Natalenamiidid A–C, termiitidega seotud tsüklilised tripeptiidid Actinomadura Sp. RB99

Abstraktne:

Viimastel aastatel on suurenenud putukatega seotud bakterite biokeemia uuringud. Kombineerituna analüütiliste dereplikatsiooniprotsessidega pakuvad need uuringud võimsa strateegia struktuurselt ja/või bioloogiliselt uudsete ühendite tuvastamiseks. Ribosomaalselt sünteesimata tsüklilistel peptiididel on lai bioaktiivsuse spekter ja kõrge meditsiiniline potentsiaal.

Siin teatame kolme uue tsüklilise tripeptiidi avastamisest: natalenamiidid A–C (ühendid 1–3). Need ühendid tuvastati seente kasvu termiitidega seotud Actinomadura sp. RB99, kasutades vedelikkromatograafia (LC)/ultraviolettkiirguse (UV)/massispektromeetria (MS) dereplikatsiooni meetodit. Uute ühendite (1–3) keemilised struktuurid määrati kindlaks kõikehõlmavate spektroskoopiliste meetodite, sealhulgas ühemõõtmeliste (1H ja 13C) ja kahemõõtmeliste (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) tuumamagnetiliste meetodite analüüsiga. resonantsspektroskoopia (NMR) koos kõrge eraldusvõimega elektropihustusionisatsiooni massispektromeetria (HR-ESIMS) andmetega. Uute ühendite absoluutsed konfiguratsioonid selgitati Marfey analüüsi abil. Tripeptiidide mitme bioaktiivsuse testiga avastasime, et ühend 3 avaldas olulist pärssivat toimet 3-isobutüül-1-metüülksantiini (IBMX) poolt indutseeritud melaniini tootmisele. Ühendi 3 toime oli sarnane kojichappe omaga – seda ühendit kasutatakse laialdaselt nahka valgendava toimega kosmeetilise materjalina.

Õiglane, sile ja õrn nahk on alati olnud idamaiste naiste eesmärk. Nahahooldustoodete valgendusainete uurimis- ja arendustegevus põhineb peamiselt türosinaasi aktiivsuse pärssimisel.

Benseeniringe või fenoolseid hüdroksüülstruktuure sisaldavatel ühenditel on potentsiaalne valgendav toime, nagu praegu tavaliselt kasutatav valgendav aine arbutiin, mis võib avaldada valgendavat toimet, pärssides türosinaasi aktiivsust.

Ja leidsime, et Cistanche deserticolal on valgendav toime. Cistanche deserticola peamine toimeaine, fenüületanoidglükosiidid, on omamoodi looduslik glükosiidiühend. Uuringud on näidanud, et fenüületanoidglükosiidid võivad pärssida türosinaasi aktiivsust ja melaniini tootmist inimese epidermise melanotsüütides ning neil on valgendav toime. agendi efektiivsus.

Click cistanche tubulosa ekstrakti pulber

Märksõnad:

seeni kasvatav termiit; Actinomadura sp.; tripeptiidid; natalenamiidid A–C; nahka valgendav toime.

1. Sissejuhatus

Põllumajandusputukate kaitsvate bakteriaalsete sümbiontide keemiline analüüs on viimastel aastatel pälvinud loodustoodete keemikute seas suurt tähelepanu [1–5]. Kasutades nüüdisaegseid tuumamagnetresonantsil (NMR)/massispektromeetrial (MS) põhinevaid dereplikatsiooniprotsesse ja ökoloogiliselt olulisi bioteste, on avastatud muljetavaldav hulk struktuurselt intrigeerivaid looduslikke tooteid, sealhulgas mitmeid ribosomaalselt sünteesimata tsüklilisi peptiide. mikroobsetest sümbiontidest [6]. Kõige silmapaistvamate näidete hulka kuuluvad seenevastane dentigerumütsiin, tsükliline depsipeptiid, mis on eraldatud seente kasvu-sipelgaga seotud Pseudonocardia sp. [7] ja gerumütsiinid A–C, piperaashapet kandvad tsüklilised depsipeptiidid, mis on tuvastatud Pseudonocardia sp. [8].

On näidatud, et tsüklilised peptiidid avaldavad laia valikut bioloogilisi toimeid, soodustades mitmeid sünteetilisi lähenemisviise nende farmakoloogiliselt paljulubavate struktuuride suhtes [9–12]. Praegu turustatakse ja kasutatakse kliinilistes keskkondades laialdaselt üle 40 tsüklilise peptiidravimi ning igal aastal tuleb turule keskmiselt umbes üks uus tsükliline peptiidravim [13].

Osana meie jätkuvatest püüdlustest tuvastada termiitidega seotud mikroobidest struktuurselt uudseid ja/või bioaktiivseid sekundaarseid metaboliite [14–17], keskendusime termiitidega seotud Actinomadura sp. RB99, isoleeritud seeni kasvatavast termiidist Macrotermes natalensis. Meie vedelikkromatograafia (LC) / ultraviolettkiirguse (UV) / massispektromeetria (MS) põhinev replikatsiooni strateegia andis potentsiaalselt uudsed bioaktiivsed looduslikud tooted. Selles uuringus kirjeldame kolme uue tsüklilise tripeptiidi, natalenamiidi A–C (ühendid 1–3, joonis 1) eraldamist ja keemilist identifitseerimist, kasutades LC/UV/MS-põhist dereplikatsioonimeetodit, samuti nende bioloogilisi hinnanguid tsütotoksilisuse suhtes. , põletikuvastased ja nahka valgendavad tegevused.

2. Tulemused ja arutelu

2.1. Vedelikkromatograafia (LC)/ultraviolettkiirguse (UV)/massispektromeetria (MS) põhinev ühendite 1–3 eraldamine

Actinomadura sp. RB99 eraldati termiiditöötaja (M. natalensis) pinnalt. Peaaegu täieliku 16S ribosomaalse ribonukleiinhappe (rRNA) järjestuse fülogeneetiline analüüs viitab sellele, et tüvi RB99 kuulub perekonda Actinomadura, mille lähim naaber on Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Rikastatud kultuuriekstraktide järgnev LC/UV/MS-põhine analüüs näitas iseloomulike UV-neeldumiste komplekti ainulaadsete lämmastikuaatomeid sisaldavate molekulaarsete ioonipiikidega.

Vastavate metaboliitide tuvastamiseks ja nende aktiivsuse uurimiseks viidi läbi suuremahuline fermentatsioon optimeeritud kasvutingimustega (100 agariplaati 2 l ISP2 agarilt, pH 6, 10 päeva temperatuuril 30 ◦C) ning kehtestatud töötlemis- ja eelpuhastusprotseduuri. rakendatud [17]. Järgnev LC-UV/MS-ga juhitud fraktsioneerimine ja korduv poolpreparatiivne kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia (HPLC) andsid tulemuseks kolm ainulaadse NMR/MS mustriga metaboliiti. Tegime kasvu- ja söötmeuuringuid, kasutades erinevaid soolasid (NaCl, KBr 1–3 protsenti) ja söötme koostisi (ISP1-6 sööde), et jäljendada looduslikku keskkonda ja stimuleerida metaboliitide tootmist, mis tõi kaasa ka kolme uue metaboliidid (vt lisajoonis S19).

2.2. Ühendite struktuurne selgitamine

Natalenamiid A (1) saadi amorfse pulbrina. Molekulaarvalemiks 1 määrati C19H25N3O5 naatriumliitunud molekulaarsest ioonist m/z juures 398,1691 [M pluss Na] pluss (arvutatud C19H25N3O5Na jaoks, 398,1692), kasutades positiivsete ioonide režiimi kõrge eraldusvõimega elektropihustus-ionomeetriat (HR). ESIMS) andmed. Infrapuna (IR) spekter näitas tugevat neeldumisriba 1670 cm−1 juures, mis viitab amiidrühmade olemasolule molekulis. Ühendi 1 1H NMR andmete üksikasjalik analüüs (tabel 1) näitas peptiidi skeleti tüüpilisi signaale, mis näitavad kahte metüülsignaali (δH 0,91 (3H, d, J=7).{29 }} Hz, H-3) ja 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), kolm metüleensignaali (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H) , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) ja 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), neli metiini signaali (δH 2,02 (1H) , m, H{70}}), 4,16 (1 H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1 H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) ja 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H-11)) ja viis kattuvat aromaatset prootonit (δH 7,18 (1H, m, H{96}}), 7,23 (2H, m, H{100}}/18) ja 7,24 (2H, m, H{105}}}/17)).

13C NMR spekter (tabel 1) näitas HSQC ja HMBC spektrite abil kokku 19 süsiniku resonantsi, mis vastutavad kahe metüülsignaali (δC 18,9 ja 19,9), kolme metüleensignaali (δC 27.0, 30,6 ja 38,8), üheksa metiini signaali (δC 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (×2) ja 130,6 (×2)), sealhulgas viis aromaatset süsinikku, üks olefiinne süsinik signaal (δC 138,8) ja neli karbonüülsüsiniku signaali (δC 173,2, 173,3, 174,8 ja 181,3). Koos ülaltoodud spektroskoopiliste andmetega näitas kahemõõtmelise (2D) NMR üksikasjalik kontroll (1H-1H COSY, HSQC ja HMBC katsed) kolme aminohappe olemasolu ühes: glutamaat (Glu), fenüülalaniin ( Phe) ja valiin (Val) (joonis 2). Nende aminohapete ühenduvus määrati H-1/C-5 ja C-19, H-11/C-10 ja C{ HMBC korrelatsioonidega. {50}} ning H-6/C-5 ja C-10 (joonis 2).

1 absoluutse konfiguratsiooni tuvastamiseks rakendati Marfey meetodit -H kordajate (C-1, C-6 ja C-11) stereokeemia määramiseks. 1 ja standardsete aminohapete (L/D-Glu, Phe ja Val) happelised hüdrolüsaadid derivatiseeriti 1-fluoro-2, 4-dinitrofenüül-5-L-alaniiniga amiid (L-FDAA). Järjestikku analüüsiti 1 ja standardsete aminohapete derivatiseeritud segu LC/MS abil, et uurida nende retentsiooniaega. Glu, Phe ja Val fragmentide absoluutsed konfiguratsioonid määrati L-vormideks, põhinedes L-FDAA derivaatide retentsiooniaegadel 1 võrreldes standardsete aminohapete omadega. Seega selgitati ühendi 1 struktuur joonisel 1 näidatud tsüklilise tripeptiidina.

Nataleenamiid B (2) eraldati amorfse pulbrina. Selle molekulaarvalem (C20H27N3O5) tuletati vesiniku ja naatriumiga adukteeritud molekulaarsete ioonide piikide põhjal 390,2032 [M pluss H] pluss (arvutatud C20H28N3O5 jaoks, 390,2029) ja 412,1849 [M pluss vastavalt Na] pluss (05 H27,08), 1H, 2,8. Võrreldes ühendi 1 molekulaarse valemi ja NMR spektriandmetega, näis, et ühendil 2 on peptiidi skeletis täiendav CH2 rühm. 2 ühemõõtmeliste (1D) (1H ja 13C NMR) ja 2D NMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC ja HMBC) spektrite põhjalik uurimine näitas kolme aminohappejäägi olemasolu: Glu, Phe ja Leu. (leutsiin). Nende aminohapete järjestus konstrueeriti H-1/C-6 ja C-20, H-12/C-11 ja C HMBC korrelatsioonide põhjal. -20 ning H-7/C-6 ja C-11 (joonis 2). 2 absoluutse konfiguratsiooni määramiseks viidi läbi Glu, Phe ja Leu jääkide derivatiseerimine L-FDAA-ga ja analüüsiti seejärel LC/MS abil. LC/MS andmetes tuvastati L-Glu, L-Phe ja L-Leu, võrreldes 2 L-FDAA derivaatide retentsiooniaegu standardsete aminohapete omadega. Seega määrati ühendi 2 keemiline struktuur joonisel 1 näidatud tsüklilise tripeptiidina.

Natalenamiidi C (3) positiivse režiimi HR-ESIMS andmed näitasid vesiniku ja naatriumiga liitunud molekulaarseid ioone 424,1870 [M pluss H] pluss (arvutatud C23H26N3O5 jaoks, 424,1872) ja 446,1694 [M pluss Na2N, C35O2 424.1692). See viitas sellele, et selle molekulvalem oli C23H25N3O5. 3 1D ja 2D NMR spektrite üksikasjalik analüüs näitas, et selle keemiline struktuur oli sarnane 2 omaga, välja arvatud see, et Leu oli asendatud Phe-ga 3-s. Kolme tuvastatud aminohappe ühenduvust punktis 3 kontrolliti HMBC korrelatsioonide abil. H-1/C-9 ja C-23, H-15/C-14 ja C-23 ning H-10/ C-9 ja C-14 (joonis 2). Rakendades Marfey meetodit ühendile 3, selgus, et -H kordajate (C-1, C-10 ja C-15) absoluutsed konfiguratsioonid on üks L-Glu ja kaks L. -Phe osad. Sellest lähtuvalt määrati 3 täielik struktuur, nagu on näidatud joonisel 1.

Natalenamiidid A–C on tritsüklilised peptiidid, mis on arvatavasti mitteribosomaalse päritoluga. Praegu on mitmeid bioaktiivseid tsüklilisi tripeptiide iseloomustatud kui looduslikke tooteid: tsütotoksilised 17-liikmelised tsüklilised tripeptiidid (nt OF4949 I–IV), mis on eraldatud Penicillium rugulose'st [18]; seenevastased sklerotoomiad A−K, identifitseeritud halotolerantsete bakterite fermentatsioonipuljongist [10]; ja antiproliferatiivne psührofiilne E, mis on eraldatud kahe merevetikatest pärineva Aspergillus perekonna seenetüve segakultuurist [19].

2.3. Ühendite bioloogiline aktiivsus 1-3

Kuna on teatatud, et tsüklilised peptiidid avaldavad laia valikut bioloogilisi toimeid, hinnati isoleeritud tsükliliste tripeptiidide ({{0}}) bioloogilisi toimeid kolme bioaktiivsuse abil. Ühendite 1-3 tsütotoksilisust uuriti nelja vähirakuliini (MCE7 rinnavähirakud, HeLa emakakaelavähirakud, A549 inimese kopsuvähirakud ja HepG2 maksavähirakud) erinevatel kontsentratsioonidel (0, 6,25) , 12,5, 25, 50 ja 100 uM). Ühend 1 ei mõjutanud MCF-7, HeLa ega A549 rakkude elujõulisust. Kuid HepG2 rakkude töötlemine 100 M ühendiga 1 vähendas rakkude elujõulisust 78,5 pluss 3,2 protsendini (joonis 3). Ühend 2 vähendas HeLa ja A549 rakkude elujõulisust vastavalt 82.9  2.1 protsendini ja 73.5=3.0 protsendini, kuid ei mõjutanud MCF-7 või rakkude elujõulisust. HepG2 rakud (joonis 3). Ühend 3 ei mõjutanud ühegi rakuliini elujõulisust (joonis 3).

Järgmisena kasutati eraldatud ühendite põletikuvastase toime uurimiseks RAW264.7 makrofaage. Rakkude ellujäämismäärade muutumisest põhjustatud vigade kõrvaldamiseks NO tootmisel uuriti iga ühendi mittetoksilisi kontsentratsioone. Nagu on näidatud joonisel 4, oli ühenditel 1–3 vähe tsütotoksilisi toimeid RAW264.7 rakkudes (joonis 4A–C) ja neil ei olnud inhibeerivat toimet NO tootmisele lipopolüsahhariidiga (LPS) stimuleeritud RAW264.7 rakkudes (joonis 4D–F). .

Ühendite 1–3 inhibeerivat toimet melaniinisisaldusele B16F10 rakkudes uuriti nende nahka valgendava toime tõendina (joonis 5). Kuna muutused rakkude elujõulisuses põhjustavad melaniini tootmisel ja mõõtmisel vigu, uurisime esmalt ühendite 1–3 mõju B16F10 rakkude ellujäämisele. Ühendid 1–3 ei avaldanud tsütotoksilist toimet B16F10 rakkudes ühelgi kasutatud kontsentratsioonil (joonis 5A–C). Seejärel hindasime ühendite pärssivat toimet 3-isobutüül-1-metüülksantiini (IBMX) poolt indutseeritud melaniini tootmisele B16F10 rakkudes (joonis 5D–F). IBMX, hästi tuntud melanogeneesi stimulaator, indutseerib melaniini produktsiooni märkimisväärset suurenemist pärast ühekordset ravi melanoomirakkudes. Hinnatud ühendite hulgas avaldas ühend 3 (5–100 uM) annusest sõltuval viisil olulist pärssivat toimet IBMX-vahendatud melaniini sünteesile. Kojichapet, meie positiivset kontrolli, on laialdaselt kasutatud nahka valgendava toimega kosmeetilise materjalina [20]. Ühendi 3 inhibeeriv toime IBMX-i indutseeritud melaniini tootmisele oli sarnane kojhappe omaga (joonis 5F), mis viitab sellele, et ühend 3 toimib B16F10 melanoomirakkudes IBMX-indutseeritud melaniini tootmise tugeva inhibiitorina.

Lisaks oli ühend 3 saastunud väikese arvu lisanditega, mis määrati NMR-spektroskoopiliste andmete ja LC / MS analüüsi tõlgendamisel rasvhapete analoogideks (täiendavad materjalid, joonised S11–S15 ja S23). Lisandite aktiivsuse tuvastamiseks viidi läbi täiendavad katsed rasvhapete analoogidega nende pärssiva toime kohta IBMX-i indutseeritud melaniini tootmisele B16F10 rakkudes, mis näitas, et testitud ühenditel ei olnud valgendavat toimet (täiendavad materjalid, joonis S24). Seega, kuigi me ei saa välistada, et ühendi 3 lisandid põhjustavad IBMX-i indutseeritud melaniini tootmist pärssivat toimet, tundub see ebatõenäoline.

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Üldised katseprotseduurid

Infrapunaspektrid saadi Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA) spektromeetriga. Elektropihustusionisatsioon ja HR-ESIMS spektrid mõõdeti SI-2/LCQ DecaXP vedelikkromatograafia (LC)-massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). NMR spektrid, sealhulgas 1H–1H COSY, HSQC ja HMBC katsed, viidi läbi Varian UNITY INOVA 800 NMR spektromeetriga (Varian, Palo Alto, CA, USA), mis töötas sagedustel 800 MHz (1H) ja 200 MHz (13C), kusjuures keemilised nihked ppm-des (δ). Ettevalmistavas HPLC-s kasutati Waters 1525 binaarset HPLC pumpa koos Waters 996 fotodioodide massiividetektoriga (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Kolonnkromatograafias kasutati silikageeli 60 (230–400 mešši, Merck, Kenilworth, NJ, USA) ja silikageeli RP-C18 (230–400 mešši, Merck). Poolpreparatiivses HPLC-s kasutati Shimadzu Prominence HPLC süsteemi koos SPD-ga{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultraviolettkiirgusega nähtavad (UV-Vis) detektorid (Shimadzu, Tokyo, Jaapan). LC/MS analüüsid viidi läbi Agilent 1200 seeria HPLC süsteemiga (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), mis on varustatud dioodimassiivi detektoriga ja 6130-seeria ESI massispektromeetriga koos analüütilise Kinetexiga (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Õhukeste jaoks kasutati Mercki eelnevalt kaetud silikageeli F254 plaate ja RP-18 F254s plaate kihtkromatograafia (TLC) Laigud tuvastati TLC abil UV-valguses või kuumutamisel pärast pihustamist anisaldehüüdi-väävelhappe lahusega.

3.2. Mikroobne materjal

Actinomadura sp. RB99 eraldati perekonda M. natalensis kuuluva termiiditöötaja (koloonia Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) pinnalt 2. jaanuaril{ {13}}10. Biomaterjal asetati puhastesse kilekottidesse ja töödeldi ühe päeva jooksul pärast kogumist. Termiite pesti steriilses deioniseeritud vees ja bakterid isoleeriti, külvades saadud suspensioonid kitiiniga madala toiteväärtusega söötmele (liitri kohta: 4 g kitiini, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g). KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 ja 20 g agar) [21]. Actinobakteritaolise morfoloogiaga isolaadid kanti üle ISP2 agarile (liitri kohta: 10 g linnaseekstrakti, 4 g pärmiekstrakti, 4 g glükoosi ja 20 g agarit) ja kultiveeriti, kuni saadi puhtad isolaadid.

3.3. DNA ekstraheerimine ja polümeraasi ahelreaktsiooni võimendamine

Actinomadura sp. RB99 kasvatati toitaineterikkas vedelsöötmes ISP2 viis kuni seitse päeva temperatuuril 30 ◦C. Rakud koguti ja genoomne DNA ekstraheeriti GenJeti genoomse DNA puhastuskomplekti (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) abil, järgides tootja juhiseid järgmiste muudatustega: (a) lüsosüümravi pikendati 40 minutini ja (b) proteinaas K-ravi pikendati 40 minutini. DNA kvantifitseeriti fotomeetriliselt, kasutades spektromeetrit Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Fülogeneetiliste uuringute jaoks amplifitseeriti 16S rRNA geen, kasutades praimerite komplekti 1492R/27F. Iga amplifikatsioonireaktsioon valmistati 25 µl lõppreaktsiooni mahus, mis sisaldas 7,25 µL destilleeritud vett, 5 µL HF puhvrit, 5 µL iga praimerit (2,5 µM), {{10}},5 µL dNTP-sid. (10 µM), 0,25 µl Phusion High-Fidelity DNA polümeraasi (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) ja 2 µl ekstraheeritud DNA-d (matriits). Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) viidi läbi järgmistel tingimustel: 98 ◦C 38 sekundit; 32 tsüklit 98 ◦ 30 s, 52 ◦ C 45 s, 72 ◦ C 1 min 20 s; ja lõplik pikendus 72 ◦C 8 minutiks. PCR produkt visualiseeriti agaroosgeelelektroforeesiga ja PCR reaktsioonid puhastati PCR puhastuskomplekti (Thermo Scientific) abil. DNA fragmendid sekveneeriti GATC-s (Konstanz, Saksamaa).

3.4. Järjestus ja liikide identifitseerimine

Järjestuste puhtust ja mittevastavust hinnati BioEditi abil [22]. Iga tüve jaoks saadud päri- ja vastupidised järjestused pandi kokku BioEditiga ja testiti kimääride suhtes, kasutades DECIPHERi (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Saadud järjestused deponeeriti GenBanki (juurdepääsunumber: KY558684). Blastanalüüsid peaaegu täielike 16S rRNA järjestustega (1368 aluspaari) viidi läbi, kasutades National Center for Biotechnology Information (NCBI) andmebaasi (referents-RNA järjestused). Tulemused näitasid, et tüvi RB99 kuulub perekonda Actinomadura. Esimese 10 tabamuse järjestused laaditi alla NCBI andmebaasist ja joondati Actinomadura sp. 16S rRNA järjestusega. RB99, kasutades Sina järjestuste joondamise teenust [23]. Kaks erinevat fülogeneetilist puud rekonstrueeriti naaberliitumise või maksimaalse tõenäosusega algoritmidega, kasutades MEGA tarkvara versiooni 7.0.26 [24–26]. Tamura ja Nei evolutsioonilise kauguse mudelit kasutati evolutsiooniliste kaugusmaatriksite genereerimiseks maksimaalse tõenäosusega ja naabritega liitumise algoritmide jaoks, kustutades täielikud lüngad ja puuduvad andmed [27]. Maksimaalse tõenäosusega algoritmi jaoks kasutati diskreetset gamma jaotust (pluss G) ja kiiruse variatsioonimudel võimaldas mõnel saidil olla evolutsiooniliselt muutumatu (pluss I). Naabrite ühendamise algoritmi jaoks modelleeriti saitide kiiruse varieeruvus gamma jaotusega ( pluss G). Sõlmede usaldusväärtusi hinnati bootstrap analüüsidega, mis põhinesid 1000 resamplimise etapil [28].

3.5. Ekstraheerimine ja isoleerimine

Actinomadura sp. RB99 kasvatati 50 ml ISP2 puljongis seitse päeva temperatuuril 30 ◦C (eelkultuur) ja seda kasutati 100 ISP2 agariplaatide inokuleerimiseks. Plaate inkubeeriti 10 päeva temperatuuril 30 °C, lõigati väikesteks tükkideks, konsolideeriti ja sukeldati üleöö MeOH-sse. MeOH faas filtriti ja aurustati alandatud rõhul. MeOH ekstrakt (20 g) lahustati destilleeritud vees (700 ml) ja seejärel jaotati lahustiga kolm korda EtOAc-ga (700 ml), saades 1,1 g jääki. EtOAc-s lahustuv fraktsioon (1,1 g) MeOH ekstraktist kanti kromatograafia jaoks silikageelikolonni (230–400 mešši) ja elueeriti CH2Cl2-MeOH gradientlahustisüsteemiga (100:1 kuni 1:1): 1, v/v). See andis kuus fraktsiooni (A–F), mis allutati LC-UV/MS-põhisele analüüsile. Dereplikatsioonianalüüs, milles kasutati ettevõttesisest UV-spektri raamatukogu, viitas väiksemate peptiidianaloogide olemasolule fraktsioonis E. Need näitasid umbes 220 nm juures lihtsat UV-mustrit ja ainulaadseid lämmastikuaatomeid sisaldavaid molekulaarvalemi ioonipiike. Polaarne fraktsioon E (233 mg) fraktsioneeriti preparatiivse pöördfaasi HPLC-ga (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA), kasutades CH3CN/H2O (1:9 kuni 9:1, v. /v, gradientsüsteem, voolukiirus: 5 ml/min), et saada viis alamfraktsiooni (E1–E5). Alamfraktsioon E2 (27 mg) puhastati poolpreparatiivse pöördfaasi HPLC-ga (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) 33% MeOH/H2O-ga (isokraatne süsteem, voolukiirus: 2 ml/min). Saadi ühend 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Ühendid 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) ja 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) eraldati alamfraktsioonist E3 (15 mg) poolpreparatiivse pöördfaasi abil HPLC, elueerides 43% MeOH/H2O-ga (isokraatne süsteem, voolukiirus: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamiid A (1)

3.5.2. Nataleenamiid B (2)

3.5.3. Natalenamiid C (3)

3.6. Ühendite 1–3 happeline hüdrolüüs

Iga ühendi (1–3) kogus kokku 0,4 mg hüdrolüüsiti 6 N HCl-ga (500 µL) 1 tund temperatuuril 110 °C. Pärast toatemperatuurini jahutamist aurustati 1–3 hüdrolüsaadid HCl jälgede eemaldamiseks. Hüdrolüsaadi segudele lisati destilleeritud vett (500 ui) ja seejärel aurustati, et eemaldada HCl jäljed; seda protseduuri viidi läbi kolm korda.

3.7. Aminohapete absoluutse konfiguratsiooni määramine 1.–3

Hüdrolüsaadi segud (1–3) ja standardsed aminohapped (L/D-Leu, Glu, Phe ja Val) lahustati 1 N NaHCO3-s (100 µL) ja seejärel töödeldi. 50 ui L-FDAA-ga (10 mg/ml atsetoonis). Iga hüdrolüsaati kuumutati järjestikku 10 minutit temperatuuril 80 °C. Iga segu peatati 2 N HCl-ga (50 ui) ja kontsentreeriti vaakumis. Jääk lahustati 300 ui MeOH-s. Iga hüdrolüsaadi segudest saadud alikvoot (5 µL) süstiti otse LC/MS-i (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, voolukiirus 0,3 ml/min) ja täielik skaneerimine positiivses ja negatiivses. L-FDAA-derivatiseeritud aminohapete retentsiooniaegade tuvastamiseks kasutati ioonirežiime (skaneerimisvahemikus m/z 100 kuni 1000).

Liikuv faas, mis koosnes sipelghappest destilleeritud vees ({{0}},1 mahuprotsenti) (A) ja atsetonitriilist (B), kanti gradientlahustisüsteemiga järgmiselt: 20–40 protsenti (B) 10 minutit, 100 protsenti (B) isokraatiat 5 minutit ja seejärel 20 protsenti (B) isokraatiat 5 minutit, et viia läbi kolonni käitamisjärgne pesuprotseduur. Standardina kasutatud L-FDAA derivatiseeritud aminohapete retentsiooniajad olid 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M pluss H] pluss), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M pluss H]). pluss ), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M pluss H] plus ), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M pluss H] pluss ), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M pluss H] plus ), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M pluss H] pluss) ja 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M pluss H] pluss). Derivatiseeritud hüdrolüsaatide retentsiooniajad 1-3 olid L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) ja L-Val (22,5 min) alates 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) ja L-Leu (25,6 min) 2-st; ja L-Glu (16,9 min) ja L-Phe (25,7 min) 3-st.

3.8. Tsütotoksilised testid vähirakkudega

MCF7, HeLa ja A549 rakud osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (Rockville, MD, USA). HepG2 rakud osteti Korean Cell Line Bankist (Soul, Korea). MCF7 rakke kultiveeriti Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit. HeLa ja A549 rakke kultiveeriti Dulbecco minimaalses olulises söötmes (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit. HepG2 rakke kultiveeriti minimaalses olulises söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit. Kultiveerimistingimusi hoiti temperatuuril 37 ◦C niisutatud atmosfääris, mis sisaldas 5 protsenti CO2. Tsütotoksilisust testiti nende nelja inimese rakuliiniga (MCF7, HeLa, A549 ja HepG2), kasutades EZ-CyTox rakkude elujõulisuse analüüsi komplekti (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Jaapan). Lühidalt, 5 × 103 rakku süvendi kohta külvati 96-süvendiga plaatidele. 24 tunni pärast töödeldi rakke näidatud kontsentratsioonides ühenditega. Pärast 72-tunnist inkubeerimist kasutati EZ-CyTox rakkude elujõulisuse analüüsi komplekti. Pärast 2-tunnist inkubeerimist mõõdeti neeldumist lainepikkusel 450 nm ja võrdlusväärtust 620 nm juures. Rakkude elujõulisus arvutati protsendina kontrollist.

3.9. Põletikuvastane tegevus

Hiire makrofaagi RAW264.7 rakuliin osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist. Rakke kultiveeriti DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS), 100 ühikut/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini, ning inkubeeriti 37 °C juures niisutatud atmosfääris 5 protsendi CO2-ga. Rakkude elujõulisust mõõdeti Ez-Cytox rakkude elujõulisuse tuvastamise komplekti abil. Rakke inkubeeriti 96-süvendiplaatidel kontsentratsiooniga 2500 rakku süvendi kohta 24 tundi ja töödeldi näidatud kontsentratsioonidega ühenditega 1–3 24 tundi. Järgmisena lisati igasse süvendisse Ez-Cytox reagendid. Optilist tihedust 450 nm juures mõõdeti 1 tunni pärast, kasutades rakkude elujõulisuse hindamiseks mikroplaadilugejat (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Eraldi katses inkubeeriti RAW264.7 rakke 96-süvendiplaatidel kontsentratsiooniga 30,000 rakku süvendi kohta 24 tundi. Pärast seerumi nälgimist 12 tundi töödeldi rakke 1 tund ühenditega 1–3 ja seejärel stimuleeriti 24 tundi 1 µg / ml LPS-ga. Kultuurisöötme neeldumist Griessi reaktsioonis mõõdeti NO taseme hindamiseks 540 nm juures, kasutades PowerWave XS mikroplaadilugejat.

3.10. Melaniini sisalduse mõõtmine

Hiire melanoomi rakuliin B16F10 osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist. Rakke kultiveeriti DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, 100 ühikut/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini, ning inkubeeriti 37 °C juures 5-protsendilise CO2-ga niisutatud atmosfääris. B16F10 rakke inkubeeriti 24 tundi 6 cm kultiveerimisnõudes 250,{12}} rakku süvendi kohta DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, 100 µg/ml streptomütsiini ja 100 U/mL penitsilliini. Rakke pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja stimuleeriti seejärel IBMX-iga ning inkubeeriti erinevate kontsentratsioonidega ühenditega 1–3 või kojichappega (positiivne kontroll) fenoolpunasevabas RPMI söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, 100 ühikut. /mL penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini 24 tundi ja 48 tundi. Kultuurisöötme neeldumist mõõdeti 405 nm juures, kasutades PowerWave XS mikroplaadilugejat, et hinnata melaniini sisaldust. Tulemused on väljendatud kordumisena võrreldes kontrolliga (rakud, mida IBMX ei stimuleeri).

3.11. Statistiline analüüs

Kõik andmed, sealhulgas rakkude elujõulisus, NO ja melaniini tootmine, esitati keskmise väärtuse ja standardhälbena (SD). Kõik analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris ja neid korrati vähemalt kolm korda. Sellesse uuringusse kaasati iga rakukatse puhul vaid mõni korduste arv, seega võeti statistilise analüüsi jaoks kasutusele mitteparameetrilise analüüsi meetod. Iga muutuja statistiliseks analüüsiks kasutati Kruskall-Wallis testi. Kõigi analüüside jaoks kasutati SPSS statistikapaketti (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistika versioon 21, Boston, MA, USA). Statistilist olulisust arvestati p-väärtusel, mis oli madalam kui 0,05.

4. Järeldused

Meie aruanne sisaldab seeni kasvatava termiidi mikroobide isolaatide keemilist analüüsi. Kolm uut tsüklilist tripeptiidi, natalenamiidid A–C (1–3), eraldati ja struktuurselt iseloomustati seene kasvatava termiidiga seotud Actinomadura sp. RB99, kasutades LC-UV/MS-põhist dereplikatsiooni meetodit. Kõiki eraldatud ühendeid hinnati bioloogilise aktiivsuse suhtes, kasutades rakupõhiseid analüüse. Ühendid 1 ja 2 avaldasid nõrka tsütotoksilisust vastavalt HepG2 ja HeLa/A549 rakkude suhtes. Ükski isoleeritud ühend ei avaldanud olulist pärssivat toimet NO tootmisele LPS-stimuleeritud RAW264.7 rakkudes. Ühend 3 avaldas annusest sõltuval viisil olulist pärssivat toimet IBMX-vahendatud melaniini sünteesile. Toime oli sarnane kojichappega, mida kasutatakse nahka valgendava toimega kosmeetilise materjalina.

Tänuavaldused:

Oleme sügavalt tänulikud Michael Thomas-Poulsenile (Kopenhaageni Ülikooli bioloogia osakond, Taani) meie välitööde toetamise eest.

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Viited

1. Newman, DJ; Cragg, GM Looduslikud tooted uute ravimite allikatena aastatel 1981–2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Looduslikud tooted: arenev roll tulevastes ravimite avastamisel. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Looduslikud tooted putukatega seotud mikroobidest. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Bakteriaalsed sümbiondid põllumajandussüsteemides on antibiootikumide avastamise strateegiline allikas. J. Antibioot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Looduslike toodete taastekkimine ravimite avastamiseks genoomika ajastul. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Totaalne biosüntees: polüketiidide ja mitteribosomaalsete peptiidide radade taastamine in vitro. Nat. Prod. Vabariik 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, polüeenperoksiid vastastikusest Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Istu, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Muutuvad geneetilised arhitektuurid toodavad praktiliselt identseid molekule seeni kasvatavate sipelgate bakteriaalsetes sümbiontides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Madal, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Judin, AK; Zaretsky, S. Kalpatiini peptidomimeetikumidel põhinevate kalpaiini inhibiitorite ratsionaalne disain. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Tsüklilised tripeptiidid halotolerantsest seenest Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Mošnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochiit, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andrejev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Uued pH-tundlikud tsüklilised peptiidid. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosynthesis of the -nitro-containing cyclic tripeptide psychrophilic. J. Antibioot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Tsüklilised peptiiditeraapiad: minevik, olevik ja tulevik. Curr. Arvamus. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamütsiin A, ansamütsiin termiitidega seotud Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavoonid A–C, isoflavonoidglükosiidid termiitidega seotud Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Makrotermütsiinid A–D, glükosüülitud makrolaktaamid termiitidega seotud Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Rubteroloonide A–F isoleerimine, biosüntees ja keemilised modifikatsioonid: Haruldased tropoloonalkaloidid Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, uued aminopeptidaas B inhibiitorid. II. Struktuuri selgitamine. J. Antibioot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, tsükliline tripeptiid Vanuatu käsnast Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH hüpopigmenteerivad ained: uuendatud ülevaade bioloogilistest, keemilistest ja kliinilistest aspektidest. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Aktinobakterite kui kaitsesümbiontide potentsiaali uurimine seeni kasvatavatel termiitidel. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: kasutajasõbralik bioloogiliste järjestuste joondamise redaktor ja analüüsiprogramm Windows 95/98/NT jaoks. Nukleiinhapped Sümp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: ribosomaalse RNA geenide täpne suure läbilaskevõimega mitme järjestuse joondamine. Bioinformaatika 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Naaberliitumise meetod: uus meetod fülogeneetiliste puude rekonstrueerimiseks. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evolutsioonipuud DNA järjestustest: maksimaalse tõenäosusega lähenemine. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Molekulaarevolutsioonilise geneetika analüüsi versioon 7.0 suuremate andmekogumite jaoks. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Nukleotiidide asenduste arvu hindamine mitokondriaalse DNA kontrollpiirkonnas inimestel ja šimpansitel. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Fülogeneesi usalduspiirid: alglaadimismeetodi kasutamine. Evolutsioon 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Näidiste saadavus:

Autoritelt pole ühendite näidiseid saadaval.

For more information:1950477648nn@gmail.com