Molekulaarsed tõendid melatoniini inhibeeriva potentsiaali kohta NaAsO2-indutseeritud vananemise vastu isastel rottidel 2. osa

Võtkeoscar.xiao@wecistanche.comRohkem infot

3. Arutelu

samuti kasutatakse seda laialdaselt põllumajanduses selle seenevastaste, antibakteriaalsete, herbitsiidide ja näriliste omaduste tõttu. Arseenipõhiste herbitsiidide, pestitsiidide ja kariloomade antibiootikumide laialdase kasutamise tulemusena [28]. Teisest küljest on MLT näidanud põletikuvastast, antioksüdanti ja vabu radikaale [29]. Reaktiivsete hapniku- ja lämmastikuliikide püüdmine ning antioksüdantse kaitse tugevdamine hoiab ära koekahjustused ja blokeerib põletikuvastaste tsütokiinide transkriptsioonifaktorid [30]. MLT aitab minimeerida arseenist põhjustatud oksüdatiivset stressi, nagu on näidatud selles uuringus. Kokkupuude ÷, 1/3 ja 1/10 LD50 NaAsO-ga põhjustas as-koe kontsentratsiooni suurenemist nii südame- kui ka kopsukoes annusest sõltuval viisil. Teisest küljest leiti, et MLT-ravi vähendab askoe kontsentratsiooni.cistanche varsMDA on lipiidide peroksüdatsioonimarker, mis mängib võtmerolli oksüdatiivse stressi tõusus, suurendades ROS-i ja varajases staadiumis põletikulisi markereid nagu TNF-o [31,32]. Erinevalt kontroll- ja MLT-rühmadest leidsime, et NaAsO2 kokkupuude põhjustas MDA ja seejärel ROS-i taseme olulise annusest sõltuva suurenemise. MLT-ravi näitas, et MASO2 indutseeritud MDA ja ROS-i tase on nii südame- kui ka kopsuproovides vastupidine. Meie tulemused on sarnased Taysi jt tulemustega, kes tuvastasid, et MLT võib kiiritusest põhjustatud oksüdatiivse vigastuse ümber pöörata [33]. HMGB1 on põletikuline tsütokiin, mis vabaneb põletiku hilinenud faasis. Leidsime kõrgeima HMGB1 taseme nii südame- kui ka kopsukudedes, mis puutusid kokku 1/2 LD50 NaAsO2-ga, isegi pärast kudede ekstraheerimist 30. analüüsipäeval. Teisest küljest põhjustas MLT-ravi HMGB1 madalama taseme.

Samamoodi näitasid plasmaproovid, mis puutusid kokku 1/2, 1/3 ja 1/10 LD50 NaAsO2-ga, TNF-α ja 8OHdG kõrget taset, mida MLT takistas, mis viitab selle rollile kaitsjana oksüdatiivse DNA kahjustuse vastu [34]. Kõrget laktaadisisaldust kasutatakse kudede hüpoperfusiooni ja mitokondriaalse puudulikkuse biomarkerina [35]. 30 päeva pärast suurenes laktaadi tase nii südame- kui ka kopsukoes, mis näitab, et NaAsO-l on kahjulik mõju mitokondritele. Teisest küljest leiti, et MLT kaitseb selle mõju eest, vähendades laktaadi taset mõlemas koes.

KSL15

Palun klõpsake siin, et rohkem teada saada

MLT kaitsvat toimet kinnitas ka KL, TERT ja TRADD mRNA ekspressioonitasemete hindamine. KL on tuvastatud geenina, mis mängib rolli vananemisprotsessis [36]. Rottidel vähendab arseniit tsirkuleerivat ja neeru KL-i ning põhjustab torukujulisi kahjustusi [37]. NaAsO2-ga kokku puutunud südamekoes avastasime annusest sõltuva olulise vähenemise (p<0.0001) in="" the="" expression="" of="" mrna="" kl,="" which="" was="" recovered="" after="" mlt=""><0.0001). our="" results="" were="" similar="" to="" those="" of="" a="" study="" conducted="" on="" kl="" mutant="" mice,="" a="" genetic="" model="" of="" aging,="" in="" which="" mlt="" minimized="" oxidative="" stress="" and="" memory="" loss="" associated="" with="" kl="" deficiency="" [38].="" the="" counteracting="" effect="" of="" mlt="" on="" aging="" was="" further="" confirmed="" in="" our="" study="" by="" the="" mrna="" tert="" gene="" expression="" level.="" in="" telomeres,="" which="" are="" strongly="" conserved="" and="" susceptible="" to="" age-dependent="" gradual="" attrition="" [39],="" naaso2="" effectively="" doubled="" tert="" gene="" mrna="" expression="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" at="" the="" same="" time,="" mlt="" appeared="" to="" reduce="" and="" normalize="" tert="" overexpression="" in="" the="" treatment="" groups,="" indicating="" that="" mlt="" counteracts="" naaso2-induced="" heart="" tissue="" aging.="" tradd="" is="" a="" cell="" death="" gene="" that="" contributes="" to="" tissue="" aging="" by="" activating="" nf-kb="" and="" inducing="" apoptosis="" [4041].="" the="" apoptosis-inducing="" effect="" of="" naaso,="" on="" heart="" tissues,="" was="" confirmed="" by="" a="" significant="" increase="" in="" tradd="" gene="" mrna="" expression,="" which="" was="" decreased="" by="" mlt="" treatment.="" this="" indicates="" that="" mlt="" treatment="" restores="" regular="" tradd="" gene="" mrna="" expression="" and="" thus="" prevents="" heart="" tissue="" injury="" (figure="" 5).="">cistanche tubulosa eelised ja kõrvaltoimedSelles uuringus eelistati mõlema aine IP-manustamist suukaudsele marsruudile, et vältida seedetrakti võimalikku muutmist ja lagunemist. Lisaks tagab intellektuaalomandi manustamine suukaudsest kiirema ja usaldusväärsema imendumise, tagades näriliste eksperimentaalsetes uuringutes nii väikeste kui ka suurte mõjurite optimaalse biosaadavuse [42].

Mitmed uuringud ja ülevaated näitavad, et melatoniin avaldab oluliselt suuremat kaitseefekti kui klassikalised antioksüdantid [43]. Nendes uuringutes leiti, et melatoniin on efektiivsem kui E-vitamiin[44-46], beetakaroteen [47l ja askorbiinhape[48,49]. Lisaks on kliinilistes tingimustes, sealhulgas kroonilistes haigustes, nagu reumatoidartriit, [50] vere hüpertensioon [51] ja isheemia [52] teatatud melatoniini kasulikust antioksüdantsest toimest võrreldes vitamiinidega. Samamoodi leidsime, et kokkupuude NaAsO2-ga põhjustab kopsudes ja südame kudedes oksüdatiivset stressi, mis sõltub ravimist ja keemilisest toksilisusest. Kõrgel, LD50 NaAsO2 kokkupuute tasemel, TNF-α ja 8OHdGin plasma ja MDA, ROS ja HMGB1 südame- ja kopsukudedes tõusid. Need faktid näitavad, et NaAsO, kokkupuude vallandas oksüdatiivse stressi kopsu- ja südamekudedes, tekitades MDA-d ja ROS-i ning suurendades põletikuvastaste tsütokiinide, näiteks TNF-α vereringet. Kudede hüpoperfusioon, mitokondriaalne puudulikkus ja põletik võivad olla põhjustatud kõrgest koe laktaadi ja HMGB1 tasemest. Suurenenud plasma 8OHdG tase viitab sellele, et NaAsO2 põhjustab DNA kahjustusi. Histoloogilise analüüsi kohaselt põhjustas NaAsO2 annus 1/2 rottide südamekudedes rakkude nekroosi, mis oli korrelatsioonis TERT ja TRADD geeni mRNA ekspressiooni tulemustega, näidates arseeni apoptoosi indutseeriva toime olulist suurenemist südame kudedele (joonised 4 ja 5). Kuid MLT ja NaAsO2 kombineeritud kasutamise korral oli nekroosi kliirens MLT olemasolul palju tugevam ja kiirem kui selle puudumisel. Seda kliirensit tõendab TERT- ja TRADD-geenide mRNA ekspressioonitaseme langus. Analoogselt vähendas MLT arseeni toksilist toimet histoloogiliselt uuritud kopsuproovides, korrelatsioonis põletikulistest ja oksüdatiivsetest stressi biomarkeritest saadud tulemustega ning hüpereemia, turse ja põletikuliste rakkude skoori vähenemisega (tabel 4). Lisaks vähendas NaAsO2 kokkupuude KL mRNA ekspressiooni ning suuremat TERT ja TRADD mRNA ekspressiooni, mis viitab südamekoe vananemise ja rakusurma riskile.

Teisest küljest vähendas MLT-ravi MDA, ROS, HMGB1 ja laktaadi taset kopsu- ja südamekudedes, samuti TNF-c ja 8OHdG taset plasmas. Samuti suurendas see KL geeni mRNA ekspressiooni, pärssides samal ajal TERT ja TRADD geenide mRNA ekspressiooni. See näitab, et MLT kaitseb kopsu- ja südamekudesid, pöörates ümber NaAsO poolt käivitatud oksüdatiivse stressist tingitud vananemise riski. Siiski on vaja rohkem uuringuid, et uurida MLT kaitsvat rolli arseeni põhjustatud vananemise vastu teistes kudedes, nagu maks ja neerud, ning MLT efektiivsust kudede arseeni taseme alandamisel.

KSL16

Cistanche võib vananemisvastane

4. Materjalid ja meetodid

4.1.Kemikaalid

MLT (CAS number 73-31-4), NaAsO2 (CAS number 7784-46-5), Suprapur HNO3 (Merck, Darmstadt, Saksamaa) ja kõik muud selles uuringus kasutatud kemikaalid osteti Sigma-Aldrichist (GmbH, München, Saksamaa). Laktaadi isolatsioonikomplekt ja ELISA komplekt suure liikuvusega kontserni box1 (HMGB1) analüüsi jaoks osteti ZellBio GmbH-lt (Ulm, München, Saksamaa) ning TNF-α analüüsikomplekt saadi Diaclone'ist (Besancon Cedex, Prantsusmaa). Thermo Scientific Revert Aidi esimene tegevussuund cDNA Synthesis Kit saadi Thermo Fisherilt (Vilnius, Leedu).

4.2.Eetiline heakskiit

Loomade käitlemine, hooldamine, tapmine ja muud loomadega seotud protseduurid viidi läbi kooskõlas loomkatsetega: In Vivo eksperimentide (AR-RIVE) suuniste aruandlus. Biokeemilised ja laboratoorsed uuringud ja katsed viidi läbi vastavalt headele laboritavadele.cistanche tubulosa ekstraktRiikliku meditsiiniuuringute arendamise instituudi (NIMAD) uurimiskomitee andis sellele uuringule eetilise heakskiidu, mis hõlmas loomade kasutamist ja ravi koodinumbriga IR. NOMAAD. REC.1397.542.

4.3.Õppedisain

Selles uuringus kasutasime isaseid hiiri, mitte naisi, sest naissuguhormoonide taseme tsüklilised variatsioonid võivad mõjutada toksikoloogilisi uuringuid. Seega saadi terved ja haigusvabad täiskasvanud 30-35 g meessoost NMRI hiiri vanuses 7 kuni 8 nädalat Teherani meditsiiniteaduste ülikooli farmaatsiateaduskonna loomamajast Teheranis, Iraanis. Neid hoiti kontrollitud keskkonnatingimustes, sealhulgas toatemperatuuril 20–25 °C, suhtelises niiskuses 50–55% ning heledas ja pimedas perioodis 12 h. Neil oli vaba juurdepääs tavalisele dieedile ja veele. Hiired jagati kaheksasse kuuest hiirest koosnevasse rühma. 1. rühm sai standardse normaalse dieedi. 2. rühmale manustati intraperitoneaalset (IP) süsti vastavalt 10 mg/kg ööpäevas MLT, grupp 3, 4 ja 5 said vastavalt 1,5(1/10 LD50), 5(1/3 LD50) ja 7,5(1/2 LD50) mg/kg NaAsO2. 6., 7. ja 8. rühma süstiti intraperitoneaalselt vastavalt 1,5(1/10 LD50), 5(1/3 LD50) ja 7,5 (1/2LD50) mg/kg NaAsO-ga koos 10 mg/kg/päevas MLT-ga vastavalt katse viimase kümne päeva jooksul. Pärast ühekuulist ravi kasutati hiirte tapmiseks 100 mg/kg ketamiini ja 10 mg/kg ksülasiini intellektuaalomandisüste. Vereproovid koguti EDTA ja seerumi eraldajate torudesse. Südamed ja kopsud eemaldati kohe ja külmutati biokeemilise analüüsi jaoks -80 °C juures. Kude koguti südame- ja kopsuproovidest patoloogiliseks uurimiseks. Pärast pesemist steriilse fosfaadipuhvriga (pH 7.4) hoiti neid 10 ml 10% formaliinis (joonis 6).

4.4. Kogu koe arseeni hindamine induktiivselt seotud plasma massispektromeetri abil

Kogu arseen proovikudedes määrati induktiivselt ühendatud plasmamassispektromeetri (ICP-MS) abil (Perkin Elmer ELAN 6100 DRC-e). Instrumendi parameetreid on mainitud täiendavas tabelis S1. Igast proovist lisati 0,20 g-le kaks ml fosfaadipuhvrit ja kuded homogeniseeriti põhjalikult.cistanche tubulosa arvustusedHomogeniseeritud koed viidi klaasist katseklaasidesse ja kuivatati liivavannis temperatuuril 120 °C (umbes üleöö). Pärast seda, kui proovid olid jõudnud toatemperatuurini, täideti iga toru 0,5 ml kontsentreeritud HNO3-ga ja kuumutati kaks päeva. Temperatuurid ei ületanud 120 °Cduring kütteprotsessi. Seejärel lisati igale katseklaasile 0,5 ml kontsentreeritud HNO3, kuni valge tuhk jäi alles. Pärast seedimise lõpetamist ja lahuste jahtumist lisati igale klaastorule 1 mL10% HNO ja ultraheliga rikastati 30 minutit 50 °C juures. Klaastorude sisu kanti üle 5 ml mahulisse kolbi ja kalibreeriti märgile 10% HNO3,10% HNO3-ga, mida kasutati standardlahuste valmistamiseks kontsentratsiooniga 1, 5, 10 ja 15 ug/L as-ist ning sisestandardi lahendusena kasutati Germaaniumi standardlahust (5 g/L) [53].

4.5. Oksüdatiivse stressi biomarkerite hindamine

Tiobarbitriinhappe reaktiivaine (TBARS) analüüsi kasutati lipiidide peroksüdatsiooni (LPO) aktiivsuse mõõtmiseks, arvutades malondialdehüüdi (MDA) taseme südame- ja kopsukudedes. Südame- või kopsukoe proovid 0,15 g homogeniseeriti fosfaadipuhvri soolalahuses (PBS), segati 800 ml trikloroateetilise happega ja tsentrifuugeeriti 40 minutiks 3000 g juures. Seejärel lisati 600mL supernatandile 150 ml 1% w/v Tioobarbiturhapet ja asetati keevasse vette 15 minutiks. Lõpuks lisati 400 ml n-butanooli ja kasutati spektrofotomeetrit, et teatada neeldumisest 532 nm juures [54].

KSL17

4.6. Reaktiivsete hapnikuliikide hindamine

Südame- ja kopsuproovide ROS-i tase arvutati vastavalt eelnevalt kirjeldatud protokollile [55];100 mg igast värskest südame- ja kopsukoe proovist homogeniseeriti ekstraheerimispuhvri lahusega, mis sisaldas HEPES-i (5 mM), KCl (20 mM), EDTA(1 mM) ja sahharoosi (0,25 M), pH =7,4 igasse viaalifosfaadipuhvrisse ja tsentrifuugeeriti 10000 g juures 10 minutit 4 °C juures pärast DL-dithiothreitoli(DTT) lisamist, 50 uM). Järgmises etapis segati südame- ja kopsukoe proovide supernatantsid 80 μL analüüsipuhvriga ja 5uL DCFH-DA(5uM) 15 minuti jooksul 37 °C juures;2',7'-diklorofluorestseiini diatsetaat (DCF-DA) on rakkudesse tungiv fluorogeenne aine, mis muundub 2',7-diklorodihüdrfluorestseiiniks (DCFH). DCFH katalüüsiti seejärel rakusiseselt ja ROS-oksüdeeriti 2'7'-diklorofluorestseiiniks (DCF). Lõpuks mõõdeti DCF-i neeldumist iga 5 minuti järel mitmerežiimilise mikroplaadi spektrofotomeetri lugejaga (BioTek(8), SynergyM HT, Winooski, VT, USA) 60 minutiks ergastus- ja emissioonispektriga vastavalt 488 nm ja 525 nm. ROS-analüüsist saadud andmete standardimiseks kasutati valgu taseme määramiseks iga lahjendatud koeproovide rühma. Kokkuvõttes lisati 100 uL-i lahjendatud proovidele 10 μL Bradfordi reaktiivi ja pärast inkubeerimist toatemperatuuril 15 minutit loeti iga proovi neeldumist 595 nm juures.

4.7.Põletikuvastaste tsütokiinide hindamine

Hinnati põletikuvastast tsütokiini taset, st TNF-α plasmas ja HMGB1 südame- ja kopsuproovides. Neid peetakse sepsise peamiseks vahendajaks varases ja hilises faasis [56]. HMGB1 tase viidi läbi südame- ja kopsukudede puhul, mida hoiti temperatuuril 80 °C. 100 mg iga looma isoleeritud südame- ja kopsukudesid isoleeriti ja homogeniseeriti fosfaadipuhvri soolalahuses (PBS). TNF-α ja HMGB1 tasemed kvantifitseeriti vastavalt tootja protokollile. Neelduvus oli hinnanguliselt 450 nm.cistanche UKTNF-α ja HMGB1 tasemed registreeriti vastavalt pg/mg valkudes ja ng/mg valkudes.

4.8.DNA kahjustuste hindamine

Kaheksa-hüdroksü-2-desoksüguanosiin (8OHdG) on DNA oksüdatiivse kahjustuse tulemus. See on DNA kahjustuste oluline biomarker. Plasma tase 8-hüdroksü-2-deoksü guanosiini (8OHdG) määrati vastavalt 8OHdG ELISA komplektile (ZellBio GmbH [Ulm, Saksamaa]).

4.9.Laktaadi taseme hindamine

Koeproovi laktaadi taset mõõdeti kolorimeetrilise laktaadi analüüsikomplekti abil vastavalt esitatud protokollile (ZellBio GmbH[Ulm, Saksamaa]). Lühidalt öeldes homogeniseeriti 10 ml perkloorihapet 8% 100 mg südame- ja kopsuproovidega. Laktaadisisalduse mõõtmiseks rakendati standardkõverat ja registreeriti koevalgu mmol/mg.

4.10.Kvantitatiivne reaalajas pöördtranskriptsioon PCR geeniekspressiooni jaoks

MLT ja NaAsO2 funktsiooni tuvastamiseks geeniekspressioonis mRNA tasemel kasutati kvantitatiivset reaalajas pöördtranskriptsiooni PCR(qRT-PCR). Sellega seoses hinnati kolme erinevate molekulaarsete radadega seotud geeni: TERT, 1. tüüpi surmadomeeni kasvaja nekroosifaktori retseptor (TRADD) ja KL (seotud Klotho aktiivsusega). Koe RNA ekstraheeriti külmutatud südameproovidest RNX-Plus lahuse (SinaClon, Iraan) protokolli abil. RNA puhtust arvutas spektrofotomeetriliselt Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Scientific, Boston, MA, USA). RNaasivaba DNase I Kiti kasutati genoomse DNA eemaldamiseks, seejärel üks mikrogramm ekstraheeritud RNA-d transkribeeriti cDNA-ks. Sihtgeenid on normaliseeritud Glükeraldehüüdi 3-fosfaadi dehüdrogenaasi (GAPDH) geeniga sisekontrollina. LightCycler(3)96 Süsteemi (Roche, Indianapolis, IN, USA) kasutati qRT-PCR analüüsiks. Kasutati SYBRgreeni põhisegu ja qRT-PCR viidi läbi tingimustes, st üks tsükkel temperatuuril 94 °C 10 min, 40 tsüklit 95 °C juures 15 s ja lõõmutustemperatuur 30 ja seejärel 72 °C 25 s. Tulemused esitati vastavalt Pfaffle meetodile [57]. Käesolevas uuringus kasutatud konkreetsed praimerid on näidatud tabelis 5.

4.11.Histoloogilised Ex Viro hindamised

Südame- ja kopsukoe proovid koguti pärast loomade ohverdamist 30. päeval, samas kui koeproove hoiti 10 ml 0,9% NaCl lahuses. Proovid fikseeriti 10% neutraalse puhverdatud formaliiniga (NBF, PH.7.26) 48 tunniks, manustati parafiini ja lõigati 5 um sektsioonideks. Sektsioonid värviti hematoksüliini-eosiiniga ja sõltumatu eksamineerija hindas seda kerge mikroskoopia abil (Olympus BX51; Olümpos, Tokyo, Jaapan).

KSL18

4.12. Statistiline analüüs

Tulemused esitati keskmise ±standardina keskmise veana (SEM). Statistilist olulisust hinnati ühesuunalise dispersioonianalüüsi (ANOVA) abil, mille statistiline tähtsus oli p<>

5. Järeldused

Järeldame, et MLT-ravi võib aidata vähendada NaAsO2 indutseeritud oksüdatiivset stressi vahendatud vananemist. NaAsO2 põhjustab kopsu- ja südamekudedes oksüdatiivset stressi, põletikku, DNA kahjustusi ja rakusurma, tõstes MDA, ROS, laktaadi, HMGB1, TNF-αx ja 8OHdG taset, mis võib põhjustada kudede vananemist ja vigastusi, mida tõendab NaAsO poolt indutseeritud KL-i mRNA ekspressiooni taseme langus ning TERT ja TRADD geenide suurenenud ekspressioon (joonis 7). Teisest küljest vähendas MLT-ravi NaAsO2 annusest sõltuvat toksilisust. On tõestatud, et MLT kaitseb kopse ja südant NaAsO2 poolt indutseeritud koekahjustuse ja vananemise eest, vähendades oksüdatiivse stressi, põletiku, DNA kahjustuste riski ja normaliseerides KL, TERT ja TRADDgenes mRNA ekspressiooni taset.