Uuring Cistanche Deserticola ja selle riisiveini aurutamistoodete neuroendokriinse immuunfunktsiooni kohta glükokortikoidide indutseeritud rotimudelis-Ⅰ

1. Sissejuhatus

Cistanche deserticola, mida nimetatakse "kõrbe ženšenniks", on traditsiooniline hiina meditsiin, mida on sajandeid kasutatud yang-toonilise ravimtaimenaneerude turgutamine ja yangi tugevdamine[1]. Kaheksa liiki ja üks variatsioonCistanche Herba on salvestatud Hiinas ja ainultCistanche deserticolaYC Ma jaCistanche tubulosa(Schenk) Wight on kirjas Hiina farmakopöas [2]. Farmakoloogilised uuringud näitasid sedaCistanches Herbaneuroprotektiivne [3], immunomoduleeriv [4], kardioprotektiivne [5], väsimusevastane [6], põletikuvastane [7], hepatoprotektiivne [8], antioksüdant [9], antibakteriaalne [10], lahtistav [11] ja kasvajavastane toime mõju [12]. LaiSelle perekonna teatatud bioloogiliste aktiivsuste spekter on tingitud selle keerulisest ja mitmekesisest fütokeemilisest koostisest.Cistanche deserticolasisaldab fenüületanoolglükosiide, iridoide, polüsahhariide [13] jne. Fenüületanoidglükosiidide sisaldus on kõrgeim algsetes ravimmaterjalides [14].

LOODUSLIK TUBULOOS NEERE ERGUSTAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Hiina Materia Medica (CMM) töötlemine on traditsiooniline farmaatsiatehnika, mis vastab erinevatele ravi, väljastamise ja preparaatide valmistamise nõuetele vastavalt traditsioonilise Hiina meditsiini teooriale. Neid töödeldud tooteid nimetatakse keedutükkideks, mida kasutatakse kliinikutes. Töötlemise eesmärk on suurendada toorravimite toksilisuse vähendamise efektiivsust. 2015. aasta Hiina farmakopöas on kirjas, et kliinikus sai keedutükkidena kasutada Cistanche paksu viilu (CD) ja riisiveiniga aurutatud Cistanchet (WCD). Meie uurimisrühm näitas, et lahtistav toime leevenes ning vananemisvastane ja neeru-yangi turgutav toime tugevnes pärast seda, kui Cistanche aurutati koos riisiveiniga [15].

Hüpotalamuse-hüpofüüsi-neerupealise-harknääre (HPAT) telje funktsioon on neeru-yangi puudulikkuse sündroomi korral häiritud [16]. Neeru-yangi puudulikkusega patsientidel on ka ulatuslik immuunfunktsiooni häire. HPA telje düsfunktsioon on tihedalt seotud immuunpuudulikkusega. Neuroendokriin-immuunvõrgu (NEI) teooria näitab, et immuun- ja neuroendokriinsüsteemid jagavad paljusid ligande ja retseptoreid [17] ning hüpotalamust peetakse pöördepunktiks, mis ühendab neuroendokriinsüsteemi immuunsüsteemidega.

Selles uuringus kordasime neeru-yangi puudulikkust mudelrottidel eksogeense kortikosteroidi süstiga ja uurisime neeru-yangi puudulikkuse mehhanismi vastuseks erinevatele Cistanche deserticola töödeldud toodetele endokriin-immuunfunktsiooni vaatenurgast.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid ja reaktiivid

Prof Yanjun Zhai (farmaatsiakool, Liaoningi traditsioonilise hiina meditsiini ülikool, Hiina ülikool) kogus Cistanche deserticola Alashan Neimenggult 2019.5. aastal ja tuvastas selle Cistanche deserticola YC Ma kuivatatud lihakate vartena. Voucheri näidised säilitati Liaoningi töötlemistehnoloogia keskuses.

Ajugoli standardühendid osteti firmalt Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Hiina); tsistanosiid F,ehhinakosiid, tsistanosiid A ja isoakteosiidosteti ettevõttelt Must Company (Sichuani Hiina); akteosiid osteti ettevõttelt Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Hiina). MS-klassi atsetonitriil ja metanool osteti firmalt Merck KGaA (Darmstadt, Saksamaa). HPLC-puhtus sipelghape osteti firmalt Merck KGaA (Darmstadt, Saksamaa). Riisivein osteti ettevõttelt Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Hiina).

Kortikosteroon (CAS: 50-22-6, puhtus > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewani pillid (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), roti ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 ja IL-10 ELISA tuvastamise komplektid osteti ettevõttelt Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Roti kortisooli ELISA komplekti tarnis BOSK Co., roti CD4 antikeha, CD8a antikeha (nr 561833 ja 559976), RBC lüsaat (Solarbio, R1010), PBS puhverlahus (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM ja -aktiini üles- ja allavoolu praimerid saadi Guangzhou Invitrogen Co. pöördtranskriptsioonikomplektist (nr RR037A) ja cDNA sünteesikomplektist (nr 10000068167) hankis Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Kloroform, isopropanool, 75% uretanool ja Kõik lahused olid analüütiliselt puhtad ja neid valmistas Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrapuhas vesi valmistati Milli-Q süsteemiga (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Eksperimentaalsed instrumendid

Ensüümimarker (Thermo, mudel 3530911931), automaatne plaadipesur (mudel HBS- 4009), digitaalse ekraaniga tõukejõu mõõtja (mudel VICTOR- 50N), kiire külmutustsentrifuug (mudel Sigma 3k15 ), ultramikrospektofotomeeter (mudel B-50Q), geenivõimendi (mudel L96G), reaalajas fluorestsentsi kvantitatiivne PCR (mudel StepOne), voolutsütomeeter (mudel AC66051710132), parafiini mikrotoom (mudel Laikalympus), mikroskoop (O , mudelit BS-53) ja puhta vee instrumenti (mudel F7JA36507).

2.3. Proovide ettevalmistamine UPLC-Q-TOF-MS ja farmakoloogiliste katsete jaoks

WCD-d töödeldi samast partiistCistanche deserticolameie laboris. WCD valmistamiseks infundeeriti kuivad CD tükid (5 mm paksused) (100 g) riisiveiniga (30 ml), aurutati kõrgel rõhul (1,25 kPa) 4 tundi ja kuivatati seejärel 55 kraadi juures.

CD ja WCD jämedaid pulbreid leotati 1 0 korda 95% etanoolis 0,5 tundi, ekstraheeriti püstjahutiga 3 korda iga kord 1 tund ja filtreeriti ning filtraadid ühendati 3 korda. Etanool koguti alandatud rõhul ja ekstrakt saadi manustamiseks. Ekstrakt (1 ml) lisati 50% metanoolile, viies kogumahu 20 ml-ni, ja säilitati sisuanalüüsi jaoks 4 kraadi juures.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS CD ja WCD väljavõtete analüüsi tingimused

2.4.1. LCThMS analüütilised tingimused

Andmete kogumiseks ja töötlemiseks kasutati UPLC-MSThMS süsteemi koos MassLynx 4.1 Analyst tarkvaraga. Analüütiliseks kolonniks oli Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) temperatuuril 40 kraadi C. Liikuv faas oli 0,1% sipelghappe vesilahus (A) ja atsetonitriil, mis sisaldas 0,1% sipelghapet (B). Elueerimise gradient oli 0.{15}}–1.00 min 3% B-ga, 1,01-2.00 min 3% -11,5% B-ga, 2,01-3.{29 }} min 12% B-ga, 3,01–4.00 min 15% B-ga, 4,01–5.00 min 20% B-ga, 5,01–6.00 min 22-ga % B, 6,01–8.{49}} min 25% B-ga ja 8,01–9.{54}} min 10% B-ga. Voolukiirus oli 0,3 mLTh min ja süstimismaht 1,0 μL.

Negatiivse iooni režiimis kasutati Watersi kolmekordset neljakordset massispektromeetrit (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA), mis oli varustatud elektropihustusionisatsiooni (ESI) allikaga. Desolvatatsioonigaasiks oli lämmastik voolukiirusega 500 LThh temperatuuril 250 kraadi. Kõiki tuvastatud ühendeid mõõdeti mitme reaktsiooni jälgimise (MRM) režiimis; Tabelis 1 on toodud energiaparameetrid ja tabelis 2 analüüsitud komponentide kalibreerimiskõverad.

2.4.2. Võrdlusainete valmistamine

Tubulosiid A (302 mg), ehhinakosiid (300 mg), 2'-atsetüüllakteosiid (2,34 mg), akteosiid (2,45 mg), isoakteosiid (0,61 mg), tsistanosiid F ( Põhilahuse valmistamiseks lahustati metanoolis 2,14 mg, salidrosiid (3,39 mg), geniposidhape (2,84 mg), ajugool (1,58 mg) ja katalpol (2,39 mg). Põhilahus lahjendati metanooliga, et saada tööstandardsete lahuste jaoks sobivad kontsentratsioonid. Kõiki valmistatud lahuseid hoiti enne kasutamist 4 kraadi juures.

2.5. Loomamudelite ettevalmistamine ja rühmitamine

SD isasrotid (180–220 g) osteti ettevõttelt Liaoning Changsheng Biotechnological Co., loomaloa number: SCXK (Liao) 2015–0001. Kõikidel rottidel hoiti vaba juurdepääsu toidule ja veele 25 kraadi juures ja suhtelisel õhuniiskusel 30–50%. Loomi hoiti enne katseid 7 päeva.

Sada rotti jagati juhuslikult 10 rühma: tühja kontroll (BC) rühm, mudelkontroll (MC) rühm, positiivse kontrolli (PC) rühm, riisiveini kontrollrühm (WC), CD suure annusega (CD) -HD) rühm, CD keskmise annuse (CD-MD) rühm, CD väikese annuse (CD-LD) rühm, WCD suure annuse (WCD-HD) rühm, WCD keskmise annuse (WCD-MD) rühm ja WCD väikese annuse (WCD-LD) rühm. CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD ja CD-LDThWCD-LD annused olid vastavalt 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) ja 1,37 gTh (kg ∙ d). PC-rühma annus oli 1,646 gTh (kg ∙ d) ja WC rühma annus 1 mLTh100 g 40 päeva jooksul. 6. päeval pärast manustamist süstiti rottidele subkutaanselt kortikosterooni vesisuspensiooni (kortikosteroon + 0,1% dimetüülsulfoksiid + 0,1% Tween-80 + 0,9% naatriumkloriid), v.a. BC rühma jaoks [18]. Kortikosterooni kontsentratsioon oli 5 gThL ja annus 0,1 mLTh100 g. BC-rühma rottidele manustati sama annusena tavalist soolalahust + 0,1% dimetüülsulfoksiidi + 0,1% Tween- 80 + 0,9% naatriumkloriidi.

2.6. HPA teljefunktsioonide määramine

2.6.1. Kaalu, temperatuuri ja hoidmisjõu test

Kaalutesti tehti iga 3 päeva järel ja temperatuuri mõõdeti iga 6 päeva järel. katse ajal. 39. päeval mõõdeti tagajäseme maksimaalset jõudu haardemõõturiga. Rotid asetati siledatele platvormidele, pannes nende tagajäse mastist kinni haarama. Rotid haaravad instinktiivselt kinni mis tahes objektist, et vältida tagasiliikumist, kui saba tõmmatakse seni, kuni tõmbejõud ületab haarde. Kui rott kaotas haardevõime, suutis eelvõimendi automaatselt salvestada maksimaalse haardejõu.

2.6.2. T, CRH, ACTH, CORT ja kortisooli taseme määramine seerumis

Üks tund pärast viimast manustamist anesteseeriti rotid uretaanilahuse (20 gTh100 ml) intraperitoneaalse süstimisega. Seejärel koguti vereproovid, tsentrifuugiti seerumi saamiseks kiirusel 3500 p 15 minutit ja säilitati temperatuuril -20 kraadi. T, CRH, ACTH, CORT ja kortisooli kontsentratsioone mõõdeti roti ELISA komplektidega vastavalt tootja juhistele.

2.6.3. Vaatlused mikroskoobiga

Neerupealiste koe morfoloogilist struktuuri täheldati HE värvimisega. Neerupealiste kude fikseeriti 10% paraformaldehüüdis, dehüdreeriti etanoolis, muudeti läbipaistvaks ksüleenilahusega, sisestati tavapäraste meetoditega, lõigati 4 μm paksusteks viiludeks, vahastati ksüleenilahusega, hüdreeriti etanooligradiendiga ning värviti seejärel hematoksüliini ja eosiiniga. värvimislahus. Pärast ksüleeniga läbipaistvaks muutmist suleti plaat neutraalse kummiga ja vaadeldi mikroskoobi all.

2.6.4. Baxi, Bcl-2, kaspaasi-3, Fas ja FasL valgu ekspressiooni immunohistokeemiline värvimine neerupealises

Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud roti neerupealiste lõigud deparafineeriti ja rehüdreeriti pärast 4 μm paksusega lõikamist. Endogeense peroksidaasi aktiivsuse blokeerimiseks eelinkubeeriti sektsioone vesinikperoksiidi plokis 1 0 min. Lõigud kasteti 0,01 M tsitraati (pH 6,0) ja kuumutati keemiseni. Protseduuri korrati 5-10 minuti pärast. Pärast jahutamist pesti sektsioone PBS-ga (pH 7,2–7,6) 1–2 korda, jäeti toatemperatuurile umbes 5 minutiks ja pesti PBS-iga (pH 7,2–7,6) 2–3 korda. 5% BSA blokeeriv lahus lisati toatemperatuuril ja 20 minutit hiljem loksutati sektsioonil olev liigne vedelik maha. Lisati FasTh FasL, Bcl-2ThBax ja kaspaas-3 (1:100 lahjendatud PBS-iga) spetsiifilised lahjendatud primaarsed antikehad ja inkubeeriti 37 kraadi juures 1 tund või 4 kraadi üleöö. Sektsioone pesti 2–3 korda PBS-ga (pH 7,2–7,6). Seejärel lisati biotinüülitud kitse hiirevastast IgG-d ja sektsioone kuivatati 20–37 kraadi juures 20 minutit ja pesti PBS-ga (pH 7,2–7,6) 4 korda 5 minutit. Pärast põhjalikku pesemist PBS-is inkubeeriti sektsioone 30 minutit reaktiivide A ja B seguga, inkubeeriti PBS-iga 45 minutit ja lõpuks arendati 30 minutit DAB substraadiga (DAKO), enne kui need värviti kergelt hematoksüliiniga, dehüdreeriti, ja paigaldatud.

LOODUSLIK TUBULOOS SEKSUAALISTE TUBULOOSID SEKSUAALSE SENSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Immuunfunktsioonide määramine

2.7.1. Immuunorganiindeksi arvutamine

Üks tund pärast viimast manustamist anesteseeriti rotid uretaanilahuse (20 gTh100 ml) intraperitoneaalse süstimisega, seejärel eemaldati põrn ja harknääre ning kaaluti kohe steriilses kapotis. Põrna või tüümuse kaalukoefitsiendid (%) � põrna või tüümuse kaal (mg) Kehakaal (g).

2.7.2. T-lümfotsüütide alarühmade tuvastamine perifeerses veres

Splenotsüüte ja hemotsüüte inkubeeriti 30 minutit pimedas monoklonaalsete antikehadega anti-CD4 (PE) ja anti-CD8 (FITC). Lisati 2 ml erütrotsüütide lüsaati ja lahust segati vorteksiga. Lahus jäeti 10 minutiks pimedasse ja tsentrifuugiti 5 minutit. Supernatant visati ära, seejärel pesti lahust 3 korda jääkülma PBS-ga ja resuspendeeriti PBS-i permeabiliseerivas lahuses. 1 tunni jooksul pärast iga Mab värvimist analüüsiti voolutsütomeetria abil vähemalt 10,{11}} rakku.

2.7.3. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ja IFN-c taseme määramine seerumis

Üks tund pärast viimast manustamist anesteseeriti rotid uretaanilahuse (20 gTh100 ml) intraperitoneaalse süstimisega ja kõhuaordist võeti veri. Verd tsentrifuugiti seerumi saamiseks kiirusel 3500 p 15 minutit ja säilitati temperatuuril –20 °C. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ja IFN-c kontsentratsioonid tuvastati roti ELISA komplektidega vastavalt tootja juhistele.

2.8. CaM ekspressioon hüpotalamuse ja hüpofüüsi kudedes

TRIzol ekstraheeris hüpotalamuse ja hüpofüüsi kudedest kogu RNA. Pöördtranskriptsioon viidi läbi 10 μl kogu RNA-ga vastavalt tootja juhistele. Võrdseid koguseid cDNA-d analüüsiti qPCR abil dsDNA-d siduva värvaine (Promega, USA) ja CFX 96 reaalajalise PCR süsteemi (Bio-Rad, USA) juuresolekul, et vaadata erinevaid geene esialgse aktiveerimise tingimustes 95 kraadi juures 10 minutit, 40 denatureerimistsüklit 95 kraadi juures 15 sekundit ja lõõmutamise pikendamist 60 kraadi juures 1 min.

CaM ja -aktiini praimerid on toodud tabelis 1 ja -aktiini kasutati sisekontrollina. Iga proov normaliseeriti, kasutades sihtgeeni ja -aktiini kriitiliste lävede (Ct) erinevust. Tulemuse kirjeldamiseks kasutati järgmist võrrandit: ΔΔCt � (Ct sihtgeen − Ct -aktiini geen) katserühm − (Ct sihtgeen − Ct -aktiini geen) kontrollrühm. Seejärel võrreldi iga proovi mRNA tasemeid, kasutades ekspressiooni 2- ΔΔCt sihtmärkgeeni. Iga rühma tulemused keskmistati (tabel 3).

2.9. Statistiline analüüs

Kõiki andmeid analüüsiti SPSS-i tarkvara abil (versioon 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise kordusmõõtmiste dispersioonanalüüsiga (ANOVA). Tulemused väljendati kui keskmine ± standardhälve (SD), kasutades tarkvara GraphPad Prism (versioon 6.0, San Diego, CA, USA). Erinevusi P väärtusega alla 0,05 peeti statistiliselt olulisteks.

3. Katsetulemused

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalüüs

Parima eraldumise, piigi kuju ja lühikese analüüsiaja saavutamiseks uuriti meie esialgses katses kromatograafilisi tingimusi, sealhulgas kolonni, liikuvat faasi ja gradiendiprogrammi. Tüüpilised kromatogrammid MRM-režiimiga on esitatud joonisel 1.

Tabelist 4 näeme, et fenüületanoidglükosiidide sisaldus WCD-s suurenes võrreldes CD omaga, eriti ehhinakosiidi ja akteosiidi puhul, samas kui iridoidide sisaldus WCD-s vähenes.

3.2. HPA telje funktsiooni määrus

3.2.1. Kaalu, temperatuuri ja hoidmisjõu test

MC rühma ja katserühmade rottidel ilmnesid neeru-yangi puudulikkuse sümptomid järk-järgult pärast kortikosterooni manustamist. Sümptomid, nagu kaalulangus, hüpotermia, juuste läike kadu, longus vaim, reaktsiooni aeglustumine ning veetarbimise ja aktiivsuse märkimisväärne vähenemine, paranesid CD ja WCD rühmades oluliselt. Joonisel 2(a) on näidatud kaalumuutused. Iga ravimirühma kaal suurenes, eriti CDHD ja WCD-HD rühmades. Kõige väiksem oli kaalutõus MC rühmas. Joonisel 2(b) on näidatud temperatuurimuutused, mis olid MC rühmas madalaimad, ja temperatuur tõusis WCD-HD, WCD-MD ja WCD-LD rühmades.

Joonisel fig 2 (c) on näidatud, et BC rühma ja kõigi katserühmade hoidejõud suurenes ning WCD-MD rühm oli kõrgeim, mis näitas, et neeru-yangi puudulikkusest põhjustatud nõrkuse tunnused paranesid pärast manustamist.

3.2.2. T, CRH, ACTH, CORT ja kortisooli tasemed

Jooniselt 3 on näha, et võrreldes BC rühma omadega langes T, CRH, ACTH ja CORT tase roti seerumis (P < 0.01) ja kortisooli tase langes (P < 0.05) MC rühmas. Võrreldes MC rühma omadega, tõusis T tase WCD-HD ja WCD-MD rühmades (P < 0.01), CRH tase WCD-LD, WCD-MD ja WC rühmad paranesid (P < 0.01), ACTH sisaldus tõusis CD-HD, WCD-MD ja WCD-HD rühmades (P < 0,01), CORT tase tõusis CD-MD, WCD-MD ja WCD-HD rühmad (P < 0,01) ja paranesid CDHD ja WCD-LD rühmades (P < 0,05) ning kortisooli tase tõusis igas ravimirühmas.

3.2.3. Mikroskoopilise vaatluse tulemused

Neerupealiste kude võib jagada kortikaalseks kihiks ja medulla kihiks. Kortikaalsed kihid hõlmavad kera-, kimp- ja retikulaarseid kihte. Rakud sisaldavad rohkem lipiide ja medulla kiht koosneb peamiselt feokromotsütoomirakkudest ja vähesel määral kiulisest koest. Nagu on näidatud joonisel 4, leidsime, et BC rühmas oli kõik normaalne, samas kui MC rühmas oli neerupealiste koorel ilmne hüperplaasia, raku atroofia ja tiheduse suurenemine. Sibulakujuline riba paksenes ning poolläbipaistev fascikulaarne tsoon, kitsas zona reticularis ja väiksemad rakud näitasid ebaühtlast värvumist ja kapillaaride ummistumist. PC-rühmas olid nähtavad ajukoore ja medulla piirid. Kera- ja kimbuliste ribade rakud paiknesid ühtlaselt ning morfoloogiline struktuur oli taastunud. Sama paremat taastumist täheldati WCD rühmades ja WCD-MD rühma mõjud olid paremad kui WCD-HD ja WCD-LD rühmad. Neerupealiste morfoloogia CD-rühmades ei olnud nii hea kui WCD-rühmades.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%