Spinati metanooliekstrakt nõrgendab diabeetiliste rottide võrkkesta degeneratsiooni

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:On oletatud, et spinati metanoolekstrakt (SME) pärsib arenenud glükoosi lõppproduktide (AGE) moodustumist, mis suureneb diabeedi progresseerumise ajal, mistõttu on oluline teada, kas VKEdel on kasulik mõju diabeetilisele võrkkestale. Selles uuringus näitasid in vitro testid, et SME inhibeerib glükatsiooni, karbonüülrühmade moodustumist ja redutseerivate suhkrute või metüülglüoksaaliga inkubeeritud veise seerumi albumiini redutseeritud tioolrühma vähenemist. SME toimet streptozototsiini indutseeritud diabeetiliste rottide (STZ2) võrkkestale uuriti (n=10) ka normoglükeemilistel rühmadel, STZ, STZ rottidel, keda raviti SME-ga, ja STZ rottidel, keda raviti aminoguanidiiniga (anti-AGE-de võrdlus). rühm) 12 nädala jooksul. Võrkkesta lõigati ja immunovärviti ne-karboksümetüüllüsiini (CML), retseptori RAGE, NADPH-Nox4, indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (iNOS), 3-nitrotürosiini (NT), tuuma NF-kB, veresoonte endoteeli kasvufaktori ( VEGF), gliaalfibrillaarne happeline valk (GFAP), S100B valk ja TUNEL test. Lipiidide peroksüdatsioon määrati kogu võrkkestas malondialdehüüdi (MDA) tasemega. Tulemused näitasid, et diabeetilise võrkkesta puhul vähendas SME CML-RAGE kaaslokaliseerumist, oksüdatiivset stressi (NOX4, iNOS, NT, MDA), põletikku (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) ja apoptoosi (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Märksõnad:spinat; diabeetiline retinopaatia; täiustatud glükatsiooni lõpptooted; oksüdatiivne stress; põletik; RAGE; karboksümetüül-L-lüsiin

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Taimset dieeti on seostatud väiksema riskiga haigestuda kroonilistesse haigustesse, nagu rasvumine, 2. tüüpi diabeet ja südame isheemiatõbi. Spinat (Spinacia oleracea L.) on söödav lehtköögivili, mida tarbitakse kogu maailmas tänu sellele, et see sisaldab märkimisväärses koguses kiudaineid, vitamiine ja mineraalaineid [1,2]. On tuvastatud mitmed selle fütokemikaalid, sealhulgas klorofüllid, karotenoidid (luteiin ja zeaksantiin) [3] ja fenoolsed ühendid (flavonid, flavonoidid, kumariinid) [4-8] (vt lisa 1). On teatatud, et toiduna, vees lahustuva ekstraktina või külmkuivatatud kujul manustatuna spinatil ja selle tülakoididel on vähi-, rasvumusvastased ja hüpoglükeemilised omadused [9]. Spinati põletikuvastast toimet on demonstreeritud loomade endotokseemia mudelitel, rasvunud loomadel ja tervetel inimestel [9]. Selle antioksüdantset toimet uuriti inimese eesnäärmevähi rakkudes, rasvunud loommudelites, UV-kiirgusega kiiritatud hiirtel ja transgeense hiire eesnäärme adenokartsinoomiga [9, 10]. Spinati metanooliekstrakti (SME) glükoosivastast ja põletikuvastast toimet on uuritud vastavalt glükoosist põhjustatud diabeedi mudelis sebrakala ja isoproterenoolist põhjustatud müokardi nekroosi mudelis rottidel [11, 12]. SME vähendas glükosüülitud hemoglobiini ja fruktosamiini taset, sealhulgas glükeeritud valgu taset, vähendades aldoosreduktaasi aktiivsust läätse silmas [11]. Ülaltoodud leiud viitavad sellele, et VKEdel võib olla ennetav mõju suhkurtõve tüsistuste, näiteks diabeetilise retinopaatia (DR) progresseerumisele.

DR põhjustab järk-järgult nägemisteravuse kaotust või pimedaksjäämist, mis on seotud põletiku, oksüdatiivse stressi ja kaugelearenenud glükatsiooni lõppproduktide (AGE) kuhjumisega[13,14]. AGE-d indutseerivad valkude ristsidumist, muutes struktuuri/funktsiooni ja selle käivet/kliirensit. AGE-sid saab toota glükoosi ja valkude vaba aminorühma vahelisel mitteensüümse reaktsioonil, moodustades pöörduvaid vaheühendeid, nagu Schiffi alused ja Amadori produktid (fruktosamiin)[15]. Muud AGE-de moodustumise mehhanismid hõlmavad "karbonüülstressi" rada, kus suhkrute ja lipiidide oksüdeerimine loob dikarbonüüli vaheühendeid, nagu glüoksaal ja metüülglüoksaal (MGO), mis põhjustavad AGE-de moodustumist N:-karboksümetüüllüsiini (CML) kujul. 16]. Kõrgenenud CML-i tase seerumis ja klaaskehas võib olla biokeemiline marker nii DR-i ilmnemisel kui ka progresseerumisel [17,18]. Võrkkestas põhjustab RAGE-retseptori aktiveerimine AGE-de (AGE-RAGE) poolt gliiafibrillaarse happelise valgu (GFAP) ja põletikueelsete tegurite üleekspressiooni, mida reguleerib aktiveeritud B nukleaarfaktor kappa-kergeahela võimendaja. rakud (NF-kB)[19]. NF-kB reguleerib positiivselt RAGE ekspressiooni, toimides positiivse tagasiside mehhanismina [20].mis on cistancheTeisest küljest võivad kaltsiumi siduva valgu S100B kõrged kontsentratsioonid samuti aktiveerida NF-kB, kutsudes esile neuropõletiku ja gliiarakkude aktivatsiooni [21]. S100B üleekspressioon astrotsüütides kutsub esile neurotoksilisi toimeid, mis avalduvad võrkkesta astroglioosis [22].

Cistanche on vananemisvastane toime

Võrkkesta kahjustuste vältimiseks on eksperimentaalselt välja töötatud strateegiad. Mõned teistest taimedest eraldatud spinati fütokemikaalid on seostatud AGE-de ja oksüdatiivse stressi pärssimisega [8, 23-26]. Luteiin, astaksantiin ja kaempferool on kaitsnud inimeselt pärinevaid võrkkesta pigmentepiteelirakke (ARPE-19) kahjustuste eest nende anti-AGE-de, antioksüdantide ja apoptoosivastaste omaduste kaudu [26-28]. Need tulemused viitavad sellele, et spinati fütokemikaalidel on oluline roll võrkkesta degeneratsiooni, nagu DR, ennetamisel. Teine strateegia on olnud aminoguanidiini (AG) kasutamine glükatsiooni ja iNOS-i aktiivsuse tugeva inhibiitorina, mis nõrgendab CML-i akumuleerumist ja reaktiivsete dikarbonüülsete prekursorite moodustumist rottidel [29]. Kuid multitsentrilises ja randomiseeritud kliinilises uuringus, milles osales 690 diabeeti põdevat patsienti, ei olnud kasulikku toimet selgelt kindlaks tehtud [30].

Võrkkesta degeneratsiooni muutusi hüperglükeemilistes tingimustes on vähe uuritud. Seetõttu on huvitav teada, kas SME kaitseb võrkkesta kihte streptozototsiini poolt indutseeritud diabeetiliste rottide võrkkesta kahjustuste eest, mis on seotud selle anti-AGE, antioksüdantsete ja põletikuvastaste omadustega.

2. Materjalid ja meetodid

2.1.Spinati metanooliekstrakti valmistamine (SME)

Spinati (S.oleracea L.) värsked lehed korjati sügis-talvisel hooajal Mehhiko Puebla provintsi põllumajanduspõllult ja botaanik tuvastas need riikliku polütehnilise instituudi (IPN, Mexico City) herbaariumis. Mehhiko). Vautšeri näidis number 4532 deponeeriti IPN-i riikliku bioloogiateaduste kooli herbaariumis.

Lehed olid veetustatud ja peeneks jahvatatud. Kuivatatud lehti leotati toatemperatuuril metanooliga, filtreeriti läbi tselluloosfiltrite (Whatman, Maidstone, UK) ja kuivatati pöörleva vaakumaurustiga (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Šveits) 45 kraadi juures. annab rohelise kummi (95,0 g/kg kuivade lehtede kohta).Vananemisvastane cistancheSME-d hoiti kuni kasutamiseni pimedas temperatuuril 4 kraadi. Kõikide analüüside jaoks taastati ekstrakt destilleeritud vees[11].

2.2.VKE glükatsioonivastase aktiivsuse in vitro testid

2.2.1. Veise seerumi albumiinist (BSA-AGE) pärinevate täiustatud glükatsiooni lõpptoodete moodustumine

BSA-AGE test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [31]. Lühidalt, 10 mg/ml BSA (fraktsioon V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) lisati kas D-glükoosis 0,5 M, D-fruktoosis {{12 }},5 M või metüülglüoksaal 2,5 mM ja valmistati lahuses 0,1 M PBS (pH 7,4) ja 0,02 protsenti naatriumasiidi. Igale segule lisati SME kontsentratsioonid (5, 10, 25, 50, 100 ja 200 mg/ml) ja inkubeeriti seejärel 37 kraadi juures 4 nädalat. Seejärel eemaldati reageerimata suhkrud dialüüsi teel destilleeritud vee all kahe päeva jooksul temperatuuril 4 °C. BSA-AGE tasemed määrati fluorestsentsspektrofotomeetria abil (Ex370/Em 440 nm; mudel LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. BSA valgu glükeerimine suhkrute ja MGO redutseerimisega oli positiivne kontroll (BSA glükeeritud), samas kui negatiivse kontrollina (BSA glükeeritud-AG) kasutati aminoguanidiiniga (1 mg/ml) glükeeritud BSA inkubeerimist. Analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris.

2.2.2. Fruktosamiini analüüs

Fruktosamiini tase määrati nitrosinise tetrasooliumi (NBT) testiga [33], mis põhineb fruktosamiini võimel redutseerida NBT-d, moodustades leeliselistes tingimustes värvilise lõppprodukti formasaani. Kümme mikroliitrit kas kontrollproove või glükeeritud BSA-ga inkubeeritud SME kontsentratsioone (BSA-SME) lisati 90 μL NBT-le 2,5 mM juures, mis oli valmistatud karbonaatpuhvris (0,1 M; pH 10,3); kõiki inkubeeriti 37 °C juures 30 minutit. Mõõdeti neeldumine 530 nm juures. Fruktosamiini kontsentratsioonid (nmol/mg) arvutati formazaani standardkõvera järgi.

2.2.3. Karbonüülrühmade moodustumise ja tioolrühmade vähenemise määramine BSA-AGE-des

Karbonüülrühma kontsentratsiooni mõõdeti BSA-SME ja kontrollproovides vastavalt Levine et al. [34]. 2,4-dinitrofenüülhüdrasiini (DNPH; 10 mM) lahus 400 µl 2,5 M HCl-s lisati igale proovile 100 µl ja inkubeeriti pimedas 60 minutit toatemperatuuril.cistanche benefíciosSeejärel lisati 500 µl trikloroäädikhapet (20 massiprotsenti) ja hoiti 5 minutit jääl. Proove tsentrifuugiti kiirusel 4000 pööret minutis 15 minutit ja valgupelletit pesti kolm korda etüülatsetaadi/etanooli seguga (1:1 maht/maht). Seejärel suspendeeriti proovid 250 µl guanidiinvesinikkloriidis kuni 6 M. Karbonüülrühmade kontsentratsioon (nmol/mg valk) arvutati spektrofotomeetriliselt 370 nm neeldumise juures (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA), kasutades DNPH neeldumistegur (22 000 M-1 cm-1).

Vastavalt Ellmani meetodile viidi läbi tioolrühma ammendumise määramine BSA-SME ja kontrollproovides. Lühidalt, 10 μL 5,5'-disulfaandiüülbis(2-nitrobensoehapet) (DNTB; 10 mM, valmistatud PBS-is) inkubeeriti koos 50 μL glükeeritud proovidega 15 minutit toatemperatuuril, seejärel mõõdeti neeldumine 410 nm juures. Vabade tioolrühmade tase arvutati L-tsüsteiini (0.{12}} μM) standardkõvera abil ja väljendati ühikutes nmol/mg valgu [34].

2.3. SME mõju diabeetiliste rottide võrkkestale 2.3.1. Diabeedi esilekutsumine rottidel

Kasutati 8 tundi tühja kõhuga isaseid Wistari rotte, kes kaalusid 250 ± 10 g (N=40). Manustati intraperitoneaalne streptosototsiini annus (60 mg/kg) tsitraatpuhvris (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) [35]. Kolm päeva hiljem mõõdeti glükoosi taset (glükomeeter; ACCU-CHEK aktiivne; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Saksamaa), kogudes sabast tilga vereproovi. Uuringusse kaasati loomi, kelle glükeemiline tase oli üle 350 mg/dl. Vere glükoosisisaldust mõõdeti kord nädalas 12 nädala jooksul.

2.3.2. Eksperimentaalne disain

Streptosototsiinist indutseeritud diabeetilised rotid (STZ) jaotati juhuslikult järgmistesse rühmadesse (n =10): STZ-d, keda raviti intragastraalselt 2 ml joogiveega (STZ); STZ-ga töödeldud SME-ga 400 mg/kg (STZ-SME); normoglükeemilised rotid (NG); ja STZ-d, mida töödeldi 50 mg/kg aminoguanidiiniga (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG-d kasutati AGE-vastase võrdlusrühmana. Määratud annuseid manustati iga 24 tunni järel (kell 9.00) 12 nädala jooksul. Kõigi rühmade glükeemilist taset jälgiti kord nädalas. SME annustamisskeem 400 mg/kg põhines järgmisel: 7 g SME-d saadakse 100 g värskest spinatist (andmeid ei ole näidatud). See kogus on võrdne keskmise 70 kg inimese päevase tarbimisega Ameerika dieedis [36], mis vastab 100 mg ekstraktile 1 kg kehakaalu kohta.Cistanche ekstrakti kiirgusvastane toimeSeevastu rottide kiirendatud ainevahetuse erinevuse tõttu on inimestega tehtud võrdlusuuringuteks soovitatav iga loodusliku ekstrakti tarbimist suurendada kuni 6,4 korda [37]. Meie kasutatud annus 400 mg/kg põhines peamiselt Wistari rottidel indutseeritud müokardi nekroosi mudelis saadud tulemustel, mis näitasid, et SME põletikuvastane toime on 300 mg/kg juures olulisem [12].

2.3.3. Histoloogilised ja immunohistokeemilised hinnangud

Enukleeeritud silmad fikseeriti neutraalses formaliinis ja seejärel dehüdreeriti sorteeritud alkoholides ja sisestati parafiini. 2 μm suurused histoloogilised lõigud paigaldati elektrilaetud alusklaasidele, vahatustati ja rehüdreeriti kuni antigeeni taastamise lahuseni (K035; 10 × tsitraatpuhver, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Kasutati polümeeril põhinevat immuuntuvastussüsteemi (PolyVuemouse/rabbit DAB-tuvastussüsteem, Diagnostic BioSystems). Kasutati järgmisi primaarseid antikehi: gliiafibrillaarne happeline valk (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); veresoonte endoteeli kasvufaktor (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 kaltsiumi siduv valk B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) ja aktiveeritud B-rakkude tuumafaktori kappa-kerge ahela võimendaja (anti-NF-kB p65;sc-8008). Kõik lahjendused olid 1:200 ja inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures. Sekundaarne antikeha (Mouse/Rabbit PolyVueTM) lisati vastavalt tarnija juhistele.cistanche herbaSektsioonid värviti DAB plus/kromogeeni substraadi ja hematoksüliiniga. Histoloogilised vaatlused ja kujutiste jäädvustamine viidi läbi Carl Zeissi mikroskoobiga (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Saksamaa).

Immunofluorestsentsvärvimiseks inkubeeriti slaide üleöö temperatuuril 4 °C järgmiste primaarsete antikehadega: karboksümetüüllüsiin (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE retseptor (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oksüdaas 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotürosiin (anti-NT; ab110282) ja lämmastikoksiidi süntaas (indutseeritav) (anti-iNOS; A00368-1); Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Seejärel kasutati järgmisi sekundaarseid antikehi: anti-RAGE jaoks, kitse hiirevastane lgG(FITC)-konjugeeritud (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); anti-CML ja anti-NT puhul hiire küülikuvastane IgG-PE (SC-3753); ning anti-iNOS ja anti-Nox4 puhul m-IgGkBP-PE (Sc{29}}). Kõiki inkubeeriti toatemperatuuril 60 minutit. Seejärel paigaldati sektsioonid söötmesse, mis sisaldas 4',6-diamidiin-2'-fenüülindooldivesinikkloriidi (DAPI). CML-vastased ja RAGE-vastased antikehad hübridiseeriti samal slaidil. Fluorestsentskujutiste jaoks kasutati FLoidTM Cell Imaging Stationit (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA).

2.3.4.Apoptoosi hindamine

Võrkkesta rakkude apoptoos tuvastati vastavalt käsiraamatule, mida kirjeldati terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi (TdT)-vahendatud desoksüuridiintrifosfaadi (dUTP) hüüdotsa märgistamise (TUNEL) testiga, kasutades in situ rakusurma tuvastamise komplekti, TMR (tetrametüül-rodamiin{{). 3}}dUTP) punane, versioon 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Lühidalt, vahatustatud slaidid rehüdreeriti ja loputati kaks korda PBS-iga. Seejärel inkubeeriti neid TUNEL-i reaktsiooniseguga niisutatud atmosfääris 60 minutit temperatuuril 37 °C. Seejärel paigaldati lõigud DAPI-ga ja vaadeldi fluorestsentsmikroskoopias (FLoidTM Cell Imaging Station). TUNELi IOD arvutati võrkkesta kihtide jaoks.

2.3.5. Lipiidide peroksüdatsiooni test

Malondialdehüüdi (MDA) taseme hindamiseks võrkkesta koes homogeniseeriti ligikaudu 3 mg värsket kude (n=3) ja töödeldi nii, nagu eelnevalt teatatud [38]. MDA tasemed kvantifitseeriti vastavalt komplekti tarnija juhistele (OXItek-TBARS analüüsikomplekt, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4.Statistiline analüüs

Statistilise analüüsi jaoks jäädvustati kõik võrkkesta mikropildid suurusjärgus 200× 100 μm kaugusel nägemisnärvi piirkonnast. Analüüsiti ligikaudu 40 pilti loomarühma kohta (n=7). Pildianalüüs viidi läbi tarkvaraga Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Kasutasime GraphPad Prism tarkvara (La Jolla, CA, USA; versioon 8.0). Joonistel on kujutatud väärtused, mis on kujutatud kasti ja vurrude diagrammides (mediaan, esimene-kolmas kvartiil, minimaalne-maksimaalne väärtus) ganglionrakkude kihi (GCL), sisemise tuumakihi (INL) ja välimise tuumakihi (ONL) jaoks. Keskmine ja standardhälve (keskmine ± SD) on näidatud lisas A (tabelid A1-A3). Kõigil juhtudel viidi läbi ühesuunaline ANOVA test, millele järgnes Tukey test. lk<0.05 was="" considered="" statistically="">