Trombiini püsiv lokaalne inhibeerimine säilitab neerude mikroarhitektuuri ja funktsiooni pärast ägeda neerukahjustuse tekkimist

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas et al

Abstraktne

Äge neerukahjustus(AKI) juhtimine jääb peamiselt toetavaks, kuna kliinilistes uuringutes pole õnnestunud ühtegi spetsiifilist terapeutilist ainet, mis on suunatud üksikutele signaaliradadele. Siin teatame, et trombiinist tingitud hüübimise ja põletikuliste signaalide pärssimine lokaalselt toimivate trombiinile suunatud perfluorosüsiniku nanoosakeste (PFC NP) kasutamisega kaitseb neerude veresoonkonda ja moduleerib laias laastus erinevaid põletikulisi protsesse, mis põhjustavad neeruisheemia-reperfusiooni kahjustusi. Iga PFC NP kompleksis ligikaudu 13 650 otsese trombiini inhibiitori PPACK (proliin-fenüülalaniin-arginiin-klorometüülketoon) koopiaga. Hiirtel, keda raviti pärast AKI algust PPACK PFC NP-ga, ilmnesid allareguleeritud VCAM-1, ICAM-1, PGD2 prostanoid, M-CSF, IL-6 ja nuumrakkude infiltraadid. Paremini säilisid mikrovaskulaarne arhitektuur, torukujulised alusmembraanid ja harjaääriste komponendid. Mittereperfusioon vähenes, nagu näitas punaste vereliblede vähenemine ja mitteheemne raud.Neerfunktsioon ja tubulaarnekroos paranesid 24 tunni pärast võrreldes ravimata kontrollrühmaga, mis viitab PPACK PFC NP kasulikkusele tromboosi ja põletiku kahekordsel pärssimisel.

Märksõnad: Äge neerukahjustus; tromboos; Põletik; perfluorosüsiniku nanoosakesed; Laeva kahjustused

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Äge neerukahjustus(AKI) on nii noorte kui ka vanade seas sagedane kliiniline probleem, mille esinemissagedus suureneb ja suremus on lubamatult kõrge, mis ei ole aastakümnete jooksul oluliselt paranenud.1,2 Sündroom areneb tavaliselt pärast kogu või piirkondliku verevoolu äkilist mööduvat langust. aneerudmitmete solvangute, sealhulgas hüpotensiooni, sepsise, toksiinide jms tagajärjel.3 AKI kutsub esile patofüsioloogiliste molekulaarsete mängijate ja signaalisündmuste kompleksse kogumiku haigusprotsessis, mis areneb aja jooksul etappidena.3–6 Selektiivsed ja spetsiifilised molekulaarselt suunatud meditsiinilised Vaatamata tungivale meditsiinilisele vajadusele pole AKI ravimeetodeid veel olemas.7 Tõepoolest, pärast aastaid kestnud prekliinilisi ja kliinilisi uuringuid on praegused ravimeetodid endiselt põhiliselt toetavad.

Siin oletame, et nanoosakestel põhinevad terapeutilised sekkumised, mis on suunatud trombiinile, mis suudavad säilitada mikrovaskulaarset terviklikkust ja barjäärifunktsiooni ning vähendada samaaegselt põletikulist signaaliülekannet, toovad kasu AKI tulemustele. Trombiin on peamine aterogeenne ja haavade paranemise molekul, mis juhib paljusid teisi põletikulisi molekule, mis osalevad endoteeli aktivatsioonis pärast vigastust, nagu NF-κB,8 NADPH oksüdaas,⁹

ja teised nii endoteeli kui makrofaagide proteaasiga aktiveeritud retseptorite (PAR-1) kaudu.10,11 Kõik rakutüübidneerudkogesid geeniekspressiooni mustri muutusi, mis hõlmavad vigastusmarkerite ja arengugeenide suurenenud ekspressiooni, nagu on näidanud Rudman-Melnick jt ühepoolse isheemia-reperfusiooni üherakulises järjestusuuringus.neerud12 Lisaks tuvastas näriliste uuring ühetuumalise RNA sekveneerimise kohta kahepoolse isheemia-reperfusiooniga neerukahjustuse korral13 spetsiifilise proksimaalse tuubulirakkude populatsiooni, mis pärast sooja isheemia-reperfusioonikahjustust üleekspresseeris põletikueelseid ja profibrootilisi geene. Need tulemused näitavad, et põletik peaks olema kasulik terapeutiline sihtmärk. Kuigi tahkete intravaskulaarsete trombide moodustumine tundub AKI-s aeg-ajalt, oletasime veel, et mikrovaskulaarse prokoagulandi aktiivsuse leevendamine lokaalselt toimivate tugevate trombiinivastaste nanoosakeste antagonistide 14–17 kaudu võib parandada verevoolu, vähendada "tagasivoolu" ja nõrgendada põletikulist signaali, et säilitada. neerufunktsioon.

Kriitilised küsimused, mis takistavad otseste trombiini inhibiitorite kasutamist neeruisheemia-reperfusioonikahjustuse (IRI) ärahoidmiseks, hõlmavad nende võimalikke toksilisi kõrvaltoimeid ja süsteemset verejooksu riski. Seoses tromboosiga ei ole tavapärased antikoagulantravimid olnud eriti edukad, kuigi lahustuv trombomoduliin võib avaldada renoprotektiivset toimet,18,19 ning aktiveerida valku C,20,21 ja antitrombiin III,22, ehkki koos võimalike liigse verejooksu tüsistustega.21 Lisaks sellele võivad nii varfariin kui ka dabigatraani on seostatud neerutoksilisusega.^23,24Kuid tõsiasi, et need antikoagulantide lähenemisviisid ei ole veel kliiniliselt õnnestunud, ei vähenda trombiini potentsiaalset väärtust sihtmärgina, kuna sellel on kaks funktsiooni nii hüübimises kui ka põletikus. Kuigi AKI VEGF-ravi kohta kliinilist uuringut ei ole, on prekliiniline uuring näidanud, et VEGF on oluline vahendaja renoprotektsioonis AKI ajal,25 mis toetab veelgi meie pakutud hüpoteetilist neeruveresoonte säilimise terapeutilist mehhanismi neerufunktsiooni kaitsmisel AKI ajal.

Oleme välja töötanud stabiilse, bioühilduva ja mitte-nefrotoksilise perfluorosüsiniku nanoosakeste (PFC NP) platvormi, mis inhibeerib trombiini proteaasi aktiivsust, põhjustamata verejooksu diateesi.14,15 Natiivsed PFC NP-d on FDA poolt vereasendajatena heaks kiidetud26 ja sisaldavad vedelat perfluorosüsinikut. südamik ja välimine fosfolipiid-pindaktiivse aine kest, mille läbimõõt on vahemikus ~160-250 nm. Hiljutistes esialgsetes AKI uuringutes manustati anti-trombiini PFC NP eelravina, et kinnitada, et trombiin on väärtuslik sihtmärk neerufunktsiooni taastumise kiirendamiseks, säilitades osaliselt mikrovaskulaarse terviklikkuse ja vähendades IRI mittereperfusiooni, kui seda manustati enne isheemia-reperfusiooni. vigastus.16 Trombiinivastane PFC NPS kaitseb ka neeru allotransplantaate IRI eest ja näitab märgatavalt parenhüümi tubulaarse nekroosi protsentuaalset vähenemist, mis on seotud neeru pikema elueaga pärast siirdamist.27 Siiski pole selge, kas see tromboosivastane nanoosake on endiselt tõhus. pärast AKI algust, mis esindab täiesti teistsugust patsientide populatsiooni.

Sellest tulenevalt püüdsime käesolevas töös laiendada selle lähenemisviisi kasutamist väljakujunenud AKI-le pärast IRI-d, et selgitada välja selle kliinilise tõlke potentsiaal. Kontseptsiooni tõestuseks kasutame antitrombiini osana PPACK-i (Phe[D]-Pro-Arg-klorometüülketoon) konjugeerimiseks PFC NP-ga, mis on näidanud, et see hoiab ära trombiini signaaliülekande ja mikrovaskulaarse tromboosi ateroskleroosi ja ägeda neerukahjustuse mudelites. AKI).14–17 PPACK ise on hästi tuntud otsene ja pöördumatu trombiini inhibiitor, mis vabaneb neerude kaudu liiga kiiresti, et olla väärtuslik raviainena.14,15 Siin selgitame varajasi patofüsioloogilisi reaktsioone PPACK PFC NP teraapia, mis piirab põletikulisi signaaliülekandeid nii neerudes kui ka süsteemselt, säilitab neerude mikroarhitektuuri ja nõrgendab veresoonte kahjustusi. Need andmed viitavad sellele, et see nanoosakestel põhinev terapeutiline lähenemine käimasolevale AKI-le võib luua aluse trombiinivastase aine kliiniliseks väljatöötamiseks, millel on lokaalselt piiratud pleiotroopne toime ja mida saab ohutult manustada AKI varases faasis.

meetodid

Nanoosakeste koostis

Perfluorosüsiniku nanoosakesed valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil.14 Lühidalt, lipiidide segu, mis koosneb 98,5 molprotsendist muna L- - fosfatidüülkoliinist ja 1,5 molprotsendist 1,2-distearoüülsingütsero- 3-fosfoetanoolamiin-N-[ karboksü(polüetüleenglükool)-2000] (naatriumsool) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) valmistati kloroformis: metanoolis (3:1), enne kuivatamist, et moodustada lipiidkile vaakumis. Lipiidkile (2% (mass/maht)) kombineeriti seejärel PFOB-ga (20% (maht/maht)) (Exfluor Research Corp.) (glütseriin 1,7% (massi/maht)) (Sigma, St. Louis, MO ) ja MilliQ veega, enne emulgeerimist (Microfluidics Inc) jääl 4 minutit rõhul 20,{20}} psi. Nanoosakeste funktsionaliseerimiseks PPACK konjugatsiooniga kasutasime amiini-karboksüüli sidestamismeetodit. Nanoosakesed (1 ml) segati esmalt 1 tunni jooksul 2 mg EDCI 1-[3-(dimetüülamino)propüül]-3-etüülkarbodiimiidmetiodiidiga (Sigma, St. Louis, MO) , enne 12,5 mg PPACKi (BACHEM, Torrance, CA) lisamist orbitaalloksutil toatemperatuuril üleöö. Liigse EDCI ja PPACK eemaldamiseks viidi läbi dialüüs molekulmassi piirväärtusega 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA). Üksikasjalik formuleerimismeetod lisati lisamaterjalidesse.

Ägeda neerukahjustuse mudel

Täiskasvanud C57BL/6 hiirtel (n=22) tehti ägeda neerukahjustuse esilekutsumiseks kahepoolne neerusooja isheemia-reperfusioon. Loomad anesteseeriti ketamiini (85 mg/kg) ja ksülasiini (13 mg/kg) kokteiliga enne laparotoomiat, et tekitada 17 minutit sooja isheemiat. Neeruarteri ja veeni paljastamiseks tehti kõhu keskjoone sisselõige. Neeruisheemia kutsuti esile nii arteri kui ka veeni oklusiivsete klambritega, et piirata verevoolu neerudesse. Neerude verevoolu edukat seiskumist kinnitas visuaalselt neeruvärvi muutus roosast tumelillaks. Hiirte kehatemperatuuri hoiti 37 kraadi juures, kasutades väikeloomade küttesüsteemi. Klambrid vabastati 17 minuti pärast, et võimaldada neerude verevoolu taastamist, mida kinnitas neeru värvi muutumine roosaks. Seejärel suleti kirurgiline haav kihtidena ja loomi jälgiti ning pärast vaba liikumist viidi need tagasi puuri. Pärast 2-tunnist reperfusiooni ühekordne PPACKi annus

PFC NP ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) või tavalist (kontroll) PFC NP-d manustati intravenoosselt sabaveeni süstimise teel. Kuna meie eelmine uuring näitas, et PPACK PFC NP ühekordne ennetav annus avaldas neerude kaitsvat toimet,16 rakendasime siin pärast AKI tekkimist ühekordse annusega ravi, et hinnata selle neerude kaitsvat toimet. Protseduurid ja protokollid kiitis heaks Lõuna-Florida ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee.

Kudede kogumine ja säilitamine 24 tundi pärast nanoosakeste manustamist hiired surmati ja neerud ekstraheeriti analüüsiks. Enne neeru eemaldamist histoloogiliseks ja molekulaarseks hindamiseks koguti veri südame punktsiooniga, et teha seerumi analüüs allavoolu, ja seejärel perfuseeriti iga hiir süsteemselt tavalise soolalahusega (Kat. nr: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA), kuni jääk oli jäänud. verd loputati neerudest välja. Seerumi kogumiseks hüübiti täisveri toatemperatuuril 30 minutit, seejärel tsentrifuugiti 2000 × g juures 10 minutit 4 kraadi juures. Kogutud seerumit säilitati enne vere uurea lämmastiku ja tsütokiinide hindamist temperatuuril -80 kraadi. Histoloogiliseks analüüsiks fikseeriti väljalõigatud neerud 10-protsendilises formaliinis enne kudede töötlemist, parafiini manustamist ja lõikamist. Eikosanoidide hindamiseks lõigati välja lõigatud neerud edasi, et eraldada ajukoor ja medulla, seejärel külmutati need vedelas lämmastikus ja säilitati analüüsiks temperatuuril -80 kraadi.

Histoloogia

Üksikasjalikud histoloogilise värvimise ja andmeanalüüsi meetodid lisati lisamaterjalidesse. Objektiklaasid deparafineeriti ja rehüdreeriti enne hematoksüliini ja eosiini värvimist, perioodilist Schiffi (PAS) värvimist (Kat. nr: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), Preisi sinist rauavärvimist, immunohistokeemilist värvimist, et visualiseerida CD31, VCAM,{2} ja ICAM-1 ekspressioon ning nuumrakkude eosinofiilide värvimine (katnr. 150665, Abcam, Cambridge, MA). Küüliku IgG isotüübi kontrollvärvimise andmed on esitatud täiendavatel joonistel 2 ja 3, et näidata immunohistokeemilise värvimise tulemuste spetsiifilisust. Kõik mikroskoopilised kujutised saadi samade võimsusseadete ja digiteerimisparameetritega. Mikroskoopilised hindamised viidi läbi Olympuse ereda välja mikroskoobiga, mis oli varustatud DP27 digitaalkaameraga, et salvestada patoloogiliste sektsioonide pilte 20-kordse või 40-kordse suurendusega. Kõigi piltide puhul viidi läbi topeltpime andmeanalüüs.

Vere uurea lämmastik (BUN)

BUN-i mõõtmised viidi läbi uurea lämmastiku (BUN) kolorimeetrilise tuvastuskomplektiga (Kat. nr: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) järgides tootja juhiseid.

Eikosanoidi valmistamine ja analüüs

Eikosanoidid ekstraheeriti modifitseeritud ekstraheerimisprotsessi abil ja analüüsiti UPLC ESI-MS/MS abil, nagu eelnevalt kirjeldatud.28 Selle uuringu jaoks kasutatud üksikasjalikud meetodid olid lisatud lisamaterjalidesse.

Seerumi tsütokiini hindamine

Kohandatud tsütokiinide massiiv osteti ettevõttelt R&D Systems (Minneapolis, MN) ja seda hinnati Luminex 200-ga (Northbrook, IL) järgides kasutusjuhendi juhiseid.

Statistika

Tulemused on väljendatud keskmisena ± keskmise standardviga (SEM). Iga katse statistiline analüüs on kokku võetud täiendavas tabelis 1. Kasutati kahepoolset t-testi või ühesuunalist ANOVA-d koos Scheffe testiga. Pearsoni r väärtuse arvutamiseks viidi läbi valitud mõõdikutepaaride korrelatsioonianalüüsid. Erinevuste statistiline olulisus omistati P <>

Tulemused

PPACK PFC NP ravi parandab neerufunktsiooni pärast haiguse algustäge neerukahjustus.

Neerude üldise välimuse mikroskoopiline uurimine 24 tundi pärast reperfusioonijärgset anti-trombiini (PPACK) PFC NP-ravi näitas kahjustuse leevenemist väljakujunenud AKI-s (joonis 1, AB). Vigastus 24 tunni pärast paiknes valdavalt neeru kortikomedullaarses ristmikul ja eelistatavalt olid kahjustatud proksimaalsed tuubulid. Vigastuse muster oli koagulatiivset tüüpi nekroosi oma. 24-tunnil esines väike põletikuline infiltraat. Tubulaarsete kahjustuste kvantifitseerimine H&E-ga värvitud lõikudes (joonis 1, C) näitas, et PPACK PFC NP-ga ravitud hiirtel vähenes ägeda tubulaarse nekroosi (ATN) üldine 33,95% võrreldes kontroll-NP-ga ravitud hiirtega (24,44 ± 1,76% vs 37). vastavalt 16}} ± 4,96 protsenti; P=0,035). Joonis 1, D näitab, et ravi saavatel hiirtel vähenes BUN 24 tunniga 44,03 protsenti (110,96 ± 6,21 mg/dL vs. 62,10 ± 8,71 mg/dL kontroll-NP vs PPACK PFC NP; P=0,0002) . Need varajased kasulikud tulemused peegeldavad kaitset, mida me varem täheldasime 24 tunni jooksul ravieelsete trombiinivastaste režiimide puhul,16 mis viitab sellele, et trombiin mängib jätkuvalt olulist rolli AKI arengus pärast esialgset isheemilist insuldi.

Joonis 2 illustreerib basaalmembraani ja pintsli ääriste struktuuride piirkondlikke reaktsioone trombiinivastasele ravile, mis põhineb PAS-i värvimise poolkvantifitseerimisel. Joonis 2, AC näitab, et ravi suurendas tervete basaalmembraanidega glomerulite protsenti 51,43 ± 2,61 protsendilt 70.00 protsendilt ± 3,09 protsendini (P=0,00033). Joonis 2, DF illustreerib põhjalikumaid kahjustusi, mida kandsid torukujulised harjaäärised, kus ainult vähemusel jäid 24 tunni jooksul täielikult puutumata harjapiirid. Sellegipoolest parandas töötlemine pintsli ääriste terviklikkust 50,79 protsenti (P ​​= 0.015). Ravi vähendas valguagregaatide üldist ulatust 54,09 protsenti (P ​​= 0.032) (joonis 2, GI), mis võib eeldada, et see hoiab ära tubulaarse ummiku, et säilitada neerufunktsioon.

PPACK PFC NP-ravi säilitas pärast IRI algust veresoonte terviklikkuse

Et kvantifitseerida PPACK PFC NP potentsiaali kaitsta veresoonte elemente, värviti neerulõigud CD31 jaoks.

Joonis 3 illustreerib CD31 värvimise suuremat levimust 24 tunni pärast PPACK NP-ga ravitud hiirte ajukoores ja medullas võrreldes kontroll-NP-ga (joonis 3, A ja D versus B ja E). Kortikaalsetes piirkondades moodustas CD31 värvumine 4,28 protsenti ± 0,62 protsenti ravitud loomadest vs 1,75 protsenti ± 0,34 protsenti kontroll-loomadel (P=0.0{{ 25}}18) ehk suhteline tõus 144,57 protsenti (joonis 3, C). Medullaarsetes piirkondades moodustas CD31 värvumine PPACK NP-ga töödeldud loomade puhul 3,24 protsenti ± 0,38 protsenti võrreldes NP-ga ravitud kontroll-loomade puhul 1,91 protsenti ± 0,29 protsenti (P ​​= 0,0073) või suhtelist 88,81 protsenti suurenemist (joonis 3, F). . Vaskulaarse terviklikkuse mikroskoopiline hindamine ei näidanud 24-tunnise ajahetkel märgatavat arteriooli nekroosi.

Punaste vereliblede (RBC) välimus mikroskoopilistel piltidel erines PPACK NP ja kontroll-NP-ga töödeldud hiirtel 24 tunni pärast (joonis 4). Kuna hiiri perfuseeriti süsteemselt vere väljapesemiseks perfuseeritavates neerupiirkondades, viitas punaste vereliblede esinemine halvasti perfuseeritud mikrovaskulaarsetes kanalites agregatsioonile või interstitsiaalsele ekstravasatsioonile või võib-olla mõlemale. Glomerulites (joonis 4, AB) täheldati RBC-sid vaskulaarsetes kimpudes, kuid harva Bowmani kapslis 24 tunni pärast. Ravi vähendas glomerulaarsete punaste vereliblede levimust 40,78 protsenti (P ​​= 0,007) (joonis 3, C). Medulla puhul (joonis 4, DE) ei olnud H&E plekkide põhjal võimalik määrata punaste vereliblede kindlat asukohta, kuid ravi vähendas punaste vereliblede üldist levimust 34,92 protsenti (P ​​= 0.049) (joonis 4, F) .

RBC ladestumise ja püüdmise tagajärgede edasiseks kirjeldamiseks viidi läbi mitteheemne raua värvimine Preisi sinisega. Rauaplekid olid positiivsed nii glomerulaarsetes kui ka torukujulistes rakustruktuurides. Ravi vähendas raua levimust nii ajukoores (44,23% vähenemine; P=0.022) (joonis 5, AC) kui ka medullas (50,50% vähenemine; P=0.006) (Joonis 5, DF ) 24 tunni pärast, mis on kooskõlas trombiinivastase ravi mõjuga RBC püüdmisele.

PPACK PFC NP-ravi vähendas pärast AKI tekkimist lokaalset ja süsteemset põletikku

Et selgitada trombiini rolli endoteeli aktivatsiooni ja lokaalse põletiku säilitamisel neerudes, kvantifitseerisime nii ICAM-1 kui ka VCAM-1. PPACK-ravi ei muutnud VCAM-1 ekspressiooni ajukoores (joonis 6, AC). Kuid VCAM- 1 ekspressioon medullas vähenes pärast ravi oluliselt 65,25 protsenti (P ​​= 0,011) (joonis 6, DF). Kontroll-NP-ga töödeldud hiirtel täheldati endoteeli ICAM-1 suurenenud ekspressiooni nii ajukoores kui medullas (joonis 7, B ja E). ICAM-1 vähenes ravi tõttu 36,89 protsenti (P ​​= 0.0083) ajukoores (joonis 7, AC) ja 31,17 protsenti (P ​​= 0.030) medullas (joonis 7). , DF).

Trombiini rolli piiritlemiseks põletikuliste bioaktiivsete lipiidide reguleerimisel AKI varases evolutsioonis teostasime 24 tunni jooksul ajukoorest ja medullast eraldi ekstraheeritud kudedega lipiidoomseid analüüse. Täiendavad tabelid 2 ja 3 loetlevad spetsiifilised molekulaarsed testid, neerupiirkond ja subjektitüübid (ravitud AKI, töötlemata AKI või normaalne ilma AKIta). Täiendav tabel 4 loetleb ajukoores ja medulla iga lipiidi keskmise protsentuaalse muutuse tervest normaalsest algtasemest. Üldiselt näitasid nii kortikaalsed kui ka medullaarsed piirkonnad peaaegu kõigi bioaktiivsete lipiidide ekspressiooni hälbimist, mida hinnati võrreldes normaalsete neerudega (täiendavad tabelid 2 ja 3), ning peaaegu kõik signaallipiidid kaldusid pärast trombiinivastast ravi nihkuma normaalse taseme poole. Piirkondliku põletiku lihtsustatud mõõdikuna (täiendav tabel 4) oli kõigi lipiidide keskmine protsentuaalne muutus ajukoores 65,13 protsenti ja 38,60 protsenti ning medulla puhul vastavalt 136,42 protsenti ja 90,76 protsenti kontroll-NP ja PPACK NP rühmades, mis näitab, et põletik medulla ületas lipiidoomsete analüüside kohaselt ajukoore oma.

Kuigi paranemistrendid ilmnesid pärast töötlemist peaaegu kõigi lipiidiliikide puhul, ei vastanud enamik neist statistilist olulisust. Kuid nendes analüüsides oli märkimisväärne PDG2 märkimisväärne vastus, mis vähenes ajukoores 47,62 protsenti (joonis 8, A) (P=0.012) ja 50,21 protsenti medullas (joonis 8, B) ( P=0.0249). Selle tähelepaneku põhjal kvantifitseerisime infiltreeruvate nuumrakkude levimuse, mis on teadaolevalt silmapaistev põletikulise PGD2 allikas. Joonis 8, CE näitab, et antitrombiinravi vähendas nuumrakkude sisaldust kogu neeruosas 54,27 protsenti (P ​​= 0,002) 24 tunni pärast. See on kooskõlas VCAM-1 ja ICAM-1 (joonised 6 ja 7) kui aktiveeritud nuumrakkude vähenemisega, mis ekspresseerivad LFA-1 (lümfotsüütide funktsiooniga seotud antigeen 1) ja VLA (väga hilja). antigeen) ligeerivad koespetsiifilisi adhesioonimolekule põletikulistesse kudedesse siirdumiseks.29,30 Lisaks vähendasid nuumrakkudega seotud kemokiinid/tsütokiinid, nagu M-CSF ja IL-6, samaaegselt trombiinivastased nanoosakesed. Pärast PPACK NP-ravi vähenesid seerumi M-CSF ja IL-6 vastavalt 36,60% (P=0.0448) ja 27,44% (P=0.0454) võrreldes töötlemata kontrollrühm (joonis 8, F).

Nuumrakkude infiltratsiooni, veresoonte kahjustuste ja neerufunktsiooniga seotud andmekogumist ilmnes mitu huvitavat seost ravitud ja ravimata loomade kombineeritud rühmade kohta nii ajukoore kui ka medulla piirkondades. Kaudne seos oli BUN-i ja CD31 vahel (r=0.75, P=0.000009), mis näitab, et neerupuudulikkuse süvenemine oli seotud suurema veresoonte kahjustusega (täiendav joonis 1, A). Nuumrakkude arvu ja BUN-i vahel eksisteeris otsene seos (r=0.71, P=0.004), mis viitab progresseeruvale vähenemisele

neerufunktsioonist seoses nuumrakkude infiltratsiooniga (täiendav joonis 1, B). Täheldati kaudset seost nuumrakkude arvu ja CD31 vahel (r=0.59, P=0.002), mis näitab, et veresoonte kahjustus süvenes nuumrakkude suurenenud infiltratsiooniga (täiendav joonis 1, C). Lõpuks täheldati otsest seost nuumrakkude arvu ja globaalse ICAM-1 ekspressiooni vahel (r=0.54, P=0.008), mis on kooskõlas ootusega, et ülesreguleeritud veresoonte adhesioonimolekulid soodustada nuumrakkude sattumist vigastatud kudedesse (täiendav joonis 1, D). Veelgi tihedam otsene seos oli seotud medullaarse VCAM-i ekspressiooni ja nuumrakkude arvuga (r=0.69, P=0.009; andmeid pole näidatud).

Arutelu

Vaatamata aastakümnete pikkustele jõupingutustele tõhusa haldamise otsimiseläge neerukahjustus, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 trombiinivastast fragmenti mikrovaskulaarse tromboosi ja PAR-1 aktivatsiooni kohtades (täiendav kirjeldus lisamaterjalides), amplifikatsioonistrateegia, mida ei saa saavutada trombiini inhibeerivate tavaliste vabade ainete, sealhulgas PPACK, 1:1 stöhhiomeetriaga.

Käesolev andmekogum näitab, et äge neeruisheemia-reperfusioonikahjustus ei ole 2 tunni jooksul pärast reperfusiooni täielik ja trombiin jääb pärast reperfusiooni kahjustatud kudedes kõrge väärtusega sihtmärgiks. Molitorise kaastöötajate ja teiste varasemad jõupingutused toetavad jätkuvaid jõupingutusi ohutute meetodite väljatöötamiseks trombiini otseseks inhibeerimiseks AKI-s.^18,31–33Oma varasemast tööst AKI eeltöötlemisel PPACK PFC NP-ga teame, et trombiinivastased nanoosakesed tagavad püsiva seire lokaalselt aktiveeritud trombiini vastu, mis säilitab veresoonte terviklikkuse, nõrgendab märkimisväärselt tagasivoolu nähtust ~50% võrra ja muudab kiiresti neerufunktsiooni häire 24 võrra. 16. Koos käesolevate andmetega on selge, et trombiinivastased nanoosakesed pääsevad ka pärast reperfusiooni edasi kahjustatud, kuid elujõulistele neerukudedele, et vältida täiendavaid veresoonte ja tubulite kahjustusi. Varasemad teated, et PAR-1 knockout hiired kannatavad vähenenud neeruisheemia-reperfusioonikahjustuse all, on kooskõlas ka meie strateegiaga, mille kohaselt PAR-1 aktivatsiooni tugev ja püsiv farmakoloogiline inhibeerimine AKI-s trombiini inhibeerimise kaudu.³⁴

Neerude veresoonte struktuuride (joonis 3), harja äärise ja basaalmembraani (joonis 2) kaitse, mida pakub antitrombiini PFC NP, kooskõlas meie varasemate andmetega, mis näitavad, et trombiinivastane ravi põhjustab 2-kordset perfusiooni paranemist kortikomedullaarsetes piirkondades. AKI,16 kinnitab neeru mikroangiopaatia leevendamise esilekerkivat kasu. Kuigi peritubulaarsete kapillaaride ja veenulite kahjustuse täpset olemust ei ole nendel varastel ajahetkedel pärast reperfusiooni täielikult välja selgitatud, kirjeldatakse veresoonte suurenenud läbilaskvust ja endoteeli proapoptootilise kaspaasi -3 aktivatsiooni, samuti signaali vähenemist. CD31 (PECAM),35 jaoks, mis reguleerib endoteeli ristmiku terviklikkust.36 CD31 sünteesi ja ekspressiooni rakuühendustes vähendavad põletikulised tsütokiinid, mida ekspresseerivad aktiveeritud nuumrakud (TNF- ja IFN-), mis suurendavad veresoonte läbilaskvust.^37,38Veelgi enam, koefaktori indutseerimist trombiini poolt PAR-1 aktiveerimise kaudu reguleerib CD31 ja CD31 knockout hiirtel on suurenenud tubulaarne epiteeli ja endoteeli apoptoos, suurenenud fibriini ladestumine ja koefaktori ekspressioon.³⁹Sellest tulenevalt võib PPACK PFC NP võime säilitada CD31 ekspressiooni olla oluline hüübimiskaskaadi käimasoleva aktiveerimise piiramiseks ja endoteeli terviklikkuse säilitamiseks.

Põletiku ja koagulatsiooni vahel on lokaalne seos AKI pikenemise faasis, mis piirab välimist medullaarset kapillaari perfusiooni, põhjustades pikaajalist piirkondlikku isheemiat/hüpoksiat, mis seejärel kahjustab tubulaarsete rakkude paranemist ja regeneratsiooni.4 Mikroveresoonte arvu pidev vähenemine sisemises ribas AKI välimise medulla kahjustus näitab, et veresoonte kahjustused jätkuvad ja VEGF-i signaalimine on alla surutud.^40–42Lisaks on palju tõendeid selle kohta, et vaskulaarne harvestumine kutsub esile kroonilise hüpoksia, mis põhjustab progresseeruvat tubulointerstitsiaalset fibroosi.⁴³Roti ägeda isheemia/vigastuse mudelis on proksimaalsed tuubulid eriti tundlikud hüpoksia suhtes, mis avaldub tuubulite rakkude lagundamisel ja isegi täielikul lagunemisel, mis põhjustab liigset suremust.44,45 Tõepoolest, Humphrey rühm on ka näidanud, et neerude mikrovaskulaarne pügamine on eelkäija krooniline neeruhaigus.⁴⁶

Meie andmed kinnitavad ka seda, et veresoonte kahjustus soodustab punaste vereliblede kinnijäämist ja mitteheemi ladestumist (joonised 4 ja 5), ​​mis võib süvendada kroonilist neeruhaigust,⁴⁷kuid mis sobib antitrombiinraviks. Kudede rauaallikas nii glomerulaar- kui ka tubulaarsetes rakkudes (joonis 5) pärines kahtlemata punaste vereliblede lagunemisest neil territooriumidel hemorraagia ja/või mikrovaskulaarse tromboosi tagajärjel, mis on kooskõlas vaskulaarse kompromissi pildiga, mida trombiinivastane ravi leevendab. Sellest tulenevalt võivad veresoonte terviklikkust säilitavad lähenemisviisid kujutada endast kriitilist esimest sammu toitvate substraatide toiteliinide säilitamisel, mis hõlbustavad kahjustatud torukujuliste struktuuride kiiremat paranemist.

Huvitaval kombel näib, et PPACK PFC NP pakub vaskulaarsete struktuuride varajast kaitset ja nõrgendab erinevaid põletikumarkereid (joonised 6 ja 7; täiendavad tabelid 2-4) nii ajukoores kui ka medullas. Traditsioonilistes AKI eksperimentaalsetes uuringutes eeldatakse, et ajukoor on kahjustuste suhtes vastupidavam kui medulla madalama metaboolse nõudluse tõttu, kuid endoteeli aktivatsioon ja patofüsioloogiline põletik on laialt levinud, nagu näitavad meie lipiidoomsed ja histokeemilised testid. Peale selle on mitteheemse raua laialdane ladestumine nii ajukoores kui medullas kinnijäänud punaste vereliblede lagunemise kõrvalsaadusena – ja selle leevendamine trombiinivastaste nanoosakeste abil – kooskõlas põletiku ja kahjustuste üldise mustriga, isegi kui ajukoor võib osutuda suuremaks. haiguse ajal mööduvalt ja kergelt mõjutatud kui medulla.

Nuumrakkude infiltratsiooni üllatav varajane reaktsioon 24 tunni jooksul (joonis 8) viitab põletikuliste rakkude olulisele rollile peale traditsiooniliste mängijate, nagu neutrofiilid ja makrofaagid. Nuumrakke peetakse tavaliselt allergiliste reaktsioonide vahendajateks, kuid nende patofüsioloogiliste mõjude kohta ägeda ja kroonilise neerukahjustuse korral on palju kirjandust.^48–52 Kuigi neutrofiilid reageerivad koekahjustusele varakult, sisenevad makrofaagid pildile alles hiljem põletikulise protsessi käigus, mis viitab sellele, et nuumrakud mängivad AKI varases faasis olulist rolli. Tõepoolest, Danelli jt on näidanud, et nuumrakkude degranulatsioon toimub AKI varakult ja nuumrakkude ammendumine AKI induktsiooni ajal, kuid mitte 48 tundi hiljem, avaldab pikaajalist kasulikku mõju neerufunktsioonile, atroofiale ja fibroosile.⁵³Sarnastele järeldustele jõudsid Tong jt kromolüüniga stabiliseeritud nuumrakkude protseduuride puhul, mis viidi läbi enne reperfusiooni.54 Summers on näidanud, et nuumrakkude puudulikkusega hiirtel (KitW-sh/W-sh) esineb vähem isheemilisi vigastusi kui metsikutel tüüpidel ja et nad töötavad välja leukotsüütide kemoatraktantide vähendatud tasemed.⁵⁵

Nuumrakud ekspresseerivad proteaasiga aktiveeritud retseptoreid Nuumrakud ekspresseerivad proteaasiga aktiveeritud retseptoreid (PAR), mida trombiin võib aktiveerida, et degranuleerida ja vabastada hulk eelnevalt moodustunud kemokiine, tsütokiine ja bioaktiivseid lipiide.56–58 Trombiin põhjustab ka nuumrakkude adhesiooni maatriksiga. valgud (nt fibronektiin) ja interleukiini ekspressioon (nt IL-6) PAR- 1 interaktsioonide kaudu.⁵⁹Pärast trombiini inhibeerimist täheldasime PGD2 taseme langust, mis on kooskõlas nuumrakkude suhtelise kahanemisega, kuna PGD2 on peamine bioaktiivne eikosanoid, mida nuumrakud sekreteerivad allergilist tüüpi reaktsioonides.60 Lisaks on ICAM-i alareguleerimine-1 ja VCAM-1 pärast antitrombiini nanoosakeste töötlemist on kooskõlas nuumrakkude vähenenud infiltratsiooniga, kuna need ekspresseerivad LFA-1 ja VLA-d ning kasutavad kudedesse sisenemiseks adhesioonimolekule.^29,30

PGD2 enda spetsiifilist patogeenset rolli neeru IRI arengus ei ole meile teadaolevalt kirjeldatud, kuid see toimib nuumrakkude aktiveerimise selge biomarkerina.⁵²Kopsupõletiku puhul on näidatud, et PDG2 suurendab makrofaagide põletikueelset tsütokiini ekspressiooni oma retseptorite (DP1 ja DP2) kaudu, mis seejärel aktiveerivad neutrofiilide sissevoolu.61 Meie tähelepanek M-CSF ja IL-6 suurenemise kohta AKI-s (joonis 8) mida PPACK PFC NP nuumrakkude supressiooni kaudu alla reguleerib, oleks sellise oletatava mehhanismiga kooskõlas. Kuna aga nuumrakud vabastavad teadaolevalt paljusid tegureid, mis võivad neerufunktsiooni kahjustada,51,52 võib tulevaste trombiini inhibeerimise või muude molekulaarselt sihitud ainetega kontrolli all hoida mis tahes vastutavaid determinante. Sellest tulenevalt võivad sekkumised, mis aeglustavad nuumrakkude varajast ligitõmbamist ja degranulatsiooni, olla väga kaitsvad veresoonte terviklikkuse ja neerufunktsiooni suhtes, nagu käesolevates andmetes ilmneb lokaalne trombiini inhibeerimine.

Piirangud

Need uuringud ei olnud mõeldud trombiini inhibeerimise püsivate eeliste selgitamiseks, kuna AKI mudel on keskendunud varasele kaitsele IRI ja sellega seotud mehhanismide vastu. See, kas trombiinivastaste nanoosakeste ühekordse annuse pikaajaline kasu võib piirata kroonilise neeruhaiguse progresseerumist, jääb käesoleva aruande reguleerimisalast välja ja vajaks teistsugust eksperimentaalset mudelit ja hüpoteesi. Lisaks ei käsitleta siin ajalist võimalust funktsionaalse taastumise saavutamiseks trombiini inhibeerimisega AKI pikendamise faasis, kuid see on tulevaste uuringute teema. Mil määral on lokaalse trombiini inhibeerimise peamised kasulikud mõjud AKI-s tingitud nuumrakkude aktivatsiooni pärssimisest, jääb oletuslikuks, kuid seda saab testida järgnevates üksikasjalikes mehhaanilistes uuringutes. Kuigi olulised lineaarsed korrelatsioonid nuumrakkude arvu, CD31 ja BUN vahel ei pruugi tingimata kindlaks määrata põhjust ja tagajärge, toetab nende kooskõla tugevat seost nuumrakkude ja veresoonte kahjustuste vahel neeru IRI varases staadiumis. Lõpuks on PPACK-i kasutamine trombiinivastase osana vaid üks näide konjugeeritavast terapeutilisest koostisosast, mida saab ohutult ja lokaalselt manustada nanostruktuurile, et vähendada trombiini signaaliülekannet.

1. Benoit SW, Devarajan P. Äge neerukahjustus: esilekerkivad farmakoteraapiad praegustes kliinilistes uuringutes. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Ägeda neerukahjustuse uudsed ravimeetodid. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Isheemilise ägeda neerukahjustuse rakuline patofüsioloogia. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Isheemilise ägeda neerukahjustuse patofüsioloogia. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. AKI patofüsioloogia: vigastus ning normaalne ja ebanormaalne paranemine. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB jt. Translatsioonitõkete ületamine ägeda neerukahjustuse korral: aruanne NIDDK töötoast. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Ägeda neerukahjustuse hiljutised edusammud ja selle tagajärjed ning mõju kroonilisele neeruhaigusele. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. NF-kappaB blokeerimine: põletikuline probleem. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Epidermise kasvufaktori retseptori Nox1 transaktiveerimine soodustab N-kadheriini eritumist ja silelihasrakkude migratsiooni. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H jt. Trombiin indutseerib selektiivselt geenide transkriptsiooni inimese monotsüütides, mis on seotud põletiku ja haavade paranemisega. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, 10 Cate H. Kas trombiin on hüübimis-atereogeneesi labürindis võtmetegur? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA jt. AKI üherakuline profileerimine hiiremudelis näitab uudseid transkriptsioonisignatuure, profibrootilist fenotüüpi ja epiteeli ja strooma läbirääkimist. American Society of Nephrology Journal: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Hiire ägeda neerukahjustuse rakuprofiil näitab konserveerunud rakulisi vastuseid vigastusele. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Trombiini inhibeerivad perfluorosüsiniku nanoosakesed pakuvad uudset strateegiat ägeda tromboosi raviks ja magnetresonantstomograafiaks. Tromboosi ja hemostaasi ajakiri: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D jt. Trombiini inhibeerivad nanoosakesed moodustavad kiiresti mitmekülgsed ja tuvastatavad hüübimisvastased pinnad. Nanotehnoloogia 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L jt. Antitrombiini nanoosakesed parandavad neerude reperfusiooni ja kaitsevad neerufunktsiooni pärast isheemia-reperfusioonikahjustust. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73