seotud mõju võrreldes AL-18 vastega. Samamoodi näitas DRP1 valgu kogus märgatavat vanusega seotud langust (-49 protsenti) AL-28 rottidel võrreldes AL-18 rühmaga, mida CR takistas {{29 }}kuused loomad. Tõepoolest, CR-28 rühm näitas positiivset erinevust (pluss 50 protsenti) võrreldes AL-28 rühmaga, mis näitab tugevat CR-efekti. Kuid erinevuse puudumine AL-32 ja CR-32 vahel, nagu DRP1 valgu kogustes, näitas veelgi CR piiratud efektiivsust pikendatud vananemise korral. Jällegi ei ilmnenud selget vanuseefekti ka DRP1 koguste puhul, mis läksid AL-18 rühmast AL-32 rühma. Seejärel määrasime iga uuritud roti fusiooniindeksi väärtused (FI kui MFN2 / DRP1 suhe (joonis 6).

AL{{0}} rühma FI väärtused hõlmasid kitsast vahemikku 1,37 kuni 2,64, samas kui AL-28 rühmas olid kõik väärtused kõrgemad vahemikus 2,20 kuni 8,24 . CR{{10}} rühma FI väärtused jäid vahemikku 0,99 kuni 5,14 ja olid üsna sarnased AL-18 rottide omadega. AL-32 loomadel jäid FI väärtused vahemikku 0,70 kuni 2,27, hõlmates seega AL-18 rühmaga sarnase intervalli, mis viitab märgatava vanuseefekti puudumisele. CR-32 rühmas jäid FI väärtused vahemikku 0,87 kuni 2,02 ja olid võrreldavad AL-32 loomade omadega, toetades seega ideed, et pikendatud vananemine (32 kuud) võib olla CR suhtes vähem tundlik. kui vananemine (28 kuud).

Kõigi rühmade FI väärtuste statistiline analüüs on toodud joonisel 7. AL-18 ja AL-28 rühmade võrdluses näitas viimaste kõrgem FI väärtus vanusega seotud muutust. dünaamiline tasakaal. Mis puudutab CR-ravi saanud rotte, siis CR-28 rühma väärtus ei erinenud AL-18 vastavast rühmast ja toetas dieedi efektiivsust võrreldes sama vanusega AL-toidetud rottidega. . FI AL-32 ja CR-32 väärtuste analüüsimisel ilmnes nende vahel olulise erinevuse puudumine, mis kinnitas ideed toitumise vähenenud efektiivsusest loomadel, kes saavutavad loomulikult pikema vananemise. Lisaks ei erinenud mõlema 32-kuuse rühma FI väärtused AL-18 vastest, mis kinnitab, et vanimatel loomadel ei olnud märgatavat vanuseefekti.