Diabeetiliste ja mittediabeetiliste vereplasma ja neerukoe graanulite termilise lagunemise gaasiproduktide terahertsi kõrge eraldusvõimega spektroskoopia
Mar 28, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstraktne
Tähtsus:Üks kaasaegseid meditsiinidiagnostika suundumusi põhineb metaboolikal, mis võimaldab määrata metaboliite, mis võivad olla haiguse spetsiifilised tunnused. Kõrglahutusega gaasispektroskoopia võimaldab uurida bioloogilist päritolu proovide gaasi metaboliitide sisaldust. Tutvustame terahertsi (THz) kõrglahutusega spektroskoopia abil graanulitena valmistatud diabeetiliste ja mittediabeetiliste bioloogiliste proovide uurimise meetodi väljatöötamist.
Eesmärk:Töö põhiidee on uurida diabeetiliste ja mittediabeetiliste kuivatatud toodete termilise lagunemise gaaside sisaldust.vereplasmajaneerukudeddiabeeti iseloomustavate gaasimarkerite komplekti paljastamiseks THz kõrge eraldusvõimega spektroskoopia meetodil.
Lähenemisviis:Tutvustame lähenemisviisi diabeetikute ja mittediabeetikute uurimiseksvereplasma(inimene ja rotid) janeerukuded(rotid), kasutades kõrglahutusega spektroskoopiat, mis põhineb THz sagedusvahemiku mittestatsionaarsel mõjul. Töötati välja meetodid vere- ja neerukoeproovide valmistamiseks pelletitena ning proovide aurustamiseks.
Tulemused:Aurude pöörlemise neeldumisspektrite mõõtmised verest valmistatud graanulite kuumutamisel janeerukudeviidi läbi sagedusvahemikus 118–178 GHz. Tuvastati ja identifitseeriti prooviaurude spektris esinevad neeldumisjooned. Termilise lagunemise saaduste molekulaarne sisaldus erines mittediabeetiliste ja diabeetiliste proovide puhul; nt peamine marker on atsetoon, mis ilmub diabeetikute veres (inimestel ja rottidel) ja diabeetikutel.neerukude.
Järeldused: Meie artikkel illustreerib potentsiaalset võimet määrata bioloogiliste proovide metaboliitide sisaldust diagnostiliseks ja haiguste prognoosimiseks kliinilise meditsiini jaoks. © Autorid. Avaldanud SPIE Creative Commonsi omistamise 4. all.0 Portimata litsents. Selle teose täielik või osaline levitamine või reprodutseerimine nõuab originaalväljaande täielikku omistamist, sealhulgas selle DOI-d. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Märksõnad: kõrglahutusega teraherts-spektroskoopia; termiline lagunemine; pabertaskurätik;vereplasma; diabeet; lüofiliseerimine.
Märksõnad:kõrge eraldusvõimega teraherts-spektroskoopia; termiline lagunemine; vereplasma; diabeet; lüofiliseerimine, neerukude.
1. Sissejuhatus
Tänapäeval on ühiskonnas oluliste haiguste (diabeet, vähihaigused jm), sealhulgas varajases staadiumis diagnoosimise probleem pälvinud maailmas teadusrühmade suurt tähelepanu.Üks uutest lähenemisviisidest, mis avab uusi võimalusi erinevate haiguste diagnostikas ja ravis, on metaboloomika. Ainevahetus on teadusvaldkond, mis uurib bioloogilise süsteemi (raku, elundite või kogu organismi) lõpp- ja vaheprodukte. Metaboloomika võib paljastada metaboliidid, mis võivad olla haiguse spetsiifilised tunnused ja võivad mängida suurt rolli haiguse diagnoosimisel ja prognoosimisel. Inimorganismi ainevahetuse lõpp- ja vaheprodukte sisaldavad ning haiguste ja patoloogiatega seotud metaboliitide väljaselgitamiseks kasulikud ained on väljahingatav hingeõhk, veri, uriin, sülg jne.
Üks sotsiaalselt olulisi inimeste elukvaliteeti ohustavaid haigusi on diabeet. II tüüpi suhkurtõbi oli varem keskealine haigus, kuid nüüd diagnoositakse seda täiskasvanutel, noortel ja lastel. 18-aastaste diabeedihaigete ja 1–13-aastaste laste vere- ja uriiniproovide metaboolsete uuringute tulemused on esitatud inimese ainevahetuse andmebaasis (HMDB).1 Peamiselt veri (21 keemilist ainet, sealhulgas isomeerid), uriin ( Uuriti 30 keemilist ainet, sealhulgas isomeerid) ja tserebrospinaalvedelikku (1 keemiline aine). Näiteks (R)-3-hüdroksüvõihapet tuvastati kõigis kolmes vedelikutüübis. Mõned ained (atsetoäädikhape, D-fruktoos ja D-glükoos) tuvastati mõlemas vedelikus (veres ja uriinis). Diabeedile iseloomulikum tunnus (atsetoon, CH3COCH3) esines ainult uriinis. Vedelikuproove, HMDB-s esitatud uuringute tulemusi, on uuritud erinevate meetoditega - gaasikromatograafia; 2 gaasikromatograafia massispektromeetriaga; 3,4 gaas-vedelik kromatograafia massispektromeetriaga; 5 kõrglahutusega tuumaspektroskoopia prootoni magnetresonants;6 ja meetodid, mis kasutavad diabeedipatsiendi seisundi jälgimiseks spetsiaalseid seadmeid, glükoosi pideva jälgimise süsteemi.
Kroonilise neeruhaiguse tekkimine on suhkurtõve peamine tüsistus. Kuigi glükeeritud albumiini määramine on sõeluuringu tavaline lähenemisviis, võib neerukahjustus alata kaua enne kliiniliselt oluliste muutuste ilmnemist uriini albumiinisisalduses. Arvestades kroonilise neeruhaiguse multifaktoriaalset patogeneesi, on selle skriinimisel arvesse võetud erinevaid markereid.8,9 Nende diagnostiline väärtus ilma neerubiopsiata näis aga kahtlane.
Spekroskoopiline lähenemine võib anda teavet bioloogiliste proovide sisu kohta, mida saab kasutada meditsiinilises diagnostikas. Terahertsi (THz) sagedusvahemik on elusorganismide gaaside, vedelike ja kudede uurimisel väga oluline. Mõned ülevaated on pühendatud THz sagedusvahemiku meetodite rakendustele, sealhulgas THz aeg-domeeni spektroskoopia, THz reflektomeetria ja THz pildistamine bioloogias ja meditsiinis.10
THz aeg-domeeni spektroskoopia võimaldab tuvastada spektreid, kus neeldumistegur või murdumisnäitaja omavad mõningaid spektraalseid tunnuseid, mis vastavad mõne biomolekuli (valgud, suhkrud jne) olemasolule proovides või nende erinevatele kontsentratsioonidele.11
Molekulaarneeldumisspektroskoopia ja eriti THz gaasispektroskoopia on väga paljutõotav lähenemisviis erineva päritoluga mitmekomponentsete gaasisegude uurimisel.12 Vedelas ja tahkes olekus olevaid proove saab uurida aurustamise või termilise lagunemise teel. Ühiskondlikult oluliste haiguste (diabeet, vähk jne) metaboliidid-markerid saab paljastada selle spektrijoonte järgi kiirguse ülekandmisel läbi gaasiproovide tehtud neeldumisspektrites.
Atsetooni taset diabeedihaigetelt (12 inimest) võetud väljahingatava hingeõhu ja uriini proovides mõõdeti terahertsi vahemiku spektromeetriga koos toimiva kiirguse faasinihke võtmega. Katsed viidi läbi koostöös Almazovi riikliku meditsiiniuuringute keskusega. Mõõtmised viidi läbi atsetooni neeldumisliinidel kesksagedustega 150,537 ja 151,647 GHz. Mõõtmised viidi läbi ilma kuumutamiseta. Diabeedihaigete väljahingatava hingeõhu ja uriini proovide samaaegsel analüüsil selgus, et atsetooni tase uriinis oli palju kõrgem kui väljahingatavas, mõnel juhul suurusjärgu võrra kõrgem.13,14
THz kõrge eraldusvõimega gaasispektroskoopia uuringute tulemusedvereplasmapatsientide ja rottide (tinglikult terved ja diabeediga) ning rottide omadneerukude(terved ja diabeediga) kuivatatud ja graanuliteks pressitud. Kudede võivereplasmaelusorganismidest ilma ettevalmistuseta tuleb uurida kohe pärast proovide võtmist. Graanulitena valmistamine võimaldab uurida piisavalt pikka aega pärast vereproovi võtmist või neerubiopsiat.
2 Katsed ja metoodika
2.1 Vereplasma graanulite ja neerugraanulite valmistamise meetod
II tüüpi suhkurtõvega patsientide ja tinglikult tervete osalejate veeniveri koguti Almazovi riikliku meditsiiniuuringute keskuse endokrinoloogia osakonnas; keskus pakub arstiabi diabeedihaigetele. Kolm patsienti ja kaks osalejat olid meessoost, sama vanusega (39–43-aastased). Kõik selles uuringus kasutatud katseprotokollid vaatasid läbi ja kiitsid heaks patsiendid ja osalejad ning meditsiinikeskuse kasutuskomisjon. Venoosne veri koguti hommikul pärast 8–12-tunnist tühja kõhuga tuubi koos antikoagulandiga K3EDTA (Vacutest Kima, Itaalia). Plasma saadi biokeemiliste parameetrite analüüsimiseks, tsentrifuugides täisverd kiirusel 3000 p/min 15 minutit laboratoorses tsentrifuugis (Eppendorf 5702R, Saksamaa) temperatuuril þ4 kraadi. Biokeemiliste parameetrite väärtusedvereplasmaproovid ja võrdlusintervallid on esitatud tabelis 1 (glükeeritud hemoglobiini tase saadi täisveres). Tabel 1 näitab, et glükoosi, triglütseriidide ja glükeeritud hemoglobiini kontsentratsioon diabeedihaigete proovides suureneb vastavalt 1,5, 2 ja 2,3 korda.
Uuring viidi läbi ka 8 nädala vanuste ja 180–200 g kaaluvate Wistari isaste rottidega vastavalt eksperimentaalmeditsiini instituudi Almazovi riikliku meditsiiniuuringute keskuse loomade hooldamise ja kasutamise komisjoni poolt heaks kiidetud eksperimentaalsete uuringute protokollile. Glükoositase katserühma loomadel oli 21 mmol ∕ l pärast 120 minutit pärast glükoosi laadimist. Kontrollrühmana kasutati terveid rotte. Enne loomade surmamist koguti veeniverd alumisest õõnesveenist. Samuti koristati neer. Vereproovid koguti antikoagulanti sisaldavatesse tuubidesse.
Katseproovid külmutati temperatuuril –80 kraadi (madala temperatuuriga külmik DW-86L388A, Haier, Hiina). Seejärel lüofiliseeriti see külmkuivatamisega Vaco 2 (ZirBus, Saksamaa) temperatuuril –50 kraadi ja rõhul 3 Pa. Külmutamine viiakse läbi enne lüofiliseerimist, kuna lüofiliseerimisel kõrge siserõhu mõjul võivad bioloogilised komponendid hävitada. Kuivatatud proovid olid bioloogilistest kristallidest koosnev käsn. Käsn hävitati metallist spaatliga ja purustati mitmekümne mikromeetri suurusteks kristallideks. Mördi ja nuia kasutamine oli võimatu, kuna proovide koostises olevate valkude jahvatamine tooks kaasa nende soovimatu adhesiooni ja ümarate graanulite moodustumise.
Lüofiliseeritud proovide pulber kaaluti (analüütiline kaal OHAUS Discovery, Šveits) ja asetati seejärel teraspressitud vormi. Kasutades teatud vormirõhul laboripresse (Angkor, Venemaa ja Specac, Ühendkuningriik)vereplasmasaadi graanulid ja neerugraanulid. Iga graanulite kristall sisaldab teatud protsenti rasvu (triglütseriide), valke (albumiini) ja fibrinogeeni – kõik need on normaalsed või glükeeritud (diabeedi puhul). Kontrollrühma proovide pelleteid nimetatakse edaspidi "mittediabeetilisteks pelletiteks" ja proovide pelleteidDiabeedirühmale viidatakse edaspidi kui "diabeetilisele pelletile".
2,2 THz kõrge eraldusvõimega spektroskoopia eksperimentaalne seadistus
Mittestatsionaarsetel efektidel põhinev kõrglahutusega THz spektroskoopia võimaldab analüüsida gaasi ja auru mitmekomponentsete gaasisegude komponentide koostist. Spektromeetrid tagavad teoreetilise piiri lähedase tundlikkuse, mille eraldusvõime on piiratud ainult Doppleri efektiga ja suudavad salvestada kiireid protsesse. Tundlikkus säilib isegi gaasirõhu olulisel langusel ja on skaneerimisrežiimis mõnede gaaside puhul ligikaudu 0,2 ppb (nt ammoniaak neeldumisjoone mõõtmisel sageduse 572 GHz lähedal). Lisaks võimaldab see suure usaldusväärsusega määrata gaasisegu komponentide koostist.12 Pelletite termilise laguproduktide uuring viidi läbi THz mittestatsionaarse gaasispektroskoopia meetodil 118 kuni 178 GHz vahemikus. Spektromeeter kasutab faasiluku ahelat tagurpidi lainelambi sageduse ja faasinihke automaatseks juhtimiseks, registreerimiseks ajadomeenis, keskmistamiseks ja spektroskoopilise üleminekusignaali töötlemiseks. Seade registreerib signaali aja domeenis. Proovide auru analüüsiti järgmise protseduuri abil. Pelletid asetati katseklaasi, kasutades vaakumpumbaga, järk-järgult kuumutatud katseklaasi (kuni 240 kraadini) ja saadud proovi termilise lagunemise saaduste segu lasti mõõtekambrisse. Andmefail sisaldab tavaliselt spektromeetri valitud või kogu tööpiirkonna salvestusi. Seetõttu saab aineid identifitseerida proovi koguspektris esinevate neeldumisjoonte järgi ja segu kontsentratsioonide dünaamikat saab jälgida mitme andmefaili võrdlemise teel. Ained tuvastati otsides neid avatud lähtekoodiga MW, mmw ja THz andmebaasidest.15,16
3 Vereplasma aurude ja neeruaurude analüüs kõrge eraldusvõimega terahertsi spektromeetriga
Meie THz-TDS süsteemidega mõõtsime graanulite ülekannet spektrivahemikus 0,2 kuni 1,4 THz,17 kuid teame, et biomolekulidel ja eriti selle gaasilises olekus lagunemissaadustel on informatiivne reaktsioon (pöörlemisneeldumine). spektrid) nendel ja ka madalamatel sagedustel, seega teostasime täiendava uuringu THz kõrge eraldusvõimega gaasispektromeetriga. Diabeediga inimestel tuvastatud ainete neeldumisjoonedvereplasmalangevad kokku mittediabeetiliste inimeste ainetegavereplasma, välja arvatud atsetoon. Spektromeetri töösagedusalas (118–178 GHz) on palju atsetooni neeldumisjooni. Tavaliselt piisab ühe aine mingi neeldumisjoone tuvastamisest aine olemasolu ühemõtteliseks määramiseks mitmekomponendilises gaasisegus. Näide neeldumisspektri osade registreerimisest atsetooni absorptsioonijoonega on näidatud joonisel 1. Atsetoon võib verre ilmuda süsivesikute ainevahetuse häire korral. Nagu kirjanduses märgitud, sisaldas diabeedihaigete veri -OH-butüraati ja atsetoatsetaati, kuid hiljem lagunesid need ained atsetooniks ja süsihappegaasiks.18 Süsinikdioksiidil puudub dipoolmoment; seetõttu pole sellel pöörlevaid üleminekuid. Selle suurenenud sisaldust saab tuvastada ainult proovi võnkespektri uurimisel IR-vahemikus.
Plasma auruaineid, nagu karbonüülsulfiid (OCS), vääveldioksiid (SO2), sipelghape (HCOOH), isotsüaanhape (HNCO) ja ammoniaak (NH3), tuvastati nii diabeetikute kui ka mittediabeetiliste inimeste proovides. Mõnel juhul on proovi spektrites tuvastatud üks katsejoon, mis vastab rohkematele joontele kui ühele ainele (nt isotsüaanhape) kataloogiandmetes (vt tabel 2).15,16
Seda seletatakse asjaoluga, et kataloogid sisaldavad andmeid ainete ülipeente struktuuride kohta, mida selles katses ei lahendata, kuna joonte laius on mitusada kHz suurusjärgus. Saadud uuritud ainete neeldumisjooned langevad kokku kapillaarvere aurude neeldumisspektriga javereplasmaDiabeedihaigete ja tinglikult tervete osalejate kohta, mis on avaldatud meie eelmises töös.19 Avastatud gaasilised ained võisid tekkida proovi ettevalmistamisel aminohapete keemilise muundamise saadusena. Küsimus, kas need ühendid on diagnostilise väärtusega, nõuab uurimist. Diabeetoloogia kliinilises praktikas nende ainete sisalduse analüüsi veel ei kasutata.
Aurudvereplasmatervetest rottidest sisaldasid karbonüülsulfiidi (OCS), metaantiooli (CH3SH), butüronitriili (C3H7CN), atseetaldehüüdi (CH3CHO) ja sipelghapet (HCOOH). Näidisvereplasmadiabeetiliste rottide puhul erines atsetooni olemasolu. Lisaks propionitriili (C2H5CN) absorptsioonijoontele tuvastati metüülformiaat (CH3OCHO).
Tervete ja diabeetiliste rottide kuivatatud graanulite auruproovidneerukudeduuriti. Aurudneerukudetervetest rottidest sisaldavad karbonüülsulfiidi (OCS), vääveldioksiidi (SO2), sipelghapet (HCOOH), isotsüaanhapet (HNCO), etüülformiaati (C2H5OCHO) ja propüleenglükooli (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Diabeediga roti aurusisaldusneerukudeerines tervest rotist mitte ainult karbonüülsulfiidi (OCS), vaid ka selle isotopoloogi OCS-34 olemasolu poolest. Atsetaldehüüdi (CH3CHO), metaantiooli (CH3SH), etüleensulfiidi (C2H4S), metanooli (CH3OH) ja glükoaldehüüdi (CH2ðOHÞCHO) tuvastati ka diabeetilise roti pelleti aurudes.neerukude(vt. joon. 2 ja joon. 3).
Väävliühendite, nagu metaantiool, olemasolu võib täpsustada väävli aminohapete (metioniin, tsüsteiin ja tsüstiin) termilise lagunemisega verevalgu koostises. Metioniin on asendamatu aminohape, mida inimorganismis ei sünteesita. Seda saadakse toidust ja see on väävliallikas tsüsteiini biosünteesi jaoks. Kui väävli aminohappeid kuumutati temperatuurini umbes 240 kraadi, tuvastati nende ainete massispektris metaantiool ja etüleensulfiid (metioniini lagunemine).
4. Järeldus
Inimese ja roti molekulaarne sisaldusvereplasmaja rottneerukudeproovide termilise lagunemise ajal uuriti THz kõrge eraldusvõimega spektromeetriga. Esitati bioloogiliste proovide graanuliteks valmistamise meetod. See meetod annab võimaluse proove säilitada ja transportida. Kõrge eraldusvõimega gaasispektroskoopia võimaldab määrata mis tahes päritoluga, sealhulgas bioloogiliste, mitmekomponentsete gaasisegude sisaldust koos gaasikomponentide jälgi. Diabeedihaigetel avastati atsetoonvereplasmaproovid. Teave diabeetiku ja terve sisu erinevuse kohtavereplasmameeste ja rottide ning diabeetikute ja tervete rottide seasneerukudedsaadi aurude neeldumispöörlemisspektritest. THz kõrge eraldusvõimega spektroskoopia kasutamine võimaldab kvalitatiivselt analüüsida vereaurude ja proovide komponentide sisaldust.neerukudedgraanulid. Võimalus teostada oluliste diabeedigaasimarkerite kontsentratsioonide kvantitatiivset hindamist sõltuvalt patsiendi seisundist.tuleks edasiste uuringute käigus uurida.
