Laminaria Japonica Fucoidani ja Cistanche Tubulosa ekstrakti sünergistlik põletikuvastane toime

Immuunvastusena võõrantigeenide vastu vabastavad makrofaagid põletikku soodustavaid tsütokiine, nagu kasvaja nekroosifaktor (TNF-), interleukiin-1 (IL- 1), IL-6 ja teised. Sellised tsütokiinid kutsuvad esile granulotsüütide, monotsüütide, lümfotsüütide ja nuumrakkude kemotaktilise sissevoolu kahjustatud koesse, mis soodustab antigeeni eemaldamist ja kudede taastumist. Kuid rakkude liigne infiltreerumine ja aktiveerumine süvendab kudede vigastusi, põhjustades turset (vaskulaarset eksudatsiooni) ja valu, mis on hästi tuntud põletikunähtused.

TNF- on oluline tegur lämmastikoksiidi süntaasi (iNOS) geeniekspressiooni indutseerimiseks mitmes rakuliinis. iNOS-i aktiveerimine põhjustab lämmastikoksiidi (NO) tootmist, mis mitte ainult ei moduleeri mitmeid füsioloogilisi funktsioone, nagu bakteritsiidne ja vasodilatatsioon, vaid põhjustab ka põletikku. Pärast koekahjustust tekitab rakumembraani fosfolipiidide lagunemine fosfolipaaside toimel arahhidoonhapet. Arahhidoonhape laguneb edasi tsüklooksügenaasi (COX) toimel prostaglandiinideks (PG). COX-II poolt moodustatud PGE2 liigne kogus kutsub esile mitmeid tsütokiine põletiku tekkeks. Kuna nii NO kui ka PGE2 toimivad peamiste põletiku ja valu esilekutsuvate teguritena, on TNF- –NO ja COX-II-PGE2 rajad põletikulise protsessi peamised voolud, mida inhibeerivad kortikosteroidid ja mittesteroidsed ravimid.põletikuvastased ravimid(MSPVA-d).

Kuigi on olemas mitmeid steroide ja mittesteroidseid põletikuvastaseid ravimeidpõletikuliste haiguste raviNeed ravimid võivad avaldada kahjulikku mõju immuunsüsteemile, seedetraktile, neerudele, maksale, kesknärvisüsteemile, vererõhule ja kardiovaskulaarsüsteemile. Seetõttu on vaja minimeerida keemiliste ravimite kahjulikke mõjusid, asendades need või kasutades neid koos looduslike toodetega.

Fukoidaani, sulfaatpolüsahhariidide kompleksi merevetikatest, nagu Laminaria japonica ja Cladosiphon okamuranus, mis on laialt levinud paljudes riikides, on idamaade meditsiinis pikka aega kasutatud terapeutiliste ainetena. Varasemates uuringutes on näidatud, et fukoidaanil on antioksüdatiivne, antikoagulatiivne, vähivastane japõletikuvastased tegevused. Sellest tulenevalt köidab uurijate tähelepanu fukoidaani kasulik mõju põletikulistele haigustele, isheemiale, immuunpuudulikkusele ja kasvajatele. Teiselt poolt,Cistanche tubulosa(CT) on Hiinas laialdaselt kasutatud ka traditsioonilise ravimina. Teatati, et CT ekstraktid vähendavad TNF-á ja IL- 4 tootmist, mis on põletikulistes radades NO tootmise peamised tegurid [19].

Sellised varasemad leiud ajendasid meid uurima fukoidaani ja CT ekstrakti kombineeritud efektiivsust kahel peamisel põletikuteel. Toimemehhanismi selgitamiseks analüüsisime karrageenist põhjustatud õhukotipõletiku eksudaatides NO ja PGE2.

LOODUSLIK KISTANSITUBULOOS VÄLTIMISEKSPÕLETIKUD TEGEVUSEDPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materjalid ja meetodid

Materjalid

CT poolpuhastatud fukoidaan ja veeekstrakt saadi firmast Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fukoidaani ja CT ekstrakti hoiti 4 kraadi juures, segati (1:3) lahustatuna puhastatud vees enne kasutamist ja manustati suukaudselt mahus 5 ml/kg.

Rakukultuur ja NO kvantifitseerimine

Hiire makrofaagi RAW 264.7 rakuliin osteti ettevõttest American Type Culture Collection (Manassas, USA) ja kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (Sigma, St. Louis, USA), mis sisaldas 10% veise loote seerumit ja antibiootikume [100 U/ml penitsilliini (Sigma) ja 100 µg/ml streptomütsiini (Sigma)]. Rakke inkubeeriti niisutatud 5% CO2 atmosfääris temperatuuril 37 °C.

Et hinnata fukoidaani ja CT ekstrakti mõju NO sekretsioonile, inkubeeriti RAW 264.7 rakke (1 × 106 rakku/ml) 5 minutit fukoidaani või CT ekstraktiga (1–320 µg/ml) seejärel interferoon- (IFN-, 10 U/mL) ja lipopolüsahhariid (LPS, 10 µg/mL) 24 tunni jooksul. Meie esialgsetes uuringutes kinnitati, et töötlemine IFN-pluss LPS-iga RAW 264.7 rakkude aktiveerimiseks ei mõjutanud rakkude elujõulisust kuni 24 tunni jooksul ning et fukoidaan ja CT ekstrakt ei olnud tsütotoksilised kuni 1 mg/ml. NO indikaatorina mõõdeti NO oksüdeerunud produkti nitriti (NO2 – ) kontsentratsiooni. Kultuurikeskkond segati võrdse koguse Griessi reagendiga (1% sulfaniilamiid, 0,1% naftüületüleendiamiin 2,5% fosforhappes) [21] ja inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit. Nitriti kontsentratsiooni analüüsiti 540 nm juures, kus standardkõvera loomiseks kasutati NaNO2.

Loomad ja ravi

Isased ICR-hiired (7-nädalased) osteti ettevõttest Daehan Biolink (Eumseong, Korea) ja neid hoiti püsivate keskkonnatingimustega ruumis (22±2ºC; suhteline õhuniiskus 40-70%; 12-tunnine valgustus). -tume tsükkel; 150-300 luksi heledus). Pelletite sööt ja puhastatud vesi olid saadaval ad libitum. Kõik loomkatsed kiitis heaks Korea Chungbuki riikliku ülikooli (CBNU) institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) ja need viidi läbi vastavalt CBNU laboratoorsete loomade uurimiskeskuse standardsetele tööprotseduuridele (SOP).

Hiiri (n=8/rühm) raviti suukaudselt fukoidaaniga (18 või 54 mg/kg), CT ekstraktiga (54 või 162 mg/kg) või nende seguga (18+54, {{6). }} või 90+270 mg/kg) üks kord päevas 7 päeva jooksul. Fukoidaani (18 mg/kg) ja CT-ekstrakti (54 mg/kg) väikesed doosid pärinesid hinnangulistest inimese annustest 100 mg/keha kohta (70 kg) ja 300 mg/keha kohta pärast kehamassi pindala translatsiooni (Km{14). vastavalt }} inimese/km=3 hiire jaoks). Fukoidaani ja CT ekstrakti suured annused määrati 3-kordseks, eraldi või segus, ja suurima annusega segu fikseeriti 5-kordseks, et hinnata maksimaalset sünergistlikku mõju.

Fukoidaani ja CT ekstraktiga töötlemise esimesel päeval süstiti hiirtele tagaküljele subkutaanselt 10 ml steriilset õhku, et moodustada kott [22, 23]. 2 ja 5 päeva pärast süstiti kotti uuesti 5 ml õhku. Üks tund pärast viimast töötlemist süstiti kotti 1 ml karrageeni (1% soolalahuses; Sigma) või selle kandjat (soolalahus).

Eksudaatide analüüsid

Õhukotti pesti 1 ml külma soolalahusega 6 tundi pärast karrageeni süstimist ja registreeriti loputusvedeliku kogumaht. Põletikuliste rakkude, neutrofiilide, monotsüütide ja lümfotsüütide koguarv määrati Coulteri loenduri abil. NO ja PGE2 kontsentratsioonid määrati Griessi reagendi (Sigma) ja ensüümi immuunanalüüsi (EIA) abil, kasutades vastavalt Correlate-EIA komplekti (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

LOODUSLIK TUBULOOS PÕLETIKURAKU KEMOTAKSISE TOIMINGU tõkestamise jaoks PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatoloogiline uuring

Kotikesta kude eemaldati ja fikseeriti neutraalses formaliini lahuses. Parafiiniga manustatud koeslaidid värviti hematoksüliin-eosiiniga ja neid uuriti valgusmikroskoobi all põletikuliste kahjustuste suhtes.

Statistiline analüüs

Tulemused on esitatud keskmisena ± SE. Eksperimentaalsete rühmade võrdlus viidi läbi ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes Tukey testi parandus. AP väärtus<0.05 was considered statistically significant.

Tulemused

In vitro suurendas RAW 264.7 rakukultuur, IFN- ja LPS-ravi oluliselt NO tootmist (joonis 1). Eeltöötlus fukoidaaniga (1–320 µg/ml) ei mõjutanud NO vabanemist makrofaagide rakuliinist (joonis 1A). Võrdluseks, CT ekstrakt (32–320 µg/ml) pärssis märkimisväärselt NO tootmist, mis viitab põletikuvastasele toimele (joonis 1B).

Karrageeni süstimine hiire õhukotti suurendas märgatavalt eksudaadi mahtu kotis (joonis 2). Sellist suurenenud eksudatsiooni nõrgendas töötlemine fukoidaani (18 mg/kg) ja CT ekstraktiga (54 ja 162 mg/kg). Eelkõige vähendas fukoidaani ja CT ekstrakti kombineeritud töötlemine eksudaatide mahtu veelgi võrreldes individuaalse toimega, kuigi suuremate annuste kombinatsioonid (54+162 mg/kg ja 90+270 mg/kg) ei näidanud täiendavat efektiivsust. madalaima annuse kombinatsioonini (18+54 mg/kg) (joonis 2A). N-kraadine sisaldus kotis suurenes drastiliselt ka pärast karrageeni süstimist (joonis 2B). Võrreldes fukoidaani kerge toimega alandas CT ekstrakt märkimisväärselt N-kraadi kontsentratsiooni. Fukoidaani ja CT ekstrakti kombineeritud ravi vähendas NO taset veelgi annusest sõltuval viisil. Samamoodi surus suurenenud PGE2 sisaldust sünergistlikult alla fukoidaani ja CT ekstrakti kombineeritud ravi (joonis 2C).

Paralleelselt kotikeses olevate põletikuliste vahendajatega suurenes karrageeni süstimisel järsult põletikuliste rakkude arv: neutrofiilide, monotsüütide ja lümfotsüütide kontrolltasemetest vastavalt 37,8, 4,8 ja 24,1 korda (tabel 1). Kuid fukoidaan ja CT ekstrakt vähendasid oluliselt põletikuliste rakkude infiltratsiooni, milles fukoidaan oli mõnevõrra parem kui CT ekstrakt. Fukoidaani ja CT ekstrakti koosmanustamisel ei saavutatud ootamatult sünergistlikku toimet põletikuliste rakkude infiltratsioonis.

Nagu järeldati põletikuliste rakkude infiltratsioonist eksudaatides, ilmnesid õhukotte ümbritsevas nahaaluses koes tõsised põletikulised kahjustused (joonis 3). Karrageeniga kokku puutunud paksenenud nahaaluses koes täheldati tohutult palju rakke (joonis 3B), võrreldes kontroll-loomade normaalsete omadustega (joonis 3A). Selliseid põletikulisi kahjustusi nõrgendas märkimisväärselt fukoidaani (joonised 3C ja 3D) või CT ekstraktiga (joonised 3E ja 3F) töötlemine.

Eelkõige saadi fukoidaani ja CT ekstraktiga kombineeritud ravi korral suurem põletikuvastane toime (joonised 3G-3I).

Arutelu

Kasutades in viv-kraadise arragenaani poolt indutseeritud õhukotipõletiku mudelit, kutsub õhu süstimine näriliste selga esile rakkude proliferatsiooni, mis kihistuvad õõnsuse pinnal, moodustades sünoviumiga sarnase struktuuri. Selles mudelis suurendas karrageenist põhjustatud põletikuliste rakkude infiltratsiooni süstimine eksudaati, mis viitab veresoonte lekkele. Õhukott toimib põletikurakkude ja vahendajate reservuaarina, mida saab lokaalselt kogunevas vedelikus kergesti mõõta.

Erinevate põletikuliste vahendajate hulgas, mis võivad indutseerida veresoonte läbilaskvust, on hästi teada, et NO ja PGE2 on paljude põletikuliste haiguste patogeneesis peamised tegurid. Neid tuntakse ka valu esilekutsumise ja tajumise vahendajatena. iNOS, mida ekspresseeritakse ja aktiveeritakse erinevates rakutüüpides, stimuleerides põletiku ajal TNF- ja/või LPS-iga, tekitab kõrgeid püsivaid NO kontsentratsioone. NO on oluline reguleeriv molekul mitmesugustes füsioloogilistes funktsioonides, nagu vasodilatatsioon, mis põhjustab veresoonte leket. PGE2, mis tekib arahhidoonhappest COX-ide kaudu, aitab kaasa paljude põletikuliste haiguste tekkele ning PGE2 ületootmine vastuseks erinevatele põletikulistele stimulatsioonidele on seotud COX-II taseme ülesreguleerimise ja põletiku progresseerumisega. Seetõttu on TNF- - NO ja COX-II-PGE2 radasid peetud kaheks peamiseks põletikuliste protsesside vooluks, mida blokeerivad vastavalt iNOS (kortikosteroidid) ja COX (MSPVA-d) inhibiitorid.

LOODUSLIK TUBULOOS PÕLETIKUHAIGUSTE KEELUSTAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Käesolevas uuringus vähendas fukoidaani ja CT ekstrakti koosmanustamine eksudaadi mahtu kotis, mis viitab sellele, et neil on veresoonte lekke vastu pärssiv toime (joonis 2A). Võrreldes iga fukoidaani ja CT-ekstrakti individuaalsete mõjudega, suurenes kombineeritud ravi veelgi, mis tähendab, et kahe astme komponendid toimivad sünergiliselt. Selliseid sünergistlikke mõjusid fukoidaani ja CT ekstrakti vahel toetas nende tegevus NO ja PGE2 tasemetel eksudaatides (joonised 3B ja 2C).

Huvitaval kombel kinnitati aga, et fukoidaan ei inhibeeri otseselt makrofaagide aktiveerimist in vitro testis (joonis 1A). Samamoodi oli fukoidaani inhibeeriv potentsiaal NO ja PGE2 akumulatsiooni in vivo testis suhteliselt madalam kui CT ekstraktil (joonised 2B ja 2C). Selline fukoidaani toimemehhanism erineb rakkude otsesest inaktiveerimisest CT ekstraktiga (joonis 1B). Võrdluseks, fukoidaanil oli kõrge efektiivsus põletikuliste rakkude infiltratsiooni pärssimisel kotikestes (tabel 1). Fukoidaan oli parem kui CT ekstrakt, blokeerides neutrofiilide, monotsüütide ja lümfotsüütide migratsiooni karrageenist põhjustatud koekahjustuse kohtadesse. Huvitaval kombel puudus sünergistlik migratsioonivastane toime, mis viitaks fukoidaani ja CT ekstrakti erinevatele toimemehhanismidele: st fukoidaan blokeerib põletikuliste rakkude infiltratsiooni, samas kui CT ekstrakt pärsib rakkude aktivatsiooni.

Polümorfonukleaarsed rakud, eriti neutrofiilid, on peamised rakukomponendid, mis värvatakse karrageeni poolt indutseeritud ägedatesse põletikulistesse kohtadesse. Lisaks mängivad põletikulises protsessis keskset rolli ka järgnevad põletikulised rakud, nagu makrofaagid ja lümfotsüüdid, eritades tsütokiine. Fukoidaani või CT-ekstraktiga eeltöötlemisel vähenes karrageeniga süstitud õhukottidesse migreerunud valgete vereliblede arv märkimisväärselt. See tulemus oli kooskõlas kortikosteroidide, nagu deksametasooni, toimega, kuid mitte MSPVA-dega, sealhulgas indometatsiiniga. Seetõttu eeldatakse, et fukoidaanil ja CT-ekstraktil on osaliselt steroidsed omadused.

Lisaks põletikuliste rakkude kemotaksist blokeerivale toimele näis CT ekstrakt pärssivat makrofaagide aktivatsiooni. Seda kinnitas selle inhibeeriv toime NO-le in vitro ja in vivo, mis on peamine makrofaagide poolt toodetud põletikuline vahendaja. Seega võib CT ekstrakti mõju makrofaagidele olla tingitud mRNA ekspressiooni pärssimisest ja/või iNOS-i aktiivsuse otsesest pärssimisest nendes rakkudes.

PGE2 on ka üks peamisi põletikumediaatoreid. See suureneb paralleelselt kudede tursega, mida pärsivad mittesteroidsed põletikuvastased ravimid, COX-i inhibiitorid. Karrageen võib suurendada PGE2 tootmist, indutseerides kotieksudaadis COX-II mRNA ja COX-II valku. Selles mudelis suurendas karrageen märkimisväärselt PGE2 kogust ja CT ekstrakti vähendas seda oluliselt. Huvitav on märkida, et see tulemus oli kooskõlas NSAID-i indometatsiiniga saavutatava toimega. Seetõttu järeldatakse tulemuste põhjal, et CT ekstraktil on MSPVA-de lisaomadusi. Kokkuvõttes arvatakse, et CT ekstrakt avaldas karrageenist põhjustatud põletikumudelis nii kortikosteroidi kui ka MSPVA-sarnaseid toimeid ja et fukoidaan suurendasCT ekstrakti põletikuvastane toimeblokeerides põletikuliste rakkude infiltratsiooni.

Kuigi täpse toimemehhanismi määratlemine nõuab täiendavat uurimist, nõrgendas fukoidaani ja CT ekstrakti segu märkimisväärselt põletikunähte, blokeerides TNF-NO ja COX-II-PGE2 radu karrageenist põhjustatud õhukotipõletiku korral. Need leiud annavad tõendeid selle kohta, et fukoidaani ja CT ekstrakti kombineeritud ravi võib olla paljutõotav kandidaat kortikosteroididele või MSPVA-dele reageerivate erinevate põletike leevendamiseks.

LOODUSLIK TUBULOOS PÕLETIKUHAIGUSTE KEELUSTAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%