Uuring Cistanche Deserticola ekstrakti terapeutiliste mõjude ja mehhanismide kohta deksametasoonist põhjustatud sarkopeenia puhul hiirtel

Abstraktne:Selles uuringus uuritiCistanche deserticola ekstrakti (CdE) terapeutiline toimedeksametasooni (Dex) poolt indutseeritud sarkopeenia kohta hiirtel ja võimalikku toimemehhanismi. Esiteks uuriti Cistanche'i farmakodünaamilisi komponente ja olulisi sihtmärke võrgufarmakoloogia abil ning teid rikastati, et ennustada CdE toimemehhanismi. Loomkatsetes jagati 50 KM hiired juhuslikult 5 rühma (kontrollrühm, Dexi mudelrühm, CdE suure annuse rühm, CdE keskmise annuse rühm ja CdE väikese annuse rühm). Välja arvatud kontrollrühm, süstiti teistele rühmadele sarkopeenia esilekutsumiseks subkutaanselt 42 päeva pärast ja kolmele ravirühmale manustati samaaegselt suukaudselt erinevaid CdE annuseid. Katse käigus testiti regulaarselt looma kaalu, koormustaluvust ja kehakoostist. Pärast loomade surmamist arvutati tagajäsemete lihaskoefitsient ning viidi läbi histoloogia ja sellega seotud geeniekspressiooni testid. Võrgufarmakoloogia tulemused näitavad, et CdE võib ravida sarkopeeniat IGF-1-re-lated signaaliradade ülesreguleerimisega. Loomkatsete tulemused näitavad, et CdE pöörab oluliselt tagasi Dexi põhjustatud tailihasisalduse ja lihaskoefitsiendi vähenemise, parandab koormustaluvust, vähendab rasvasisaldust, parandab lihaste histoloogilist seisundit, reguleerib üles IGF-1, MyoD ja MyoG ning alandab Atrogin-1 ja MuRF-1 ekspressiooni. CdE-l on terapeutiline toime Dex-indutseeritud lihaste atroofiale ja see võib parandada lihaste histoloogilist morfoloogiat ning selle toimemehhanismiks võib olla IGF-1 signaaliraja aktiveerimine.

Märksõnad: Cistanche deserticola ekstrakt; deksametasoon; sarkopeenia; võrgufarmakoloogia; IGF-1 rada

 

 

ehhinakosiidi kasulikkus

 

1. Materjalid ja meetodid

1.1 Reaktiivid

Selles uuringus kasutati järgmisi reaktiive:

Deksametasoonnaatriumfosfaadi süstimine(Partii nr. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Tavaline soolalahus(Partii nr L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Veevaba etanool, ksüleen, paraformaldehüüdjaglutaaraldehüüd– Hiina riiklik farmaatsiakontsern

Vesinikkloriidhape(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Hematoksüliini värvimislahus– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Eosiini värvilahus– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

812 epoksüvaigu kinnituskomplekt, uranüülatsetaat- SPI ettevõte

Molpure® RNA ekstraheerimise komplekt, PrimeScript RT komplekt, TB Green™ eelsegu Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology ja Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

Tistanche 3 toimeainet

 

1.2 Instrumendid

Peamised kasutatud seadmed:

NK-10 analoog-tõuke-tõmbemõõtur– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

QMR06-060H kehakoostise analüsaator– Niumagi korporatsioon

Digitaalne trinokulaarne mikroskoop BA 210– Motic Group

JEM-1400 FLASH ülekandeelektronmikroskoop– JEOL, Jaapan

QuantStudio™ 3 reaalajas PCR-süsteem– ThermoFisher Scientific

 

1.3 Võrgufarmakoloogia analüüs

Uurida aktiivseid ühendeid ja võimalikke mehhanismeCistanche tubulosaravimiselsarkopeenia, a võrgufarmakoloogiakasutati lähenemist:

Aktiivsed ühendidkohtaCistanche tubulosasõeluti kasutadesTraditsioonilise hiina meditsiini süsteemide farmakoloogia andmebaas (TCMSP), mille künnised on järgmised:

Suukaudne biosaadavus (OB) 30% või suurem

Ravimisarnasus (DL) 0,18 või suurem

Täiendav ühend jasihtteavesaadi siit:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Sarkopeenia haigusega seotud geenidsaadi:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Valgu ja valgu interaktsiooni (PPI) analüüsviidi läbiSTRING andmebaas(https://string-db.org).

A ühend-sihtmärk-geen interaktsioonivõrgustikehitati kasutadesCytoscape 3.2.1.

Funktsionaalne rikastamineviidi läbi kasutades:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) jaoksGeeniontoloogia (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) raja analüüsimiseks

Tulemused visualiseeriti kauduBioinformaatika veebitööriist(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 ValmistamineCistanche tubulosaVäljavõte (CdE)

TheCistanche tubulosaekstrakt valmistati järgmiselt:

Toorürdi viilud (partii nr Y221217) osteti ettevõtteltSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., mille autentsus on Xihua ülikooli prof Yang Wenyu.

1 kg kuivatatudCistanche tubulosa40-silmaline sõel.

A Materjali ja vedeliku suhe 1:20kasutati koos50% etanooli-vee lahus.

Segu olileotada 30 min, millele järgnebultraheli ekstraheeriminejuures55 kraadi, 250 W, jaoks40 min.

Väljavõtted olidtsentrifuugiti, filtreeriti ja kontsentreeriti alandatud rõhul60 kraadi juures paksuks pastaks (tihedus 1,2), kasutades rootoraurustit.

Kontsentreeritud ekstrakt olikülmkuivatatakse vaakumis, mis annab finaaliekstraheerimise efektiivsus 40%.

 

1.5 Loomade katsekujundus

Kokku50 SPF-klassi isast KM hiirt, 6 nädalat vana ja kaalub(22 ± 2) g, kasutati selles uuringus (loomalitsentsi nr.SCXK [Chuan] 2023-030). Kõik loomkatsed järgisidLaboriloomade haldamise eeskirjadvälja andnud Hiina Rahvavabariigi teadus- ja tehnoloogiaministeerium ning need olidheaks kiidetud Xihua ülikooli loomade eetikakomitee poolt(Kinnitusnumber: XH-2023-02-01).

Majutustingimused:Temperatuur (26 ± 1 kraadi), niiskus (50 ± 10%), 12-tunnine valguse/pimeduse tsükkel, vaba juurdepääs toidule ja veele.

Pärast 7-päevast aklimatiseerumist olid hiiredjuhuslikult jagatud 5 rühmakehakaalu alusel.

Kehakaalu registreeriti iga päev ja jälgiti üldist tervislikku seisundit, nagu käitumine, karusnaha seisund ja toidutarbimine.

Ravirühmad ja annusedon üksikasjalikult kirjeldatudTabel 1.

Seespäevad 40-42, motoorsete funktsioonide testid(haardejõud ja ujumine) viidi läbi.

Seespäev 43, pärast 12-tunnist tühja kõhuga registreeriti kehakaal ja keha koostis. Seejärel hiired anesteseeriti eetriga ja surmati. Kahepoolsed tagajäsemete skeletilihased lõigati kiiresti lahti ja kaaluti.

Thevasak gastrocnemiuslõigati pikisuunas ja fikseeriti sisse3% glutaaraldehüüdija4% paraformaldehüüdi, vastavalt.

Theparem gastrocnemiuskülmutati temperatuuril -80 kraadiqPCR analüüs.

SEO märksõnad:sarkopeenia loommudel, KM hiired, lihaste atroofia eksperiment, lihaste funktsiooni hindamine, eetilised loomauuringud

akteosiidi eelised

1.6 Keha koostise ja lihasindeksi mõõtmine

Kehakaalregistreeriti iga päev kogu katse vältel.

Enne ohverdamist,keha koostis(lahja mass ja rasvamass) mõõdetikaks korda, jakeskmine väärtussalvestati.

Pärast ohverdamist,tagajäseme skeletilihasedkaaluti.

Thelihasmassi indeksarvutati kasutadesCuadrose valem [11]:

Lihasindeks (%)=Lihasmass / kehakaal × 100
(Võrrand 1)

SEO märksõnad:lahja kehamass hiirtel, lihasindeksi arvutamine, kehakoostise analüsaator, sarkopeenia biomarkerid

 

1.7 Mootori töö testid

Et hinnatalihaste funktsioon, viidi 40. ja 42. päeva vahel läbi järgmised testid:

Ujumise test:

Iga hiir olikaalusja akoormus (5% kehamassist pliifooliumis)fikseeriti saba distaalse kolmandiku külge.

Hiired paigutati aanum 25 kraadise veega, sügavusel 30 cm või suurem.

Ujumisaegsalvestati sisenemisest kuni hiir ei suutnud enam hõljuda ja hakkas vajuma.

Iga hiirt testiti üks kord päevas3 päeva järjest, jakeskminevõeti lõpptulemusena.

Haardetugevuse test:

Teostatakse kasutades amanuaalne tõuke-tõmbemõõtur.

Iga hiirt testitiviis korda, koos a150-sekundiline puhkustestide vahel.

Thehaardetugevuse koefitsientarvutati kehakaalu normaliseerimiseks:

Haardetugevuse koefitsient=Haardejõud / kehamass (N/kg)
(Võrrand 2)

SEO märksõnad:ujumise vastupidavuse test, haardetugevus närilistel, lihaste jõudlusnäitajad, sarkopeenia hiire mudel

 

1.8 Histoloogiline analüüs

Et hinnatamorfoloogilised muutused lihaskoespärast ravi koosCistanche tubulosaekstrakt (CdE):

Hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimineviidi läbi fikseeritud koega4% paraformaldehüüdi.

Sektsioone vaadeldi all avalgusmikroskoopjalihaskiudude ristlõikepindalaanalüüsiti kasutadesPiltJtarkvara.

Sest, lihased fikseeritud3% glutaaraldehüüdiolid järelfikseeritud1% osmiumtetroksiid, atsetoonis veetustatud ja sisse manustatudEp812 vaik.

Poollõigudolid värvitudtoluidiinsininepositsioneerimiseks.

Üliõhukesed sektsioonidolid värvituduranüülatsetaat ja pliitsitraatja täheldati a-gaJEM-1400FLASH ülekandeelektronmikroskoop.

Lihaskiudude laiusmõõdeti ImageJ abil.

SEO märksõnad:skeletilihaste histoloogia, HE värvimisprotokoll, elektronmikroskoopia lihasuuringutes, lihaskiudude morfoloogia analüüs

cistanche'i eeliste loend

1.9 Geeniekspressiooni analüüs

Et uuridamolekulaarsed mehhanismidCdE sarkopeenia korral:

Külmunud lihaskoedpurustati mehaaniliselt vedela lämmastiku all.

Kogu RNA ekstraheeriti kasutadesTRIpure reagentvastavalt tootja juhistele.

cDNA sünteesiti apöördtranskriptsiooni komplektjaqPCRviidi läbi kasutades aThermo Scientific PikoRealsüsteem.

GAPDHkasutati sisemise võrdlusgeenina.

Praimeri järjestused jaokslihastega seotud geenidon loetletudTabel 2.

SEO märksõnad:qPCR lihaste atroofia geenide jaoks, GAPDH võrdlusgeen, RNA ekstraheerimine lihasest, geeniekspressioon sarkopeenia korral

 

1.10 Statistiline analüüs

Eksperimentaalseid andmeid analüüsiti kasutadesühesuunaline ANOVA, millele järgnebDunnetti mitmekordse võrdluse test.

A P-väärtus < 0,05peeti statistiliselt oluliseks.

Kõik statistilised analüüsid viidi läbi kasutadesSPSS 23.0.

Histomorfomeetrilised andmedanalüüsiti kasutadesPiltJtarkvara.

SEO märksõnad:statistiline analüüs farmakoloogilistes uuringutes, SPSS biomeditsiinilistes uuringutes, ANOVA loomuuringutes, ImageJ lihasanalüüs