Swertiajaponiin pärsib naha pigmentatsiooni kahe mehhanismi abil, et supresseerida türosinaasi 2. osa

Cistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent on tsistanosiid, millel on erinevad toimed, nagu antioksüdant, põletikuvastane ja immuunfunktsiooni edendav toime. Tsistanche ja naha valgendamise vaheline mehhanism seisneb cistanche glükosiidide antioksüdantses toimes.

Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsib türosinaas ja oksüdatsioonireaktsioon eeldab hapniku osalemist, mistõttu kehas olevad hapnikuvabad radikaalid muutuvad oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks.Cistanchesisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, pärssides seega melaniini tootmist.

Naha valgendamise parandamiseks klõpsake valikul Cistanche Tubulosa

Küsi lisa:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Lisaks,cistancheSamuti on funktsioon soodustada kollageeni tootmist, mis võib suurendada naha elastsust ja läiget ning aidata parandada kahjustatud naharakke.

CistancheFenüületanool Glükosiididel on türosinaasi aktiivsust märkimisväärne allareguleeriv toime ning mõju türosinaasile on konkureeriv ja pöörduv inhibeerimine, mis võib anda teadusliku aluse Cistanche valgendavate koostisosade väljatöötamiseks ja kasutamiseks.

Seetõttucistancheomab võtmerollinaha valgendamine. See võib pärssida melaniini tootmist, et vähendada värvimuutust ja tuhmust; ja soodustavad kollageeni tootmist, et parandada naha elastsust ja sära. Tänu cistanche'i nende mõjude laialdasele tunnustamisele on paljud nahka valgendavad tooted hakanud lisama taimseid koostisosi, nagu Cistanche, et rahuldada tarbijate nõudlust, suurendades seeläbi Cistanche'i kaubanduslikku väärtust nahka valgendavates toodetes.

Kokkuvõttes on tsistanši roll naha valgendamisel ülioluline. Selle antioksüdantne toime ja kollageeni tootv toime võivad vähendada värvimuutust ja tuhmust, parandada naha elastsust ja läiget ning seeläbi saavutadavalgendav toime. Samuti näitab Cistanche laialdane kasutamine nahka valgendavates toodetes, et selle rolli kaubanduslikus väärtuses ei saa alahinnata.

Swertiajaponiin inhibeerib UVB-indutseeritud MAPK aktivatsiooni

On näidatud, et oksüdatiivne stress stimuleerib melanogeneesi mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF) ülesreguleerimise teel, mis on türosinaasi geeniekspressiooni esilekutsuv transkriptsioonifaktor [4, 14]. Uurisime, kas swertiajaponiini antioksüdatiivne toime võib reguleerida MITF-i aktiivsust. Western blot analüüsi andmed näitasid, et UVB kokkupuude suurendas fosforüülitud MITF-i, MITF-i aktiivset vormi, samas kui swertiajaponiiniga töötlemine 10 μM juures vähendas seda (joonis 6A). Järjekindlalt vähendas swertiajaponiinravi UVB-vahendatud türosinaasi valgu taseme tõusu (joonis 6A). Kuna on näidatud, et oksüdatiivne stress aktiveerib MITF-i mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) [15, 16] kaudu, uuriti, kas swertiajaponiin suudab kontrollida MAPK signaaliülekannet. UVB kokkupuude suurendas dramaatiliselt ERK, JNK ja p38 fosforüülimist (joonis 6B), mis on seotud UVB-indutseeritud ROS ja ONOO tootmisega B16F10 rakkudes (joonis 5C- 5D). Ainult 10 μM swertiajaponiiniga töötlemine vähendas MAPK-de valgu taset (joonis 6B). See tulemus on kooskõlas swertiajaponiini antioksüdatiivse aktiivsusega, kuna UVB-indutseeritud raku oksüdatiivse stressi vähenemine oli selge ainult 10 μM swertiajaponiini juures (joonis 5C-5D).

Kuigi swertiajaponiin on Jaapani ravimina kasutatud kogu Swertia japonica ürdi peamine ühend, ei näidanud meie uuring veenvaid tõendeid swertiajaponiini ohutuse kohta inimese nahale kandmisel. Kuid swertiajaponiin ei avaldanud meie katsekeskkonnas tsütotoksilisust Hs27 (inimese fibroblasti), HaCat (inimese keratinotsüüdid) ja B16F10 (hiire melanoom) rakuliinides. Veelgi enam, kui swertiajaponiini töödeldi inimese nahamudelis kontsentratsioonidega, mis ei näidanud rakuliinides tsütotoksilisust, ei ilmnenud mikroskoopilise vaatluse põhjal nähtavaid tsütotoksilisuse märke, sealhulgas rakujäätmete moodustumist või rakkude eraldumist. Arvestades, et praegu saadaolevate nahka valgendavate ühendite peamised probleemid on ohutusprobleemid, on vaja täiendavaid in vivo uuringuid, et uurida nende ohutust füsioloogias.

Üheskoos inhibeeris swertiajaponiin melaniini akumuleerumist rahuldava piirini nii raku- kui ka inimese nahamudelites kahe mehhanismi abil, et suruda türosinaasi alla, seondudes otseselt türosinaasiga ja pärssides konkureerivalt ning pärssides oksüdatiivse stressi vahendatud MAPK / MITF signaaliülekannet (joonis 7). Arvestades teadaolevate nahka valgendavate ainete, nagu kojiinhape ja arbutiin [17], kahjulikke mõjusid ja pikaajalise efektiivsuse puudumist, võib swertiajaponiini naha pigmentatsiooni mahasurumiseks ohutumalt kasutada ja see oleks uudne lisand valgendava kosmeetika jaoks.

MATERJALID JA MEETODID

Türosinaasi aktiivsuse test, kasutades seene türosinaasi

Swertiajaponiin ja kojic hape (50 μM) laaditi 96-süvendiga mikroplaadile (Nunc, Taani) türosinaasi puhvris (200 μL), mis sisaldas seente türosinaasi (1000 U), 1 mM L-türosiini lahust ja 50 mM fosfaati. puhver (pH 6,5) [5]. Plaati inkubeeriti 37 kraadi juures 15 minutit ja dopakinooni hinnati spektrofotomeetriliselt (450 nm). Mõõtmise põhjal arvutati IC50 log-lineaarsete kõverate ja nende võrrandite abil.

Swertiajaponiini ja türosinaasi dokkimise simulatsioon

AutoDock Vina kasutati in silico valgu-ligandi dokkimise simulatsiooniks. Türosinaasi kolmemõõtmelist struktuuri kasutati Agaricus bisporuse kristallstruktuuris (PDB ID: 2Y9X). Türosiini eelmääratletud sidumissaiti rakendati dokkimistaskuna. Pärast türosinaasi ja swertiajaponiini või kojhappe vahelise dokkimissimulatsiooni teostamist kasutati LigandScout 3.0 tarkvara erinevate ühendite ja türosinaasi vaheliste seondumisjääkide ennustamiseks.

Swertiajaponiini türosinaasi inhibeerimise kineetiline analüüs

L-DOPA valmistati kontsentratsioonides 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 ja 0,0625 mM ning swertiajaponiini valmistati 20, 40 ja 80 μM juures. Reaktsioonisegu lahus valmistati 96-süvendiga plaadil, milles oli 20 μL türosinaasi substraati (L-DOPA), 10 μL seene türosinaasi vesilahust (200 U) ja 50 mM kaaliumfosfaatpuhvrit (pH). 6.5) lisati. Reaktsioonisegu dopakroomi tootmiskiirust mõõdeti mikroplaadilugeja abil lainepikkusel 450 nm. Seejärel arvutati swertiajaponiini türosinaasi inhibeerimise määr, kasutades Lineweaver-Burki graafiku analüüsi. Michaelise konstant (Km) ja maksimaalne kiirus (Vmax) arvutati ka Lineweaver-Burki graafikute abil erinevate L-DOPA substraadi kontsentratsioonidega [3].

Rakukultuuri ja elujõulisuse test

B16F10 melanoomirakud osteti Korea Cell Line Bankist. Rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), mis sisaldas 5 protsenti veise loote seerumit (FBS) ja 1 protsenti penitsilliini, streptomütsiini, L-glutamiini ja naatriumpüruvaati. Rakke hoiti temperatuuril 37 kraadi niisutatud 95% õhu/5% CO2 atmosfääris. Rakkude elujõulisuse testi jaoks külvati rakud 96-süvendiga plaatidele. B16F10 melanoomirakke töödeldi swertiajaponiiniga erinevates kontsentratsioonides 48 tundi. Igasse süvendisse lisati Ez-Cytox (10 μL) ja inkubeeriti 2 tundi. Moodustunud formatsaani kristalle mõõdeti spektrofotomeetriliselt 450 nm juures. Rakkude elujõulisus arvutati, kasutades kontrollrühmana rakke ilma swertiajaponiiniga töötlemata.

Melaniini sisaldus B16F10 rakkudes

Melaniini taset mõõdeti eelnevalt kirjeldatud meetodil väikeste muudatustega [18]. B16F10 rakkudel lasti kasvada 70-80 protsendini konfluentsusse 6-süvendiga plaatidel. Rakke töödeldi swertiajaponiini või kojhappega 2 tundi. Seejärel töödeldi MSH või UVB swertiajaponiini või kojhapet sisaldava söötmega ja inkubeeriti veel 48 tundi. Pärast PBS-ga pesemist eraldati rakud trüpsiini abil ja lahustati 90 µl 1 N NaOH lahuses, mis sisaldas DMSO-d (5 protsenti). Pärast 1-tunnist inkubeerimist 60 kraadi juures määrati melaniini sisaldus neeldumise mõõtmisega 405 nm juures. B16F10 rakkude UVB eksponeerimiseks kasutati kaubanduslikult saadavat UV-kambrit (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea).

Western blotting

B16F10 rakkudest eraldatud valguproovid (30 ug) eraldati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga, kasutades 10-12 protsenti akrüülamiidgeele, ja kanti üle polüvinülideenfluoriidmembraanidele, mis seejärel asetati kohe blokeerimispuhvrisse ( 5% rasvavaba piima) 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl ja 0,1% Tween 20 lahuses. Membraani pesti TBS-Tween puhvris 30 minutit ja inkubeeriti seejärel spetsiifiliste primaarsete antikehadega (1:1{). {24}} lahjendus), mis on näidatud joonistel üleöö temperatuuril 4 kraadi. Pärast TBS-Tween puhvriga pesemist inkubeeriti membraani mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud hiirevastase antikehaga (Santa Cruz, 1:10, 000), küülikuvastase antikehaga (Santa Cruz, 1:10, 000) või kitsevastast antikeha (Santa Cruz, 1:10 000) temperatuuril 25 kraadi 1 tund. Immunoblotid visualiseeriti, kasutades Western Bright Peroxide lahust (Advansta, CA, USA) ja ChemiDoc Touch pildistamissüsteemi (Bio-Rad, USA) vastavalt tootja juhistele. Selles uuringus kasutatud antikehad on järgmised: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), türosinaas (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{{40) }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Cell Signaling-921L), p38 (Cell Signaling-9212S), pERK (Cell Signaling-4370L ), ERK (Cell Signaling-9201L), pJNK (Cell Signaling-9251L), JNK (Cell Signaling-9252S) ja -actin (Santa Cruz-47778) .

ROS- ja ONOO-tasemete mõõtmine

Swertiajaponiini antioksüdatiivset aktiivsust uuriti, kasutades ROS-i jaoks fluorestseeruvat 2,7-diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaati (DCFDA) ja ONOO- jaoks dihüdrorodamiini (DHR) 123. Lühidalt, ROS taseme määramiseks lisati rakuhomogenaatidele DCFDA (25 μM) lõppmahuks 250 ul. ONOO-taseme mõõtmiseks lisati rodamiini lahusele 10 ul rakuhomogenaate (50 mM naatriumfosfaatpuhver, 90 mM naatriumkloriid, 5 mM dietüleentriamiinpentaäädikhape [DTPA] ja DHR123). Mõlema testi puhul mõõdeti fluorestsentsi iga 5 minuti järel 30 minuti jooksul fluorestsentsplaadi lugejal, ergastuse ja emissiooni lainepikkused olid vastavalt 485 ja 530 nm.

Melaniini akumuleerumine inimese nahamudelis

Swertiajaponiini melanogeensevastase toime uurimiseks inimese nahamudelis kasutati elujõulist, taastatud, kolmemõõtmelist inimese epidermist (Neoderm-ME, Tego Science). Inimese nahamudelit töödeldi DMSO (vehiikul) või swertiajaponiiniga 1 tund ja kultiveeriti ettevõtte pakutavas hooldussöötmes 5 päeva DMSO või swertiajaponiiniga. Mikroskoopiline analüüs viidi läbi 1. kuni 5. päevani, et jälgida naha pigmentatsiooni. Mikroskoopilisi pilte analüüsiti Image J tarkvaraga, et kvantifitseerida naha tumenemine. Fontana-Massoni värvimiseks fikseeriti nahaproovid 4-protsendilises paraformaldehüüdis üleöö toatemperatuuril ja proove analüüsis kaubanduslikult saadav ettevõte (Garam Meditech, Lõuna-Korea).

Statistiline analüüs

Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Erinevaid rühmi võrreldi ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes Dunnetti järeltest. P < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

HUVIDE KONFLIKTID

Huvide konflikte deklareerida ei ole.

RAHASTAMINE

Seda tööd toetas Grant K17281 Korea Vabariigi haridus-, teadus- ja tehnoloogiaministeeriumi (MEST) Korea idamaise meditsiini instituudist.

VIITED

1. Bradford PT. Nahavähk värvilises nahas. Dermatol Nurs. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Keemilised ja instrumentaalsed lähenemisviisid hüperpigmentatsiooni raviks. Pigment Cell Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(benso[d]tiasool-2-üülamino)-5- (asendatud bensülideen)tiasool-4(5H)-ooni derivaadid kui uued türosinaasi inhibiitorid. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P jt. (Z)-5-(2,4-dihüdroksübensülideen)tiasolidiin- 2,4-dioon takistab UVB-indutseeritud melanogeneesi ja kortsude teket, pärssides HRM-is oksüdatiivset stressi{{7} } karvutud hiired. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR jt. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihüdroksüfenüül)tiasolidiin- 4-karboksüülhape takistab UV-indutseeritud kortsude teket, pärssides NF-kappaB-vahendatud põletikku. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Heterotheca flavonoolid hõlmavad: türosinaasi inhibeerivat toimet ja struktuurikriteeriume. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Imetajate türosinaasi metalli kofaktori sidumises ja stereospetsiifilise substraadi äratundmises osalevate aktiivse saidi jääkide tuvastamine. Mõju katalüütilisele tsüklile. Biokeemia. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoids as seen tyrosinase inhibitors: a fluorescence quenching study. J Agric Food Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoidderivaadid kui tugevad türosinaasi inhibiitorid – uuring hiljutiste leidude kohta vahemikus 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Swertia japonica koostisainete uuringud. II. Uue flavonoidi, swertiajaponiini isoleerimine ja struktuur. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Swertia japonica ekstrakti ja selle peamise ühendi swertiamariini mõju mao tühjenemisele ja seedetrakti motoorikale hiirtel. Fitoteraapia. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. 2-metüülnafto[1,2,3-de]kinoliin-8-one pärssiv toime melanosoomi transpordile ja naha pigmentatsioonile. Sci Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Flavonoidide roll oksüdatiivses stressis. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Pilliroo (Phragmites communis) noored lehed pärsivad melanogeneesi ja oksüdatiivset stressi B16F10 melanoomirakkudes. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signaalteed melanogeneesis. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Ampelopsis grossedentata dihüdromürtsetiin pärsib melanogeneesi MAPK, PKA ja PKC signaaliradade allareguleerimise kaudu. Chem Biol Interact. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Ganoderma formosanum mütseeli ekstrakt kui väga tugev türosinaasi inhibiitor. Sci Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimuleerib türosinaasi geeni ekspressiooni ja melanogeneesi diferentseerunud melanotsüütides. Pigment Cell Res. 2001; 14: 328-36.