Sünergiline immuunsus ja kaitse hiirtel kaasimmuniseerimisel DNA-vaktsiinidega, mis kodeerivad SARS-CoV spike-valku ja muid struktuurseid valke-2

Abstraktne:Raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS CoV-2) uute variantide ilmnemine on tekitanud korduvaid ülemaailmseid nakkuspuhanguid. Need tugevalt muteerunud variandid vähendavad praeguste 2019. aasta koronaviirushaiguse (COVID-19) vaktsiinide tõhusust, mis on loodud sihtima ainult algse viiruse spike (S) valku. Välja arvatud SARS-CoV-2 S, on teiste struktuurvalkude (nukleokapsiid, N; ümbris, E; membraan, M) immunoprotektiivne potentsiaal vaktsiini sihtantigeenidena endiselt ebaselge ja väärib uurimist. Selles uuringus töötati välja sünteetilised DNA vaktsiinid, mis kodeerivad nelja SARS-CoV-2 struktuurvalku (pS, pN, pE ja pM) ning hiired immuniseeriti kolme annusega intramuskulaarse süstimise ja elektroporatsiooniga. Nimelt kutsus kaasimmuniseerimine kahe DNA vaktsiiniga, mis ekspresseerisid S- ja N-valke, kõrgemaid neutraliseerivaid antikehi ja vähendas SARS-CoV{10}} viiruskoormust tõhusamalt kui ainult S-valk hiirtel. Lisaks indutseeris pS-i kaasimmuniseerimine kas pN või pE + pM-ga pärast kolme immuniseerimist kõrgema S-valguspetsiifilise rakulise immuunsuse ja põhjustas leebemaid histopatoloogilisi muutusi kui ainult pS pärast nakatamist. SARS-CoV-2 konserveerunud struktuurvalkude, sealhulgas N/E/M valkude rolli tuleks täiendavalt uurida nende rakenduste osas vaktsiinide, näiteks mRNA vaktsiinide kujundamisel.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Märksõnad: COVID-19; SARS-CoV-2}}; kaasimmuniseerimine; DNA vaktsiin; spike valk; struktuurne valk

1. Sissejuhatus

Raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) on 2019. aasta koroonaviirushaiguse (COVID-19) põhjustaja, mis on põhjustanud miljoneid nakatumisi ja surmajuhtumeid kogu maailmas ning seadnud ohtu inimeste tervise ja maailmamajanduse . Kuigi tõhusad ravimeetodid pole endiselt kättesaadavad, on need kiiresti arenenud, sealhulgas CAR-T rakuteraapia ja nanotehnoloogia rakendamine [1, 2]. Vaktsineerimine on tõhus viis pandeemia kontrolli all hoidmiseks ja mitmed vaktsiinid on heaks kiitnud mitmed tervishoiu reguleerivad asutused [3,4]. Koronaviiruse genoom kodeerib nelja peamist struktuurvalku, nimelt piigi (S), nukleokapsiidi (N), membraani (M) ja ümbrise (E) valke, mis vastutavad virioni kokkupaneku ja peremeesorganismi immuunvastuse pärssimise eest [5] ]. S-valk koosneb 1273 aminohappejäägist, mis sisaldavad kahte subühikut, nimelt S1 ja S2. See vahendab viiruse sisenemist ja on koronaviiruse vaktsiinide väljatöötamise peamine sihtmärk [6–11]. SARS-CoV-2 S-valgul on aga kõrge mutatsioonisagedus. Pole üllatav, et RNA viiruses SARS-CoV{19}} on mutatsioon pidev ja vältimatu. Alates 2020. aasta septembrist on ilmnenud viis SARS-CoV{21}} probleemivarianti (VOC), sealhulgas B.1.1.7 (Ühendkuningriik, alfa), B.1.351 (Lõuna-Aafrika, beetaversioon), P.1 (Brasiilia, Gamma), B.1.617.2 (India, Delta) ja B.1.1.529 (Lõuna-Aafrika, Omicron) (Andreano ja Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Neil kõigil on spike-valgus mitu mutatsiooni [12]. Need variandid ohustavad praeguste COVID-19 vaktsiinide tõhusust, mis on loodud sihikule võtma ainult piigivalku.

SARS-CoV-2 N-valk seondub viiruse RNA-ga nende tuumas oleva 140-aminohappepikkuse RNA-d siduva domeeni kaudu "helmesena nööril". See on koroonaviiruste seas väga konserveerunud, jagades SARS-CoV järjestuse identsust ~ 90%, ja see on ka ainus struktuurvalk virionis [13]. Lisaks mängib see olulist rolli viiruse RNA pakkimisel ribonukleokapsiidi kompleksi ning on vajalik viiruse RNA replikatsiooniks, virioni kokkupanekuks ja peremeesrakkudest vabanemiseks [14]. Koronaviiruste N-valgu suure järjestuse sarnasuse põhjal võib seda soovitada ristkaitse vaktsiini sihtmärgiks. Varem leidsime, et kaasimmuniseerimine kahe E- ja M-valke ekspresseeriva DNA vaktsiiniga tagab osalise kaitse SARS-CoV-2 vastu ja seda meetodit tuleks vaktsiini väljatöötamisel arvesse võtta [15]. Sõltuvalt WHO maastikudokumendist on SARS-CoV-2 vaktsiinikandidaatide jaoks tavaliselt seitse strateegiat, mida saab jagada kolme kategooriasse: esiteks valgupõhised vaktsiinid, sealhulgas inaktiveeritud viirusvaktsiinid, viiruselaadsed vaktsiinid. osakesed ja valgu subühiku vaktsiinid; teiseks geenipõhised vaktsiinid, sealhulgas viirusvektoriga vaktsiinid, DNA vaktsiinid ja mRNA vaktsiinid; kolmandaks nii valgupõhiste kui ka geenipõhiste lähenemisviiside kombinatsioon, näiteks nõrgestatud elusviiruse vaktsiinid. DNA-tehnoloogiad kui uudsed geenipõhised vaktsiinistrateegiad võivad prekliinilise testimise käigus kiiresti võrrelda mitut vaktsiinikandidaati ja strateegiat [16,17]. Teoreetiliselt on peaaegu kõik viirusvalgud potentsiaalsed immunogeenid ja vaktsiini sihtmärgid. Kuid meile teadaolevalt ei ole sünteetiliste DNA vaktsiinide immunogeensust ja kaitsepotentsiaali SARS-CoV-2 S valkude ja muude struktuursete valkude kodeerimisel veel süstemaatiliselt teatatud. Nelja SARS-CoV-2 S-, N-, E- ja Ml-valke ekspresseeriva DNA vaktsiini immunogeensust ja kaitsetõhusust hiirtel hinnati, et uurida S-i immunoloogilisi toimeid kombinatsioonis teiste struktuurvalkudega.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Rakud

Huh7.5 rakke ja inimese embrüonaalse neeru 293T rakke kultiveeriti kogu uuringu vältel temperatuuril 37 ◦C niisutatud atmosfääris 5% CO2 juures. Rakke kultiveeriti DMEM söötmes (HyClone, Logan, UT, USA), millele oli lisatud 10% FBS-i (GEMINI Co., Shanghai, Hiina) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini (Gibco, New York, NY, USA). Kõik rakuliinid olid mükoplasma saastumise suhtes negatiivsed.

2.2. SARS-CoV-2 S/N/E/M kodeerivate DNA vaktsiinide konstrueerimine

SARS-CoV-2 S/N valku kodeeriv geen, mis sisaldab N-terminaalset Kozaki järjestust (GCCACC), millele järgnes initsiatsioonikoodon (ATG), sünteesiti, kasutades imetaja jaoks optimeeritud koodonit (GenScript Co., Nanjing). , Hiina). Seejärel klooniti see EcoRI ja Xbal seedimise kaudu ekspressioonivektorisse pcDNA3.1 (+) ja nimetati pS/pN (DNA vaktsiinid) (joonis 1A). pE/PM valk konstrueeriti ja identifitseeriti nagu eelnevalt kirjeldatud [15]. Vaktsiinid valmistati endotoksiinivabade Maxiprep komplektide abil (Qiagen, Peking, Hiina) ja järjestused kinnitati Sangeri DNA järjestuse abil. S/N valgu ekspressiooni kinnitati Western blot analüüsi ja anti-S (Sino Biological, Peking, Hiina)/anti-N antikehade abil, mis olid lahjendatud vahekorras 1:1000. Need katsed viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [15, 18].

Joonis 1. Rekombinantse DNA-l põhinevate SARS-CoV-2 S/N valguvaktsiini konstruktide disain ja ekspressioon. (A) Rekombinantsete DNA-põhiste vaktsiinide skemaatiline diagramm, mis kodeerivad SARS-CoV-2 spike (PS), nukleokapsiidi (pN), ümbriku (pE) ja/või membraani (PM) valke. (B) Sihtvalgu ekspressioon DNA vaktsiinides valideeriti pS/pN/pE/pM plasmiididega transfekteeritud 293T rakkude Western blot analüüsiga.

2.3. Vaktsineerimine ja väljakutse

Emased BALB/c hiired (Charles River Laboratories, Prantsusmaa) 6 nädala vanuseid majutati riiklikus töötervishoiu ja mürgistuskontrolli instituudis 21 °C ja kontrollitud niiskusega keskkonnas 12-tunniste valguse/pimeduse tsüklitega. Vahepeal anti toitu ja vett ad libitum ning kõik loomkatsed kiitis heaks Hiina haiguste tõrje ja ennetamise keskuse (China CDC) loomkatsete eetika komitee. Uuring vastas asjakohastele eetikanormidele.

Hiired jagati juhuslikult viide rühma ja immuniseeriti ainult pS/pN-ga või kaasimmuniseeriti pS + pN või pS + pE + PM-ga päevadel 0, 21. ja 42. intramuskulaarse süsti ja elektroporatsiooni teel (35 mg/50). ml) (joonis 2) [19,20]. Lühidalt, DNA vaktsiinid süstiti sääreluu eesmisse (TA) lihasesse ja impulsseeriti kohe elektriga, kasutades nõeltega 5 mm vahega kahe nõela massiivi elektroodi (ECM830; BTX). Hiirte seerumid koguti humoraalse immuunvastuse analüüsi jaoks ja hiire põrnad töödeldi rakulise immuunvastuse mõõtmiseks (joonis 2).

Joonis 2. Immuniseerimise ja SARS-CoV-2 nakatumise skeem. Vaktsineerimise ajaline kulg, väljakutsed ja vere-/koeproovide võtmine. BALB/C hiired jagati juhuslikult rühmadesse.

SARS-CoV-2 nakatamise katsed viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [15,21]. Lühidalt, hiired anesteseeriti ja seejärel transdutseeriti intranasaalselt 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2-ga kogumahus 45 µl. Viis päeva pärast transduktsiooni hiired anesteseeriti ja seejärel nakatati ninasiseselt 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) kogumahus 50 µl soolalahuses. puhver. Kogu töö reaalajas SARS-CoV-2 hiiremudelites viidi läbi loomade bioloogilise ohutuse 3. taseme (ABSL-3) laborites.

2.4. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsid (ELISA) viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [15]. Lühidalt, karbonaatpuhvris (0,1 M, pH 9,6) lahjendatud S (ostetud ettevõttest Sino Biological)/N valgud (kingitus firmalt Song) kaeti 96-kaevu EIA/RIA plaatidele (Thermo). Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) üleöö temperatuuril 4 ◦C. Plaadid blokeeriti 200 µl 10% kitse seerumiga PBS-is temperatuuril 37 °C 2 tundi, millele järgnes viis korda pesemine PBST-ga. Seejärel lisati seerumiproovid, mis olid järjestikku lahjendatud 2% kitse seerumiga PBS-is, ja inkubeeriti 2 tundi temperatuuril 37 °C, millele järgnes viis pesemist PBST-ga. HRP-konjugeeritud kitse hiirevastane IgG Ab (1:5000) lisati temperatuuril 37 °C 1 tunniks. Igasse süvendisse lisati kokku 100 µl TMB substraati ja reaktsioon peatati 50 µl 2M H2SO4-ga. Neeldumist loeti lainepikkusel 450 nm, kasutades SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hongkong, Hiina).

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Pseudoviiruse nakkuse ja neutraliseerimise katsed

Pseudoviiruse neutraliseerimise test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [21, 22]. Eelnevalt konstrueeriti plasmiid, mis ekspresseerib esivanemate viiruse S valku [22]. Sünteesiti Omicroni variandi SARS-CoV-2 spike-valgu geen (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (kingitus ettevõttelt Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Hiina) kasutades imetaja jaoks optimeeritud koodonit ja klooniti pcDNA3.1 vektorisse, nagu eelnevalt kirjeldatud [22]. Lühidalt, lutsiferaasi reporterit ekspresseerivad plasmiidid ja S-valku ekspresseerivad plasmiidid transfekteeriti koos HEK 293T rakkudesse, kasutades X-treme GENE HP DNA transfektsioonireagenti. Rakukultuuri värskendati 6 tundi pärast transfektsiooni ja pseudoviirust sisaldav supernatant koguti 48 tunni pärast ja säilitati temperatuuril –70 ◦C. Pseudoviiruse neutraliseerimise testis inkubeeriti seejärel võrdset seerumi-viiruse segu 37 mahus pseudoviirust sisaldava supernatanti ja lisati seejärel lahjendatud seerumile. ◦C 1 tund. Seejärel asendati Huh7.5 rakukultuuri sööde 100 µL seerumi-viiruse seguga ja inkubeeriti 12 tundi temperatuuril 37 ◦C. Ainult SARS-CoV-2 pseudoviirustega kultiveeritud rakke käitati paralleelselt. Seejärel asendati sööde DMEM-iga (2% FBS) ja inkubeerimist inkubeeriti 37 °C juures 48 tundi. Seejärel mõõdeti lutsiferaasi signaali Bright-Glo tulekärbse lutsiferaasi komplekti (Promega) abil.

2.6. SARS-CoV-2 neutraliseerimisanalüüs

Selles katses kasutati SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Lühidalt, seerumid lahjendati kahekordselt, alustades lahjendusest 1:10, segati võrdse koguse (10–15 pfu/süvend) elusa SARS-CoV-ga-2 ja inkubeeriti 1 tund 37 ◦C juures, misjärel need lisati külvatud Vero rakkudesse. Pärast 48-tunnist inkubeerimist 37 °C juures täheldati tsütopaatilist toimet (CPE) ja 100 µl kultuuri supernatanti koguti nukleiinhapete ekstraheerimiseks ja reaalajas fluorestsents-pöördtranskriptsiooni PCR (RT-PCR) jaoks. Keskmine neutraliseerimisdoos (ND50) arvutati Reed-Munchi meetodil [15].

2.7. IFN-ELISpot test

Scilight Biotechnology, LLC sünteesis peptiidide kogumid, mis hõlmavad kogu S/N/E/M valku järjestikuste 15-meeridena üle 10 aminohappe võrra. Ühes viaalis oli ligikaudu 2,5 mg igat peptiidikogumi puhastatud peptiidi. Katse viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [18]. Lühidalt, 96-kaevuplaadid (BD ELISPOT Set, USA) kaeti IFN-püüdmisvastase Ab-ga ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 ◦C. Pärast kolmekordset pesemist blokeeriti plaadid täieliku söötmega. Splenotsüüdid koguti pärast hiirte surmamist 35. päeval ja 120. Iga rühma värsked üherakulised suspensioonid kanti plaadile tihedusega 5 × 106 süvendi kohta ja lisati peptiidid. Seejärel inkubeeriti plaate temperatuuril 37 °C 5% CO2-s 22 tundi ja tuvastati ELISpoti plaadilugeja abil (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Spot-forming unit (SFU) esindab T-rakke sekreteerivat IFN-.

2.8. Kaitse hindamine hiirtel pärast SARS-CoV-2 väljakutset

Katsed viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [15, 21]. Lühidalt, kopsud koguti pärast hiirte surmamist. Pooli kudedest kasutati nukleiinhapete ekstraheerimiseks, reaalajas fluorestsents-RT-PCR ja TCID50 jaoks. Teine pool saadeti patoloogiliseks hindamiseks Hiina põllumajandusülikooli veterinaarmeditsiini kolledžisse.

2.9. Statistiline analüüs

Sidumata t-testid, kahesuunalised ANOVA testid ja Dunnetti mitme võrdluse test viidi läbi programmiga GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-väärtusi < 0.05 peeti statistiliselt oluliseks (* p < 0.05; ** p < 0,01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Tulemused

3.1. DNA vaktsiinide iseloomustus

E- ja M-valgu tasemed tuvastati Western blot analüüsi abil. Mõõtsime SARS-CoV-2 kodeeritud S/N/E/M valkude ekspressiooni pS/pN/pE/pM plasmiididega transfekteeritud HEK-293T-rakkudes Western blot analüüsi abil, kasutades anti -S/anti-N antikehad ja anti-6 x His antikehad rakulüsaatides. Ribad vastasid S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) ja M (22–25 kDa) valkude eeldatavale molekulmassile (joonis 1B).

3.2. Tugev ja püsiv anti-S ja/või anti-N IgG tootmine, mis on indutseeritud pS ja/või pN DNA poolt

Vaktsiinid Seerum koguti BALB/c hiirtelt 35., 56., 96. ja 120. päeval (joonis 2). Anti S/anti-N IgG tasemed tuvastati ELISA abil. pS või pN poolt indutseeritud S- või N-spetsiifilise IgG vastuse ulatus suurenes seerumis pärast esimest ja teist võimendust. Anti-S ja anti-N IgG tiitrid olid pS + pN rühmas kõrgemad kui teistes rühmades; erinevus ei olnud siiski statistiliselt oluline (joonis 3A, B). Tugevaid E/M-valguspetsiifilisi antikehavastuseid ei tuvastatud, mis on kooskõlas eelmise uuringu tulemustega (andmeid pole näidatud) [15].

Joonis 3. B-rakkude vastused SARS-CoV-2-le BALB/c hiirtel. (A) Seerumi IgG sidumise lõpp-punkti tiitrid SARS-CoV-2 S (A) ja N valkude (B) jaoks. (C) Neutraliseerimistiitrid määrati SARS-CoV-2 pseudotüüpse viiruse süsteemi põhjal. (D) SARS-CoV-2-vastase neutraliseerimise tiitrid määrati SARS-CoV-2 viiruse abil. (E) SARS-CoV{15}} Omicroni pseudotüübiga viirusesüsteemil põhinev neutraliseerimisanalüüs. Näidatud on näidisrühmade (sinine), pS (punane), pS + pN (roheline), pS + pE + pM (roosa) ja pN (oranž) seerumite inhibeerimissuhted. Vearibad tähistavad SEM-i ja p-väärtused arvutati kahesuunalise ANOVA ja Sidaki post hoc analüüsi abil, kus * p < 0.05

3.3. Neutraliseerivate antikehade kõrge tase, mis on põhjustatud kaasimmuniseerimisest pS ja pN vaktsiinidega

Seeriaviisiliselt lahjendatud seerumiproovide neutraliseerivad tiitrid määrati pseudotüübiga SARS-CoV-2 viirusega. Suurimat neutraliseerivate antikehade (nAb) taset täheldati pS + pN rühmas, vastastikused EC50 geomeetrilised keskmised tiitrid jõudsid 2988-ni (35. päeval) ja 3578-ni (56. päeval) (joonis 3C). Sarnaseid tulemusi täheldati ka elusviiruse mikroneutralisatsiooni (MN) testiga, kus nAb-de tasemed pS + pN rühmas olid päevadel 56 ja 96 kõrgemad kui S-rühmas (p < 0,05; joonis). 3D). Veelgi enam, nAb-de tasemed pS + pN rühmas päeval 56 (teine ​​võimendus) olid oluliselt kõrgemad kui päeval 35 (p < 0,05; joonis 3D).

Iga vaktsiinirežiimi neutraliseeriv toime SARS-CoV-2 Omicroni variandi vastu määrati täiendavalt pseudotüüpse platvormi ja seerumiproovide abil. Omicroni viiruse vastane neutraliseerimisprofiil päevadel 35 ja 56 oli sarnane esivanemate viiruse omaga (joonis 3E), mis viitab sellele, et PS + pN-ravil oli ristneutraliseeriv toime.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

3.4. DNA vaktsineerimisega indutseeritud T-rakkude reaktsioonid

Nagu eelnevalt kirjeldatud, hinnati T-rakkude vastuseid SARS-CoV-2 S/N/E/M antigeenide suhtes IFN-ELISpot abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [15]. Nagu oodatud, kutsusid nii PS + pN kui ka pS + pE + pM režiimid 12. päeval 0 esile S-valgu suhtes spetsiifiliste IFN + T-rakkude märkimisväärselt kõrgema taseme kui päeval 35 (p < 0). 05; joonis 4A). Veelgi enam, N-valgu suhtes spetsiifiliste IFN + T-rakkude arv päeval 120 (teine ​​võimendus) oli pS + pN rühmas oluliselt suurem kui päeval 35 (p < 0,05; joonis 4B). Lõpuks oli M-valgu suhtes spetsiifiliste IFN + T-rakkude arv päeval 120 (teine ​​võimendus) oluliselt suurem kui 35. päeval mõlemas rühmas (p < 0,05; joonis 4D).

Joonis 4. T-rakkude vastused SARS-CoV-2 üksikutele struktuurvalkudele BALB/c hiirtel. (A) T-rakkude vastuseid mõõdeti IFN-ELISpot abil splenotsüütides, mida stimuleeriti 20 h kattuvate peptiidide kogumitega, mis hõlmasid SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, ja (D) M-valgud. Tulbad tähistavad keskmist ± SD. Statistilised analüüsid viidi läbi kahesuunalise ANOVA ja Sidaki post hoc testiga, kus * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 ja **** p < 0,0001.

3.5. Sünergiline kaitse, mis on põhjustatud kaasimmuniseerimisest pS/pN või pS/pE/pM-ga

Seejärel hindasime DNA vaktsiinide kaitsetõhusust, kasutades hACE2 hiiri, keda immuniseeriti pärast nakatamist esivanemate SARS-CoV-2 viirusega. Pärast väljakutset langes proovirühma hiirtel järk-järgult kaalulangus. Seevastu pS või pS+-ga immuniseeritud hiirtel ilmnes kerge kaalulangus kohe pärast nakatumist, millele järgnes taastumine (joonis 5A). pS, pS + pN või pS + pE + pM vaktsineeritud hiirtel elusviirust ei tuvastatud. Lisaks vähendas pS + pN vaktsineerimine oluliselt viiruse RNA koopiate arvu võrreldes nendega, mis saadi ainult pS vaktsineerimisega (p=0.0228; joonis 5B). Veelgi enam, kopsu histopatoloogia näitas, et nii näidis- kui ka pN-rühma hiirtel ilmnesid põletiku fookused, pleura invaginatsioon, alveolaarne kollaps, põletikuliste rakkude kõrge infiltratsiooni tase ja hemorraagilised piirkonnad. Võrdluseks: hiirtel, keda raviti kas pS + pN või pS + pE + pM-ga, ilmnesid kergemad histopatoloogilised muutused ja madalamad INHAND-skoorid pärast nakatamist kui teisel rühmal (joonis 5C).

Joonis 5. Immuniseerimise kaitsetõhusus pärast elusa SARS-CoV-2 viirusega nakatumist. (A) Hiiri kaaluti iga päev (keskmine ± keskmise standardviga (SEM), n=4) kolm päeva pärast nakatamist. (B) Nakkuslik SARS-CoV-2 tiiter kopsuhomogenaatides kolmandal päeval pärast nakatamist, määratud TCID5{{10}} testi ja RNA koopianumbriga. Statistiliselt olulised erinevused rühmade vahel määrati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Dunnetti mitmekordne võrdlusparandus (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ja **** p < 0,0001). (C) Kopsude histopatoloogiline analüüs, kasutades H&E värvimist.

4. Arutelu

Selles uuringus indutseeris kaasimmuniseerimine kahe S- ja N-valke ekspresseeriva DNA vaktsiiniga kõrge nAb-de taseme ja oli väga tõhus SARS-CoV-2 viiruskoormuse vähendamisel hiirtel. S-valku ekspresseerivad DNA vaktsiinid kutsusid esile suurenenud S-valgu spetsiifilise rakulise immuunsuse taseme pärast kolme immuniseerimist, kui hiired immuniseeriti koos N / E ja M valkudega, ja leevendasid nakatamisjärgseid histopatoloogilisi muutusi. Meie teadmiste kohaselt on see esimene aruanne, mis näitab immuunsuse ja kaitse sünergilist paranemist hiirtel, kasutades S-valku kodeerivat DNA vaktsiini, kui neid immuniseeritakse koos DNA vaktsiinidega, mis kodeerivad SARS-CoV teisi struktuurseid valke. }}.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Mitmetes uuringutes on täheldatud immunodominantseid B-raku epitoope N antigeeni piirkondades. N-põhised vaktsiinid ei saa tavaliselt nAb-sid esile kutsuda, tõenäoliselt seetõttu, et N-valku ei kuvata viiruse pinnal. Nimelt kutsus kaasimmuniseerimine S- ja N-valkudega esile esivanemate ja Omicron SARS-CoV-2 viiruse vastaste nAb-de kõrgema taseme kui teised rühmad. Suurenenud nAb vastuseid seostatakse parema viiruse kliirensi ja kaitsva efektiivsusega. Meie tulemused näitasid, et pS + pN-ravi oli SARS-CoV-2 viiruskoormuse vähendamisel pärast nakatamist tõhusam kui ainult pS-ravi. Eelmises uuringus teatati, et M- ja N-valke samaaegselt ekspresseeriva vaktsiiniga immuniseeritud hamstrid olid kaitstud raske kaalukaotuse ja kopsupatoloogia eest ning neil oli pärast SARS-CoV{12}} nakatumist oluliselt vähenenud viiruse tiitrid orofarünksis ja kopsudes. mis on kooskõlas meie tulemustega [23]. Kahjuks ei saa viiruse tiitrite vähenemist konkreetselt seostada M- või N-valguga ja nAb taset selles uuringus ei hinnatud. Üks SARS-CoV-2 mRNA vaktsiini uuring teatas, et S + N kaasimmuniseerimine kutsus esile suurenenud S-spetsiifilise CD8+ T-raku vastuse ja neutraliseeriva antikeha aktiivsuse, pakkudes kopsudele paremat kaitset delta eest. variant võrreldes ainult S-ga, mis on kooskõlas selle uuringu tulemustega [24]. Teises uuringus teatati, et transmissiivse gastroenteriidi koroonaviiruse N-valk soodustas neutraliseerivate antikehade sünteesi, kui sigade TGEV-IMMUNE rakke stimuleeriti S- ja N-valkude kombinatsiooniga in vitro, ja seda toimet võib seletada abistaja-T-lümfotsüütide vastusega. N-valk [25].

Immunodominantsed CD{0}}/CD8+ T-raku epitoobid N-antigeeni piirkondades on varem tuvastatud. Mitmed uuringud on teatanud, et SARS-CoV-2 N-valgul põhinevad vaktsiinid kutsuvad esile tõhusalt rakulise immuunvastuse. S + N rühmas ilmnes pärast kolme immuniseerimist suurenenud S-valgu spetsiifiline rakuline immuunsus. Üks SARS-CoV-2 mRNA vaktsiiniuuring teatas, et kombineeritud S + N kutsus esile S-spetsiifilise CD8+ T-raku suurendatud vastuse võrreldes ainult S-ga, mis on kooskõlas meie tulemustega [24]. Teises uuringus teatati, et T-rakkude vastused S- ja N-antigeenidele pärast ainult kahe antigeeniga hAd5 S + N esmast vaktsineerimist olid samaväärsed varem SARS-CoV{20}}-ga nakatunud patsientide omadega ja T-rakkude in silico ennustusmudelid. epitoobi HLA seondumine viitas sellele, et T-raku vastused hAd5 S+N vaktsiinile säilitavad oma efektiivsuse B.1.351 variandi vastu. Lisaks näitas varem SARS-CoV-2-nakatunud patsientide plasma seondumisafiinsust topeltantigeeni S-Fusion + N-ETSD konstrukti ekspresseerivate rakkudega kui ainult hAd5 S-Fusioniga, mis viitab veelgi sellele, et rakkude immunogeensus S + N topeltantigeeni vaktsiin on parem kui S ühe antigeeniga vaktsiin [26].

Elusviirust kopsudes ei tuvastatud ja nakatamisjärgne kaalulangus leevendati pS, pS + pN ja pS + pE + pM rühmades, samas kui pN-ravi ei vähendanud tõhusalt viiruse tiitrit. Need leiud rõhutavad S-valgu kui vaktsiini sihtmärgi asendamatust ja tõhusust. Nimelt avaldas kaasimmuniseerimine pS ja pN-ga viiruse kliirensile paremat mõju kui pS või pN. Rühm pS + pE + pM näitas vähem histopatoloogilisi muutusi kopsudes, mis on kooskõlas meie eelmise uuringu tulemustega [15]. S + N rühmal oli madal viiruse RNA koopiaid kopsus, vähenenud kaalulangus ja kiire taastumisaeg pärast SARS-CoV{11}} nakatumist, võrreldes ainult S/N-ga immuniseeritud rühmaga, mis oli kooskõlas selle uuringu tulemused. Kuid ükski rühm ei tuvastanud neutraliseerivate antikehade tiitreid, mis võib olla seletatav erinevustega vaktsiinide mitmekesisuses ja katseloomades [26]. Üks SARS-CoV-2 adenoviiruse vektorvaktsiini uuring teatas, et S-vaktsiin kaitses aju ägedalt ainult siis, kui seda immuniseeriti koos N-vaktsiiniga [27]. Teises uuringus töötati välja Tri: ChAd, Bi: ChAd ja Mono: ChAd vaktsiinid, mis ekspresseerivad vastavalt S1/N/RdRp, N/RdRp ja S1 valke, ning testiti neid B.1.351 loommudelil. Mono: ChAdlungsi kopsudes täheldati ulatuslikku tõsist patoloogiat, samas kui Bi: ChAd ja Tri: ChAd kopsud tundusid sellest patoloogiast peaaegu vabad [28].

Lisaks oli vaktsineerimata loomadel suur kopsu viiruskoormus, samas kui ravi Tri: ChAd vähendas viiruskoormust oluliselt 3,5 logi võrra. Võrdluseks, nii Bi: ChAd kui ka Mono: ChAd vaktsiinid vähendasid viiruskoormust vaid mõõdukalt. Need tulemused viitavad sellele, et S/N topeltantigeeniga vaktsiini kaitsev toime variantide vastu võib olla parem kui S ühe antigeeniga vaktsiini oma, mis on kooskõlas meie tulemustega [28]. Mõned uuringud on teatanud, et N-valguga immuniseeritud hiirtel tekib pärast SARS-CoV nakatumist raske kopsupõletik [29–31]. Varasemad uuringud on samuti teatanud, et immuniseerimine hiire hepatiidi viiruse N valku ekspresseeriva adenoviiruse vektorvaktsiiniga kaitseb hiiri surmava infektsiooni eest, mis näitab, et N-valk võib tekitada kaitsva toime [32]. Lisaks oli CRT/N DNA vaktsiiniga immuniseeritud rühmal pärast nakatamist märkimisväärselt vähenenud viiruse tiiter, kuna SARS-CoV N valku ekspresseeris vaktsiiniaviirus [33].

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Üks S-valgu uuring näitas, et kombineeritud DNA/valgu vaktsiin kutsus esile nii humoraalse kui ka rakulise immuunsuse paremini kui ainult DNA/valgu vaktsiin [8]. Vaktsiinid, mis on suunatud ainult S-valgule, on näidanud vähem tõhusat kaitset esilekerkivate variantide põhjustatud kerge kuni mõõduka COVID{3}} eest. Konserveerunud SARS-CoV-2 struktuurvalkude, sealhulgas N/E/M valkude rollid väärivad vaktsiini kavandamisel ja rakendustes tähelepanu, kuna vaktsiini poolt indutseeritud T-raku vastuseid konserveerunud epitoopide vastu üldiselt mutatsioonid ei mõjuta. . Ühes uuringus teatati, et SARS-i põdevatel patsientidel (n=23) oli 17 aastat pärast 2003. aasta puhangut ikka veel kauakestvaid SARS-CoV N-valgu suhtes reaktiivseid mälu-T-rakke, mis näitasid tugevat ristreaktiivsust SARS-i CoV-le. {15}} N-valk, mis kinnitab veelgi N-valgu kasutamist kaitsva vaktsiini sihtmärgina [34]. See uuring näitas, et pS/pN kaasimmuniseerimine oli seotud kõrgemate nAb vastuste, parema viiruse kliirensi ja paranenud rakulise immuunvastusega ning võib pakkuda paremat kaitset pärast SARS-CoV-2 nakatamist, võrreldes ainult pS-ga. Lisaks on näidatud, et SARS-CoV-2 variandid nakatavad paljusid loomaliike ning mõnel metsloomal ja lemmikloomal on täheldatud inimeselt loomale ülekandumist [7]. Seega vajab veterinaarne SARS-CoV-2 vaktsiin rohkem tähelepanu. Lisaks võib nanotehnoloogia olla võimas vahend vaktsiinide optimeerimisel ja väärib rohkem tähelepanu [2].

Sellel uuringul on mitmeid piiranguid. Esiteks jälgisime DNA vaktsiinistrateegiat ainult BALB / c hiirtel ja tulevased uuringud peaksid hindama nende vaktsiinirežiimide immunogeenset mõju teistes loommudelites. Teiseks on vaja täiendavaid uuringuid, et täielikult mõista molekulaarseid mehhanisme, mis on S- ja N-valkude kaasimmuniseerimisel esile kutsutud suurendatud nAb- ja S-spetsiifiliste CD8 T-rakkude vastuste aluseks, ning kasutada neid teadmisi COVID-i optimeerimiseks-19 vaktsiini disain. Lõpuks väärib N-valguspetsiifiliste antikehade funktsioon täiendavat uurimist.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Kokkuvõttes hinnati selles uuringus SARS-CoV-2 S-, N-, E- ja M-valkudega kaasimmuniseerimise immuunkaitsepotentsiaali. Mitmetel vaktsiinidel, mis on suunatud ainult S-valgule, on tekkivatele tüvedele vähenenud kaitsev toime. Meie tulemused panevad aluse ristreaktiivse COVID{5}} vaktsiini väljatöötamisele, et kontrollida praegusi ja tekkivaid SARS-CoV-2 variante ning vältida võimalikke koroonaviiruse pandeemiaid.

Viited

1. Zmievskaja, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petuhhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. CAR-T rakuteraapia rakendamine väljaspool onkoloogiat: autoimmuunhaigused ja viirusinfektsioonid. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanotehnoloogia uudse koroonaviiruse (raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2) vastane: diagnoos, ravi, ravi ja tulevikuperspektiivid. Nanomeditsiin 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID{1}} karja immuunsus: kus me oleme? Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Immunoloogilised kaalutlused COVID-19 vaktsiinistrateegiate puhul. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG SARS-CoV-2 genoomi struktuurianalüüs ja inimese interaktoomi ennustused. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. SARS-CoV-2 rakkudesse sisenemise mehhanismid. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. Lineaarne DNA vaktsiinikandidaat, mis kodeerib SARS-CoV-2 retseptorit siduvat domeeni, kutsub kodukassidel esile tugeva immuunvastuse ja neutraliseerivad antikehad. Mol. Seal. Meetodid Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgojakova, MB; Karpenko, LI; Merkuljeva, IA; Štšerbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. DNA/valgu kombineeritud vaktsiini immunogeensus COVID-i vastu-19. Bull. Exp. Biol. Med. 2023, 1.–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Tsirkulaarsed RNA vaktsiinid SARS-CoV-2 ja tekkivate variantide vastu. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. SARS-CoV-2 mRNA vaktsiini disain, mis on võimaldatud patogeeni prototüübi valmisolekuga. Loodus 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. SARS-CoV-2 spike-glükoproteiini vaktsiinikandidaat NVX-CoV2373 immunogeensus paavianidel ja kaitse hiirtel. Nat. Commun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abdiento, V.; Benincasa, L.; et al. Hübriidimmuunsus parandab B-rakke ja antikehi SARS-CoV-2 variantide vastu. Loodus 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Ülevaade SARS-CoV-2 genoomist, struktuurist, evolutsioonist, patogeneesist ja ravimeetoditest: struktuurigenoomika lähenemisviis. Biochim. Biophys. Acta Mol. Alus. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. India uus COVID{1}} DNA vaktsiin noorukitele ja täiskasvanutele on esimene. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Han, D.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. Ümbrikut ja membraanivalke ekspresseerivad DNA vaktsiinid pakuvad hiirtel osalist kaitset SARS-CoV-2 vastu. Esiosa. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow, parlamendisaadik; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Intradermaalne SynCon®Ebola GP DNA vaktsiin on temperatuur stabiilne ja demonstreerib ohutult raku- ja humoraalse immunogeensuse eeliseid tervetel vabatahtlikel. J. Infect. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. DNA vaktsiinikandidaadi immunogeensus COVID-i vastu-19. Nat. Commun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Song, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. Kaasimmuniseerimine CHIKV VLP ja DNA vaktsiinidega kutsub hiirtel esile paljutõotava humoraalse reaktsiooni. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Kruntimine kahe DNA vaktsiiniga, mis ekspresseerivad C-hepatiidi viiruse NS3 valku, mis on suunatud dendriitrakud, kutsub hiirtel esile parema heteroloogse kaitsepotentsiaali. Arch. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. DNA immuniseerimise ja in vivo elektroporatsiooni tõhustatud toime B-hepatiidi viiruse tuuma-PreS1 ja S-PreS1 plasmiidide kombinatsiooniga. Clin. Vaktsiin Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et al. Südamikuga struktureeritud COVID-19 mRNA vaktsiin, millel on soodne biojaotusmuster ja paljutõotav immuunsus. Signaali ülekanne. Sihtmärk Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Pseudotüübiga SARS-CoV-2 süsteemi väljatöötamine ja efektiivsus, mis on määratud neutraliseerimise efektiivsuse ja sisenemise inhibeerimise testiga in vitro. Biosaf. Tervis 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Replitseeriv bakterivektoriga vaktsiin, mis ekspresseerib SARS-CoV-2 membraani- ja nukleokapsiidivalke, kaitseb hamstrite raske COVID{5}}taolise haiguse eest. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. Kombinatoorne mRNA vaktsineerimine suurendab kaitset SARS-CoV-2 delta variandi vastu. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Anton, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV) struktuurvalkude vaheline koostöö viirusspetsiifiliste antikehade in vitro induktsioonis. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Rätsep, N.; Frost, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et al. Ühekordne immuniseerimine rekombinantsete ACAM2000 vaktsiiniaviirustega, mis ekspresseerivad piiki ja nukleokapsiidivalke, kaitsevad hamstreid SARS-CoV-2- põhjustatud kliinilise haiguse eest. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; klass, J.; Pagan võtaks.; Richner, JM A SARS CoV-2 nukleokapsiidi vaktsiin kaitseb viiruse distaalse leviku eest. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Jah, G.; Luo, X.; et al. Järgmise põlvkonna COVID{2}} vaktsiini manustamine hingamisteede limaskestadele pakub tugevat kaitset nii SARS-CoV-2 esivanemate tüvede kui ka teisendite vastu. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. SARS-CoV nukleokapsiidi valgu võimendatud ekspressioon tubakas ja selle immunogeensus hiirtel. Vaktsiin 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Eelnev immuniseerimine raske ägeda respiratoorse sündroomiga (SARS) seotud koronaviiruse (SARS-CoV) nukleokapsiidivalguga põhjustab SARS-CoV-ga nakatunud hiirtel rasket kopsupõletikku. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Hapukurk, R.; et al. Vaktsiini efektiivsus vananevatel hiirtel, keda on nakatatud rekombinantse SARS-CoV epideemiliste ja zoonootiliste naastude variantidega. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Hiire hepatiidiviiruse spike ja adenoviirusvektorite poolt ekspresseeritud nukleokapsiidivalgud kaitsevad hiiri surmava infektsiooni eest. J. Kindral Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Tema, L.; Chen, PJ; et al. Raske ägeda respiratoorse sündroomi koronaviiruse nukleokapsiidivalgule suunatud DNA vaktsiinide genereerimine ja iseloomustamine. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-spetsiifiline T-rakuline immuunsus COVID-19 ja SARS-i ja nakatumata kontrollide korral. Loodus 2020, 584, 457–462. [CrossRef]