SLC37A2, fosforiga seotud molekul, mis suurendab silelihaste rakkudes kaltsineeritud aormas

Vaskulaarne lupjumineon peamine allikassüdame-veresoonkonna haiguskroonilise neeruhaigusega patsientidel.Hüperfosfateemiasuurendab intratsellulaarset fosfori sissevoolu, mis viib osteoblastilaadsete rakkude arvu suurenemiseni veresoonte silelihasrakkudes. PiT-1 transpordib fosfaati veresoonte silelihasrakkudes. Siiski ei ole veresoonte lupjumise mehhanism täielikult mõistetav. Selles uuringus uuriti fosforiga seotud kandidaatmolekule peale PiT-1. Me oletasime, et fosforiga seotud molekulid, mis kuuluvadlahustunud aine kandja(SLC) superperekond oleks seotud veresoonte lupjumisega. DNA mikrokiibi analüüsi tulemusena keskendusime SLC37A2-le ja näitasime, et nende rakkude mRNA ekspressioon suurenes kaltsineeritud aordi silelihasrakkudel (AoSMC). On teatatud, et SLC37A2 transpordib nii glükoosi-6-fosfaadi/fosfaadi kui ka fosfaadi/fosfaadi vahetust. In vitro analüüs näitas, et AoSMC põletik ei mõjutanud SLC37A2 ekspressiooni. SLC37A2 mRNA ja valgu ekspressioon suurenes kaltsineeritud AoSMC-s. In vivo analüüs näitas, et SLC37A2 mRNA ekspressioon aordiskrooniline neeruhaigusrottidel oli korrelatsioonis osteogeensete markergeenidega. Lisaks ekspresseeriti SLC37A2 veresoonte lupjumise piirkonnaskroonilise neeruhaigusega rotid. Selle tulemusena näitasime, et SLC37A2 on üks molekulidest, mis suurenevadveresoonte lupjuminein vitro ja in vivo.

Võtmesõnad: SLC37A2,veresoonte lupjumine, aordi silelihasrakud,krooniline neeruhaigus, hüperfosfateemia

25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDI NEERUTUNGIMISEKS LOODUSLIKU ORGAANILISE TASTANHEKSTRAKTI SAAMISEKS KLIKI SIIA

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-pood

Kuna patsientide arv, kellelkrooniline neeruhaigus(CKD) suureneb patsientide arvvajavad dialüüsisuureneb samuti. Enamik surmajuhtumeid läbivatel patsientideldialüüson tingitudsüdame-veresoonkonna haigusednagu näitekssüdamepuudulikkus, tserebrovaskulaarsed häiredvõi müokardiinfarkt. (,2) Peamine allikassüdame-veresoonkonna haiguson emakaväline lupjumine,() kõrvalekalle, mis on põhjustatud kaltsiumfosfaadi kristallide moodustumisest ja ladestumisest pehmetes kudedes. (4 6) Erinevad tegurid, näiteks põletik. oksüdatiivne stress ning plasma kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) taseme tõus on seotud veresoonte lupjumise progresseerumisega. Nendest teguritest on hüperfosfateemia kõige tugevamalt seotud veresoonte lupjumisega. (7.8) Hüperfosfateemiat põhjustab P liigne tarbimine neerufunktsiooni languse korral. Seetõttu peavad dialüüsi saavad patsiendid piirama P tarbimist. (79-12) Siiski on teatatud, etveresoonte lupjumineedeneb juba dialüüsi alustamisel; seda on täheldatud ka varajases staadiumis kroonilise neeruhaigusega patsientidel, kui hüperfosfateemiat ei esine. (3) Järelikult on eluprognoosi parandamiseks oluline vältida veresoonte lupjumist varajases staadiumis kroonilise neeruhaigusega patsientidel.

mis põhjustab P suurenenud sissevoolu veresoonte silelihasrakkudesse (VSMC). P sissevool toimub VSMC rakumembraani pinnal oleva transporteri PiT-1 kaudu. PiT- on lahustunud kandja (SLC) superperekonna liige, mis sisaldab naatriumfosfaadi transporterit, mida kodeerib SLC20A1.04 PiT- transpordib fosfaati läbi Na-sõltuvate rakumembraanide ja seejärel maatriksi mineraliseerumise kõrgenenud p taseme tõttu. P tase tõuseb, VSMC hakkab ekspresseerima osteogeenseid transkriptsioonifaktoreid, nagu näiteks runt-seotud transkriptsioonifaktor 2 (Runx2) (16) Sellele efektile järgneb osteoblastispetsiifiliste geenide, nagu osteopontiin ja osteokaltsiin, suurenenud ekspressioon. Lisaks vähendas silelihasspetsiifiliste valkude ekspressiooni. nagu silelihaste valk 22-0 (SM22-0), esineb. Selle tulemusena muundatakse VSMC osteoblastilaadseteks rakkudeks. (1718) Hiljutised kliinilised uuringud on näidanud, et kaltsiumisisaldus veres. valguosakesed (CPP), mis esindavad kaltsiumfosfaadi kolloidosakesi, suurenevad neerufunktsiooni langusega. (19-21)Lisaks on teatatud korrelatsioonidest vere CPP ja P tasemega.2o2i) Võimalik, et CpP võib vallandada veresoonte lupjumise progresseerumise.22-24)

Siiski on varajases staadiumis kroonilise neeruhaigusega patsientidel, kellel on normaalne plasma P tase, täheldatud veresoonte lupjumist. (13) Lisaks ekspresseerub PiT-1 mRNA kõikjal kõikides kudedes. Seega võib teine ​​molekul toimida peamiselt veresoonte lupjumise piirkonnas. On teateid, etpõletiksoodustab veresoonte lupjumist. Põletikulised tegurid nagu interleukiin (IL)-1B, IL-6 ja kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF-a) kutsusid esile VSMC diferentseerumise osteoblastilaadseteks rakkudeks (2s26) TNF-a kutsub esile veresoonte lupjumise cAMP raja kaudu, mis mängib rolli osteoblastide diferentseerumises.2728) IL-6 reguleerib erinevaid teid, mis viivad VSMC veresoonte lupjumiseni2-31) Lisaks. IllB, IL-6 ja TNF-a on samuti tegurid, mis on seotud vaskulaarse kaltsifikatsiooni suurenemisega, mis on põhjustatud kõrgetest p-tasemetest.3233) Siiski. praegused andmed ei selgita täielikult veresoonte mehhanismi

nende tegurite põhjustatud lupjumine. Me oletasime, et veresoonte lupjumises võivad olla ka teised P-ga seotud molekulid, näiteks SLC superperekonnas olevad molekulid. Keskendusime SLC superperekonna membraanivalkudele ja uurisime potentsiaalseid P-ga seotud kandidaatmolekule peale PiT-1 veresoonte lupjumises osalemiseks. Lisaks uurisime videos ja in vivo kandidaatmolekulide ja veresoonte lupjumise vahelist seost.

Materjalid ja meetodid

Rakukultuur. Normaalsed humanaorticsmoothmuscle rakud (AoSMC) saadi ettevõttest Lonza (Basel, Šveits) AoSMC kultiveeriti vastavalt tootja juhistele. AoSMC-sid hoiti kasvusöötmes (silelihasrakkude basaalsöötmega, millele oli lisatud 5% veise loote seerumit (FBS), epidermise kasvufaktorit, insuliini, fibroblastide kasvufaktorit-B ja gentamütsiini/amfoteritsiin-B). Meediat vahetati ülepäeviti. AoSMC kasvatati niisutatud 5% CO inkubaatoris 37 kraadi juures ja hoiti kuni konfluentsuse saavutamiseni ja kasutati seejärel katsetes.

Lupjunud AoSMC. AoSMC kaltsifikatsioon indutseeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud.435) AOSMC-sid kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes, millele oli lisatud 15% FBS-i ja penitsilliini-streptomütsiini, ning kultiveeriti 2,6 mM P-ga 3, 6, 9, 14 päeva ja 12 päeva. P kontsentratsiooni reguleeriti P puhvriga NaH, PO/Na ja HPO. pH 7,2). Teisi AoSMC-sid ei kasvatatud 2, 6 mM P-ga.

DNA mikrokiip. Kasutati 2,6 mM P-ga kultiveeritud ja mitte kultiveeritud AoSMC proovide kogu RNA-d. Kogu RNA 5.0 ug analüüsiti DNA mikrokiibi abil (Agilent Technologies, Tokyo, Jaapan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray'i kasutati umbes 26,000 geeni uurimiseks. Suhe arvutati, jagades 12 päeva jooksul 2,6 mM kultiveeritud AoSMC ekspressioonitaseme 2,6 mM P-ga kultiveerimata AoSMC ekspressioonitasemega

DNA mikrokiip

Kasutati 2,6 mM P-ga kultiveeritud ja mitte kultiveeritud AoSMC proovide kogu RNA-d. Kogu RNA 5.0 ug analüüsiti DNA mikrokiibi abil (Agilent Technologies, Tokyo, Jaapan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray'i kasutati umbes 26,000 geeni uurimiseks. Suhe arvutati, jagades 12 päeva jooksul 2,6 mM kultiveeritud AoSMC ekspressioonitaseme ekspressioonitasemega AoSMC-s, mida ei kasvatatud 2,6 mM P-ga. SLC37A2 ekspressioon vaskulaarse põletiku korral. Põletikulise reaktsiooni esilekutsumiseks AoSMC-s kultiveeriti rakke kasvusöötmega, kuni nad jõudsid liitumiseni, ja töödeldi seejärel 1 ugmL lipopolüsahhariididega (LPS) (LPS, mis on pärit escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) 24 ja 72 tundi ilma 2,6 mM P. Teisi AoSMC-sid ei kasvatatud reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsiga. Kogu RNA ekstraheeriti AoSMC-st, mida töödeldi LPS-iga 24 ja 72 tundi, ja rakke, mida LPS-iga ei töödeldud. SYBR rohelisel põhinev kvantitatiivne reaalajas PCR viidi läbi, kasutades sünteesitud cDNA-d ja iga sihtgeeni jaoks sobivat praimerite komplekti aStepOnePlus reaalajas PCR süsteemiga (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Praimeri järjestused olid järgmised: inimese IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' ja 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; inimese SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' ja 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaas (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- ja 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3}.IL-6 ja SLC37A2 mRNA ekspressioonitasemed arvutati pärast normaliseerimist SLCcal37 PD-ga2AGA-ga ekspressiooniga AoSMC. Kokku ekstraheeriti AoSMC-st, mida ei kasvatatud 2,6 mM P-ga ja AoSMC rakke, mida kultiveeriti 2,6 mM P-ga 3, 6, 9, 12 ja 14 päeva. Reaalajas PCR viidi läbi, kasutades sünteesitud cDNA-d. Praimeri järjestused olid järgmised inimese Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' ja 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Runx2 ja SLC37A2 mRNA ekspressioonitasemed arvutati pärast normaliseerimist APPH-ga.

Western blot analüüs.

Kogu valk koguti AoSMC proovidest, mida kultiveeriti samades tingimustes, mida kasutati reaalajas PCR analüüsiks. Need proovid lüüsiti Tris-puhverdatud soolalahusega (pH 75), millele oli lisatud 5% NP-40 ja 1% proteaasi inhibiitori kokteili. Valgu kontsentratsiooni proove mõõdeti BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific. Waltham, MA) abil. ja kontsentratsiooni reguleeriti Western blot analüüsiga, 10 ug valku eraldati 10% polüakrüülamiidgeelis, kasutades naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi. Membraani töödeldi SLC37A2 antikehaga (Novus Biologicals, Centennial, CO) või GAPDH antikehaga (GeneTex, Irvine, CA) kui primaarsete antikehadega, inkubeeriti Rabbit lgG mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud antikehaga (R&D Systems, Minneapolis, MN). ja visualiseeritakse Amersham ECL Selecti (GE Healthcare. Buckinghamshire, Inglismaa) ja luminestsentskujutise analüsaatori (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Jaapan) abil. Bänd kvantifitseeriti lmageli abil.

Eksperimentaalne

Kõik uuringuprotokollid kiitis heaks Hyogo ülikooli inimteaduste ja keskkonna kooli eetikakomitee. 12-nädalased isased Sprague-Dawley rotid osteti firmalt Japan SLC (Shizuoka, Jaapan). Rotte hoiti 12-heledal, 12-h pimedal tsüklil (09:00-21:00) ning neile võimaldati vaba juurdepääs toidule ja eriti puhtale veele.

Eksperimentaalsed dieedid hõlmavad kontroll-P-dieeti (1.0% P, 0.6Ca, 20% valku), adeniini dieeti (0,75% adeniini). , 1.0% P, 0,6%Ca, 2,5% valku), madala P-sisaldusega (LP) dieet (0,2% P,0 0,6% Ca, 10% valku) ja kõrge P (HP) dieet (1,0% P, 0,6% Ca, 10% valku), mis põhineb AIN93-G dieedil (idamaine Pärm, Tokyo, Jaapan), mille valguallikaks on kaseiin.3637) On teatatud, et madala valgusisaldusega dieet soodustab adeniinist põhjustatud neerupuudulikkusega rottidel veresoonte lupjumist, mistõttu viidi läbi valkude piiramine.3738)Enne rühmitamist uurisid kõik rotid (n)=23) toideti nädala jooksul tavalist MF-toitu (idamaine pärm), et kohaneda. 13 nädala vanuselt jagati rotid kahte rühma: kontrollrühm (n=5) ja adeniiniga indutseeritud kroonilise neeruhaiguse rühm (n=18). Kontrollrühm sai 6 nädala jooksul P-kontrolldieeti. . Adeniinist indutseeritud kroonilise neeruhaiguse rühm sai adeniini dieeti umbes 3 nädalat ja jagati seejärel 2 alarühma: CKD-LP rühm (n=8) või CKDHP rühm (n=10). CKD-LP rühma ja CKD-HP rühma rotid said katseperioodil vastavalt LP-dieeti ja HP ​​dieeti 3 nädala jooksul, toidu tarbimine registreeriti iga päev. Adeniini dieedi ajal koguti vereproovid sabaveenist ajavahemikus 10:00 hommikul kuni 11:00:00 kord nädalas kuni teise nädalani ja seejärel üks kord iga 2 päeva järel plasmataseme jälgimiseks. LP-dieedi või HP-dieedi ajal võeti vereproove kord nädalas. Uriiniproovid koguti ja uriini maht registreeriti kord nädalas. Rotid surmati anesteetikumiga, kasutades isofluraani (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Jaapan) ja laparotoomiat. Analüüsiks koguti vereproovid, mis võeti alumisest õõnesveenist ja torakoabdominaalsest aordist.

SLC37A2 ekspressioon aordil.

Ligikaudu kolmandikku kogutud torakoabdominaalsest aordist kasutati kaltsifikatsiooni visualiseerimiseks ja immunovärvimise läbiviimiseks. Aort sisestati parafiini ja lõigati 4-um osad. Sektsioonid värviti Von Kossa meetodiga kaltsiumikomplekti jaoks (Polysciences. Warrington, PA) vastavalt tootja juhistele. immunovärvimise analüüs viidi läbi jadalõikudega. Sektsioone inkubeeriti SLC37A2 antikehaga üleöö 4 kraadi juures ja seejärel töödeldi toatemperatuuril 30 minutit Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Jaapan). Seejärel töödeldi sektsioone DAB-substraadi komplektiga (Nichirei).

Kogu RNA ekstraheeriti ülejäänud külmutatud torakoabdominaalsest aordist. Reaalajas PCR viidi läbi, kasutades sünteesitud cDNA-d. Praimeri järjestused olid järgmised: roti osteopontiin, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' ja 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' ja; roti SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' ja 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Osteopontiini mRNA ja SLC37A2 mRNA ekspressioonitasemed arvutati pärast normaliseerimist GAPDH-ga

Statistiline analüüs.

Andmed on esitatud kui keskmine + SE. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti t-testi abil. Fosfaadiga indutseeritud lupjunud AoSMC katsetes analüüsiti erinevusi ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes Dunnetti meetod. CKD mudeli katsetes analüüsiti erinevusi K ruskal-Wallise testiga, millele järgnes Steel-Dwassi meetod. Korrelatsioonikoefitsiendid (rs) määrati Spearmani korrelatsioonikordaja järjestustesti abil. Kõigi testide jaoks. kahepoolsed p väärtused<0.05 were considered statistically significant.