Abstrtegutsema

Taust: Üha enam uuringuid on teatatud mesenhümaalsete tüvirakkude (MSC) pärinevate eksosoomide terapeutilisest toimest, mille abil iseloomustatakse valku ja miRNA-d. Inimese embrüonaalsetest tüvirakkudest (hESC) ja inimese indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest (hiPSC) pärinevate eksosoomide proteoomika ja miRNA profiilid jäävad siiski ebaselgeks.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja eemaldada reaktiivseid hapniku liike, takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist ning samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake valikul Vananemisvastane Cistanche Powder Bulk

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

meetodid: Selles uuringus eraldasime eksosoomid hESC-dest, hiPSC-dest ja inimese nabanööri mesenhümaalsetest tüvirakkudest (hUC-MSC) klassikalise ultratsentrifuugimise ja 0.22-μm filtriga, millele järgnes konservatiivne tuvastamine. Tandem-massmärgise märgistamine ja sildivaba suhtelise peptiidi kvantifitseerimine määrasid koos nende proteoomika. MiRNA profiilide määramiseks viidi läbi suure läbilaskevõimega sekveneerimine. Seejärel viisime läbi bioinformaatika analüüsi, et tuvastada domineerivad bioloogilised protsessid ja rajad, mida moduleerivad eksosoomiveosed. Lõpuks viidi läbi Western blot ja RT-qPCR, et tuvastada valkude ja miRNA-de tegelik koormus kolme tüüpi eksosoomides.

Tulemused: Meie uuringu põhjal aitavad kolme tüüpi eksosoomidest pärit lastid kaasa keerukatele bioloogilistele protsessidele. Võrdluseks, hESC eksosoomid (hESC-Exos) olid paremad arengu, ainevahetuse ja vananemisvastase reguleerimise osas ning hiPSC eksosoomid (hiPSC-Exos) omasid sarnaseid bioloogilisi funktsioone kui hESC-Exos, samas kui hUC-MSC-de eksosoomid (hUC-MSC-Exos) aitas rohkem kaasa immuunregulatsioonile.

Järeldused: Meie uuringus esitatud andmed aitavad määratleda kolme eksosoomi valgu- ja miRNA-maastikke, ennustada nende bioloogilisi funktsioone süstemaatilise ja põhjaliku võrguanalüüsi kaudu süsteemi tasandil ning paljastada nende potentsiaalsed rakendused erinevates valdkondades, et optimeerida eksosoomide valikut prekliinilises ja kliinilises. katsumused.

Märksõnad: inimese embrüonaalsed tüvirakud, inimese poolt indutseeritud pluripotentsed tüvirakud, inimese nabanööri mesenhümaalsed tüvirakud, eksosoomid, proteoomika, miRNA

Sissejuhatus

Ekstratsellulaarsed vesiikulid (EV) on väikesed vesiikulid, mida rakud aktiivselt sekreteerivad ja mis sisaldavad peamiselt eksosoome, mikrovesiikuleid (MV) ja apoptootilisi kehasid [40, 56, 57]. Need on laialdaselt jaotunud paljudes kehavedelikes, nagu sülg, rinnapiim, veri, tserebrospinaalvedelik, sapp ja uriin [57]. Nende hulgas on eksosoomidel lipiidide kaksikkiht läbimõõduga 40–200 nm, ujuvustihedus 1,13–1,18 g/ml sahharoosigradiendis ja elektronmikroskoobi all tassikujuline välimus [21, 53]. Erinevad bioaktiivsed ühendid, sealhulgas valgud, nukleiinhapped ja lipiidid, tagavad rakkudevahelise eksosoomidevahelise kommunikatsioonifunktsiooni [16, 17]. Lipiidide kaksikkiht on õrn barjäär, mis kaitseb eksosoomide sisu kehavedeliku ensümaatilise degeneratsiooni eest [49]. Stabiilsed eksosoomid võivad parakriinse aktiivsuse kaudu vahendada keerulisi füsioloogilisi ja patoloogilisi protsesse, sealhulgas elundite ja reproduktiivset arengut, antigeeni esitlust, neuronaalset suhtlust, immuunvastust, vananemise reguleerimist ja rakkude proliferatsiooni [57, 62].

Eksosoomide moodustumine ja vabanemine on täielikult reguleeritud protsess ning eksosoomidesse kapseldatud sisu sorteerimine toimub erinevate valkude mobiliseerimise teel [22, 47]. Eksosoomide moodustumisel on üliolulised mitmed valgud, mis sisaldavad transpordiks vajalikku endosomaalset sorteerimiskompleksi (ESCRT), tetraspaniine (CD9, CD63 ja CD81), apoptoosiga seotud geeniga 2-interakteeruvat valku X (Alix) ja kasvaja vastuvõtlikkust. geen 101 (TSG101) [38, 55]. Eksosoomide rakusisest kaubitsemist juhib mitmete valkude kollektiivne aktiivsus, sealhulgas molekulaarse lüliti RAB GTPaasid ja tsütoskeleti valgud, nagu aktiin ja tubuliin [24]. Seejärel täiendavad eksosoomide sekretsiooni SNARE kompleks ja sünaptotagmiinide perekond [22]. Uuringud on kindlaks teinud, et eksosoomide tärkamine ja eraldumine sõltuvad kaltsiumi aktiivsusest ja ESCRT värbamisest [15]. Sõnumitoojana osaleb eksosoomide vabanemine rakkude läbirääkimises vastusena raku füsioloogiale ja patoloogilistele muutustele, nagu aktiveerimine, pH muutus, hüpoksia, kiirguskahjustus või rakustress [61].

Eksosoomide komponentide ning nende võimalike füsioloogiliste ja patoloogiliste funktsioonide avastamiseks kasutatakse erinevatest liikidest, kudedest ja rakkudest pärinevate eksosoomide RNA-de ja valkude uurimiseks sageli proteoomilisi, transkriptoomilisi ja muid tehnikaid [44]. Eksosoomi proteoomika analüüs hõlmab tavaliselt kolme etappi: eksosoomide eraldamine, puhastamine ja iseloomustamine, valgukomponentide tuvastamine massispektromeetria abil ja algandmete analüüs [14]. Raku olek mõjutab oluliselt valgu koostist ja eksosoomide arvukust. Praegu kasutatakse valkude iseloomustuse ja arvukuse analüüsimiseks kvantitatiivseid proteoomilisi meetodeid, et selgitada välja eksosoomide tootmise aluseks olev mehhanism ja süvendada meie arusaamist eksosoomide füsioloogilistest ja patoloogilistest rollidest rakkudes [39]. Nende hulgas kasutatakse laialdaselt massispektromeetriapõhiseid kvantitatiivse proteoomika tehnoloogiaid, sealhulgas peamiselt märgisevabasid ja stabiilseid isotoopmärgistatud meetodeid [13, 42]. miRNA-d on väikesed bioaktiivsed molekulid, mis on tihedalt seotud erinevate elutegevustega. Suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnikat iseloomustab kõrge tundlikkus ja täpsus ning seda kasutatakse laialdaselt miRNA sekveneerimisel (18–30 nt) [6]. Arvestades praeguse tehnoloogia arengut, pole eksosoomide valgu- ja miRNA profiilide lahkamisel takistusi.

HESC-del ja hiPSC-del on suur diferentseerumispotentsiaal [36]. Nende otsene kasutamine ravis on aga pahaloomuliste kasvajate ohu ja eetiliste probleemide tõttu piiratud [31]. Seevastu mesenhümaalsetel tüvirakkudel (MSC) on kliinilises keskkonnas mitme haiguse sekkumiseks laiem rakendus [8]. Kuid nende otsesel kasutamisel on endiselt mitmeid piiranguid, sealhulgas madal elulemus, immunoloogiline äratõukereaktsioon ja ohutusprobleemid [8, 43]. Praegu on eksosoomidele palju tähelepanu pööratud nende bioohutuse, stabiilsuse, mitteaneuploidsuse ja madala immunogeensuse tõttu [51]. Varasemad uuringud on dokumenteerinud erinevatest kudedest pärinevate MSC-de ja nende proteoomilisi ja miRNA profiile sisaldavate eksosoomide komponentide võrdlust [59]. Gong et al. kujutas ka hESC ekstratsellulaarsete vesiikulite (EV) regulatiivset võrgustikku proteoomi osas, kuid ainult vananemisega seotud radadel, keskendumata teistele [19]. Questa et al. lõi inimese eesnaha fibroblastidest (HFF) pärinevate hiPSC-de EV proteoomilise atlase [45]. Kuigi need uuringud on osaliselt teatanud EV-de valgukomponentidest, ei keskendunud nad ainult eksosoomidele ja nende põhjalik proteoomiline analüüs ei ole selgelt sõnastatud. Eelkõige pole miRNA profiile veel kirjeldatud. Selle lahendamiseks valiti käesolevas uuringus hESC-dest, hiPSC-dest ja hUC-MSC-dest eraldatud eksosoomid edasiseks uurimiseks, mis oli suunatud nende proteoomi- ja miRNA-profiilidele, et saada uudseid teadmisi nende uurimistöö ja kliinilise rakenduse kohta.

meetodid

Eksosoomide valmistamine ja iseloomustamine

hESC-sid ja hiPSC-sid kultiveeriti ncTarget söötmes (kat. nr RP01020; Nuwacell. Ltd, Hiina), samas kui 3. põlvkonna hUC-MSC-sid kultiveeriti seerumivabas hMSC söötmes (kat. nr. RP02010; Nuwacell. Ltd, Hiina). Järgmisena koguti eksosoomide puhastamiseks 350 ml logaritmilise kasvufaasi rakkude supernatanti (ligikaudu 80 protsenti konfluentsust). Eksosoomid ekstraheeriti tunnustatud tsentrifuugimise ja ultratsentrifuugimise seeriaga, nagu eelnevalt kirjeldatud [34, 52]. Lühidalt, konditsioneeritud sööde (CM) koguti ja tsentrifuugiti gradiendiga (300 × g 10 minutit, 2000 × g 15 minutit, 10, 000 × g 30 minutit), et eraldada. rakujäätmed. Eksosoomid pelleteeriti kogutud supernatantidest temperatuuril 100, 000 × g 70 minutit, kasutades Ti45 rootorit (Beckman Coulter, USA). Seejärel resuspendeeriti need PBS-is järgmiseks filtreerimiseks, kasutades 022-μm MF-Millipore™ membraanfiltrit (Sigma, USA). Filtraati ultratsentrifuugiti kiirusel 100 000 x g 70 minutit. Lõplik eksosoomi pellet resuspendeeriti järgmiseks analüüsiks PBS-is. Eraldatud eksosoomide kontsentratsiooni ja suuruse mõõtmiseks kasutati dünaamilise valguse hajumise (DLS) süsteemi (Wyatt Technology, USA).

Transmissioonelektronmikroskoopia (TEM)

TEM-skaneerimine viidi läbi, et kirjeldada eraldatud eksosoomide morfoloogiat, nagu eelnevalt kirjeldatud. Resuspendeeritud eksosoomid (1 ug 10 ul PBS-s) istutati süsinikuga kaetud vaskvõrele (200- võrk) ja lasti sellel 2 minutit adsorbeeruda, millele järgnes kaks pesemist topeltdestilleeritud veega. Seejärel värviti võred 1 minuti jooksul negatiivselt 8 μL 2-protsendilise uranüülatsetaadi lahusega. Pärast loomulikku kuivatamist uuriti proove Tecnai Spirit süsteemiga (Thermo Fisher, USA) 120 kV juures.

Dünaamiline valguse hajumine

Eksosoomide suurusjaotust kirjeldati nanoosakeste jälgimise analüüsi abil, kasutades dünaamilist valguse hajumise mõõturit (Wyatt Technology, USA) vastavalt tootja juhistele (271-DPN), nagu varem teatatud[23]. Lühidalt, eksosoomi pellet resuspendeeriti 100 µl PBS-is. Kümme, 50 µl ülaltoodud eksosoome lisati 1450 µl PBS-ile ja segati 30 sekundit. Eksosoomid (1,5 ml) viidi 30 sekundiks 25 kraadi juures tasakaalustamiseks ühekordselt kasutatavasse küvetti. Dispergeeriva aine murdumisnäitaja väärtus oli 1, 37 ja nii Z-keskmine kui ka polüdisperssus (PDI) määrasid eksosoomiosakeste suuruse. Iga proovi jaoks tehti puust sõltumatud mõõtmised.

Tandem massimärgise (TMT) märgistamine ja märgisevaba suhtelise peptiidi kvantifitseerimise (LFQ) analüüs

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 ja P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 ja P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), samuti statistiline olulisus (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

miRNA profiili analüüs

Kogu RNA ekstraheeriti eraldatud eksosoomidest, kasutades mirVana™ miRNA isolatsioonikomplekti (kat. nr AM1560; Thermo Fisher, USA). RNA proovidega kontrolliti miRNA mikrokiibi testi kvaliteedikontrolli, mille viis läbi LC-Bio Technology Co., Ltd. Toorandmete analüüs viidi läbi nagu eelnevalt teatatud [9]. Diferentsiaalselt ekspresseeritud miRNA-d valiti kandidaat-miRNA-deks p-väärtusega<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) ja maksimaalne vaba energia<−10 (miRanda).

Bioinformaatika analüüs

Toorandmeid analüüsiti tarkvarapaketi Maxquant (v1.6.0) abil ja Swiss-Prot_Inimandmed määrati võrdlusaluseks (20 600 valku) (proteoomi ID: UP000005640) . Tuvastatud valgud kaardistati KOBAS-analüüsi [60] tingimuste põhjal geeniontoloogiasse (GO) ja Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeediasse (KEGG), et määrata nende bioloogilised ja funktsionaalsed omadused. Eksosoomivalkude või miRNA-de põimunud võrgustiku joonistamiseks signaaliradade vahele kasutati Cytoscape tarkvara ja R-tarkvara igraphi paketti (versioon 3.6.1).

Statistiline analüüs

Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Valkude ja miRNA-de kvantitatiivne korratavus tõsteti põhikomponentide analüüsi (PCA), suhtelise standardhälbe ja Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendi abil. Tulemusi analüüsiti paaritu Studenti t-testi abil. Andmed on väljendatud keskmise standardveana (SEM). P-väärtusi peeti statistiliselt olulisteks *P juures<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Tulemused

Eksosoomide isoleerimine ja tuvastamine

Kolme inimese pluripotentse tüviraku kasvatamist ja identifitseerimist kirjeldati täiendavas failis 1. Eksosoomid eraldati kolme tüüpi tüvirakkude konditsioneeritud söötmest (lisafail 1: joonis S1) ja identifitseeriti morfoloogia, osakeste suuruse, kontsentratsiooni, ja pinnamarkerid [19]. TEM näitas, et nendel eksosoomidel oli tassikujuline morfoloogia (joonis 1A) ja DLS näitas, et nende suurusjaotus oli 50–200 nm (joonis 1B). Western blot näitas, et eraldatud eksosoomid kandsid positiivseid markereid CD63, TSG101 ja HSP70, kuid mitte negatiivset markerit kalneksiini (joonis 1C). Igal hESC-l oli hiPSC-de omaga sarnane eksosoomi saagis ja mõlemad olid kõrgemad kui hUC-MSC-del (joonis 1D). Need tulemused näitavad, et tüüpilised eksosoomid olid peatatud, ilma kuju erinevusteta; Siiski leiti erinevusi kolme tüüpi tüvirakkudest eraldatud eksosoomide kontsentratsioonide vahel.

Jagatud ja pealtlaetud valkude bioinformaatika

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (märgistuseta test). Lõpuks valiti hESC-Exose, hiPSC-Exose ja hUC-MSC-Exose valguprofiilide analüüsimiseks vastavalt 554, 437 ja 911 seemet (lisafail 1: joonis S3A). Seejärel viidi nendele kandidaatidele jagatud valkude valimiseks läbi Venni diagrammi test (lisafail 1: joonis S3B). Bioinformaatika analüüs näitas, et 303 jagatud valku domineerisid nende signaaliradade regulatsioonis, sealhulgas aktiini tsütoskeleti, fokaalse adhesiooni, PI3K-AKT, süsiniku metabolismi jne reguleerimises (lisafail 1: joonis S3C). GO analüüs näitas ka, et jagatud valgud olid rikastatud ekstratsellulaarse eksosoomi, membraani, valku siduva ja rakuvälise piirkonnaga (lisafail 1: joonis S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (märgistuseta test) (joonis 2A). Nende tulemuste põhjal skriiniti hESC-Exos, hiPSC-Exos ja hUC-MSC-Exos vastavalt 163, 187 ja 451 valku (lisafail 1: joonis S3E). Seejärel kirjeldasime kolme tüüpi eksosoomide ekspressiooni arvukuse kõverat ja tuvastasime eksosoomides laetud valkude kümme parimat geenisümbolit (joonis 2B). ThKõrgelt koormatud valgud allutati KOBAS-i algoritmi alusel bioinformaatikale. Kolme tüüpi eksosoomide proteoomid olid kõik seotud keeruka signaalirada reguleeriva võrguga ja seejärel sorteeriti 20 parimat rada -log10 (P-väärtus) väärtuse põhjal (joonis 2C-E). Kõik proteoomid rikastati ekstratsellulaarse maatriksi (ECM)-retseptori interaktsiooni ja PI3K-AKT signaaliradadega. Valgu ja valgu interaktsiooni (PPI) analüüs näitas, et nii hESC-Exos kui ka hiPSC-Exos olid ülevalt laetud valgud.rikastatud rakutsükli ja metaboolse rajaga, samas kui hUC-MSC-Exos ülakoormusega valgud olid rikastatud immuunsuse reguleerimisega seotud radadega (joonis 2F-H).

Eksosoomi proteoomika paaripõhine võrdlus

Kahe eksosoomi proteoomi erinevuse hindamiseks koostasime Venni diagrammi, et tuvastada ainulaadsed ja kattuvad valku kodeerivad geeniklastrid. Jagatud valku kodeerivad geenid allutati seejärel vulkaani- ja soojuskaardi analüüsile ning GSEA-le ning erinevalt ekspresseeritud valgud filtreeriti P juures.<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Võrdlus hESC-Exose ja hUC-MSC- 1: joonis S4 D) näitas, et hESC-Exose ainulaadsed valku kodeerivad geeniklastrid olid peamiselt seotud EGFR-i, TGF-, rakutsükli, pluripotentsuse reguleerimise ja Wnt-ga. signaalimine (lisafail 1: joonis S4E). Seevastu hUC-MSC-Exose ainulaadsed klastrid olid rikastatud paljude immunoregulatsiooniga seotud signaaliradade, näiteks komplemendi süsteemi, põletiku reguleerimise ja mikroobse infektsiooniga (lisafail 1: joonis S4F). Kattuvad klastrid olid tugevalt rikastatud ECM-retseptori interaktsiooni, komplemendi ja hüübimiskaskaadide ning PI3K-AKT signaalide osas (joonis 3D). Vulkaani graafik kujutab erinevusi hESC-Exose ja hUC-MSC-Exose vahel (joonis 3E). Ülereguleeritud valgud hUC-MSC-Exos (klaster 1) olid peamiselt seotud komplemendi vastusega, loodusliku tapjarakkude aktiivsusega ning Rap1 ja PPAR signaaliülekandega. Seevastu hESC-Exos ülesreguleeritud valgud olid peamiselt seotud PI3K-AKT, MAPK ja AMPK signaaliülekandega (joonis 3F). GSEA kinnitas hiPSC-Exose suuremat regulatiivset võimet pluripotentsuse osas (lisafail 1: joonised S6A ja D) ja hESC-Exos immunoregulatsiooni, sealhulgas looduslike tapjarakkude poolt vahendatud tsütotoksilisuse osas (lisafail 1: joonised S6B ja E) ja COVID19-SARS-CoV2 reguleerimine (lisafail 1: joonised S6C ja F).

HiPSC-Exose ja hUC-MSC-Exose võrdlus (lisafail 1: joonis S4G) näitas, et ainulaadne hiPSCExose valku kodeeriv geenikomplekt oli märkimisväärselt seotud mittehomoloogse lõppliitumise, TGF- ja vitamiini B6 metabolismiga (täiendav fail 1: joon. S4H), samas kui hUC-MSC-Exos oli peamiselt seotud immunoregulatsiooniga seotud radadega (täiendav fail 1: joonis S4I). Nende kattuvad valgud osalesid ka ECM-retseptori interaktsioonide, komplemendi ja hüübimiskaskaadide ning PI3K-AKT signaaliülekande reguleerimises (joonis 3G). Vulkaani graafik kujutab erinevalt ekspresseeritud valke (joonis 3H). 1. klastri valgud soojuskaardil näitasid, et hUCMSC-Exos reguleeris peamiselt immuunvastust ja AMPK signaaliülekande rada, samas kui hiPSC-Exos reguleeris peamiselt rakutsüklit ning insuliini, jõehobu ja mTOR signaaliülekande radu (joonis 3 I). GSEA toetas veelgi hiPSC-Exo domineerivat rolli arenguprotsesside reguleerimisel (lisafail 1: joonised S7A ja D) ja pluripotentsuse säilitamisel (lisafail 1: joonised S7B ja E), samas kui hUC-MSC-Exod olid osalevad enamasti immunoregulatsiooni protsessis (lisafail 1: joonis S7C ja F).

Kattuvate proteoomide bioinformaatika

Järgmisena uurisime kolme eksosoomitüübi jagatud proteoome. Kokku tehti GO ja KEGG analüüsid 309 valku kodeeriva geeni (joonis 4A). Tulemused näitasid, et kolme eksosoomitüübi jagatud valku kodeerivad geenikomplektid olid peamiselt seotud rakuvälise aktiivsusega ja bioloogiliste protsessidega, sealhulgas rakuvalgu metaboolsed protsessid, signaali retseptori sidumine, ATP sidumine, NAD sidumine, haavade paranemine ja lipiidide metaboolsed protsessid (joonis 1). 4B). Samuti aitasid nad kaasa signaaliradade, nagu PI3K-AKT, glükolüüs/glükoneogenees, jõehobu, oksütotsiin, HIF-1, rakutsükkel ja AMPK rajad, keerukate reguleerivate võrgustike loomisele (joonis 4C). Nende proteoomiliste ja kanooniliste signaaliradade vahel olid keerulised regulatiivsed seosed (joonis 4D). Mulldiagramm näitab iga valguklastri erinevat arvukust kanoonilises signaaliülekanderajas. Kui hESC-Exodel ja hiPSC-Exodel võivad rakutsükli ja AMPK signaaliradade osas olla tugevamad regulatiivsed võimed kui hUC-MSC-Exosel, siis hUC-MSC-Exodel võib olla VEGF ja NF-κB signaaliradadele silmapaistev reguleeriv toime (täiendav fail 1: joonis S8).

Soojuskaardi analüüs näitas veelgi erinevusi jagatud valkude ekspressioonis (joonis 4E). Klastris A rikastati hUC-MSCExos ja hESC-Exos PI3K-AKT, Hippo, VEGF ja B-raku retseptori signaaliradades osalevaid valke. B-klastri valgud osalesid peamiselt PPAR signaaliülekande, kolesterooli metabolismi ja IgA tootmise reguleerimises ning olid hESC-Exos ammendunud. hUC-MSC-Exos sisaldas peamiselt C-klastri valke, mis reguleerisid komplemendi vastust, mikroobset infektsiooni, HIF-1 signaaliülekannet, MAPK signaaliülekannet, metaboolseid radu ja NF-κB rada. Klastri d valgud, mis olid rikastatud hiPSC-Exos, osalesid Ras signaalimise, oksüdatiivse fosforüülimise ja mTOR signaalimise reguleerimises. Klastri e valke oli nii hiPSC-Exos kui ka hESC-Exos rohkem kui hUC-MSCExos ja nad osalesid mitmetes metaboolsetes protsessides, nagu tsitraaditsükkel, rakutsükkel, insuliini signaalimine, rasvhapete metabolism ja AMPK signaalimine. . Klastri f valgud osalesid kaltsiumi reabsorptsiooni, glükolüüsi / glükoneogeneesi, adrenergilise signaaliülekande ja püruvaadi metabolismi reguleerimises ning olid ammendatud nii hUC-MSCExos kui ka hiPSC-Exos. Erinevates klastrites olevad valgud on loetletud lisafailis 4.

Kolme eksosoomitüübi miRNA profiilid

Kolme eksosoomitüübi miRNA profiilide uurimiseks eraldati eksosoomidest kogu RNA, et siduda 5' ja 3' otsad järgnevaks pöördtranskriptsiooniks. Saadud cDNA-d kasutati raamatukogu ehitamiseks ja laiaulatuslikuks testimiseks. RNA terviklikkuse arv (RIN) oli hESC-Exos, hiPSC-Exos ja hUC-MSC-Exos vastavalt 2,7, 2,6 ja 2,6 (lisafail 1: joonis S9A). RNA kontsentratsiooni määramine näitas, et RNA koormuses domineeris hESC-Exos, millele järgnesid hiPSC-Exos ja hUC-MSCExos (lisafail 1: joonis S9B). Pearsoni korrelatsioonikoefitsienti (lisafail 1: joonis S9C) ja PCA (lisafail 1: joonis S9D) kasutati miRNA-de korratavuse kvantitatiivseks hindamiseks. Kuumakaarte kasutati erinevalt ekspresseeritud miRNA-de esindamiseks kolmes eksosoomitüübis (lisafail 1: joonis S9E) ja diferentsiaalselt ekspresseeritud miRNA-de arv P juures.<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Bioloogilistes protsessides osalevate miRNA-de uurimiseks filtreeriti ülemised miRNA-d punktis P<0.05 and read count>1000 edasiseks sihtgeeni ennustamiseks. Seejärel viidi rikastatud geenidele läbi GO ja KEGG analüüsid. Tulemused näitasid, et hESC-Exose miRNA-d mõjutasid oluliselt järgmisi protsesse: Rap1, PI3K-AKT, kaltsium, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, rakutsükkel, AMPK signaalirada jne (KEGG analüüs) (joonis 5D) ja rakutsükkel, mitme organismi areng, rakusisene signaaliülekanne, rakkude diferentseerumine, vananemine, Wnt signaaliülekanne ja rasvhapete metabolism. (bioloogiline protsess) (joonis 5G). HiPSC-Exose miRNA-de sihtgeenide rikastamine näitas, et järgmised protsessid olid oluliselt reguleeritud: PI3K-AKT, Rap1, Ras, kaltsium, jõehobu, cAMP ja cGMP-PKG signaalirada jne (KEGG analüüs) ja rakutsükkel, mitme organismi areng, fosforüülimine, rakkude diferentseerumine, rakkude migratsioon ja reaktsioon hüpoksiale. (bioloogiline protsess) (joonis 5H). hUC-MSC-Exos miRNA-de regulatiivses võrgustikus olid kõige tõenäolisemad bioloogilised protsessid: Rap1, Ras, PI3K-AKT, kaltsium, cAMP, Hippo, rakutsükkel, JAK-STAT ja HIF-1 signaalirada. . (KEGG analüüs) (joonis 5F) ja fosforüülimine, rakusisene signaaliülekanne, ATP sidumine, rakkude jagunemine, lipiidide metabolism, T-rakkude kaasstimulatsioon, haavade paranemine, NF-κB seondumine ja põletikuline reaktsioon. (bioloogiline protsess) (joon. 5 I). Samuti kujutati viie parima miRNA võrgustikku ja nende regulatiivseid teid (lisafail 1: joonis S10).

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】