Salmonella Enterica serovarid TtrA ja PduA geenide puudumisel suurendavad rakkude immuunvastust tibude infektsioonide ajal

Salmonella spp. on üks peamisi toidu kaudu levivaid patogeene, mis põhjustab kodulinnutööstusele majanduslikku kahju ja toob kaasa tagajärgi ka rahvatervisele. Kodulindude nakatumise ajal mängivad võtmerolli nii patogeenide ellujäämisvõime soolekeskkonnas põletiku ajal kui ka nende seos peremeesorganismi immuunsüsteemiga. Selle uuringu eesmärk oli kvantifitseerida makrofaagide ja CD{0}} /CD8+ rakkude populatsioonide olemasolu immunohistokeemia tehnikat kasutades kanade kaubanduslikes liinides, kes on katseliselt nakatunud Salmonella metsiktüüpi ja mutantsete tüvedega. Enteritidis ja Salmonella Typhimurium, millel puuduvad ttrA ja pduA geenid. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA vallandas suurema protsendi määrdunud alast kui metsiktüüp, välja arvatud heledad munakanad. Salmonella Typhimurium metsiktüüpi tüvi ja Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA infektsioonid viivad sarnase mustrini, kus 1 ja 14 dpi juures näitasid lindude umbsoole mandlid ja niudesool ekspressiivsemat värvipinda võrreldes 3 ja 7 dpi-ga. Kõigis uuritud liinides täheldati makrofaagide silmatorkavat infiltratsiooni võrreldes CD4+ ja CD8+ rakkudega. Üldiselt näitasid mutantse tüvega nakatunud loomad positiivselt värvunud ala, mis oli metsiktüübist kõrgem. Nii ttrA kui ka pduA geenide deletsioonid põhjustasid makrofaagide ning CD4+ ja CD8+ rakkude intensiivsema infiltratsiooni peremeeslindudes, mis viitab patogeeni nõrgenemise puudumisele isegi Salmonella erinevates tüvedes.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Salmonella enterica on toidu kaudu leviv patogeen, mis põhjustab kaotusi kariloomadele ja mõjutab otseselt inimeste tervist. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) ja Typhimurium (Salmonella Typhimurium) on aastakümneid olnud peamiselt seotud toiduinfektsioonidega. Aastatel 1995–2010 tuvastati Salmonella Enteritidis 34,2% kõigist Salmonella spp1 suhtes positiivsetest proovidest. Lisaks avaldasid Winter et al.2 põhjaliku uuringu, milles uuriti tetrationaati kodeeriva geeni rolli, valides serotüübi Salmonella Typhimurium, kuid kasutades katsemudelina hiiri. Seda arvesse võttes võib meie teadmiste süvendamine peremees-patogeeni interaktsioonist aidata parandada kontrolli ja likvideerimise mõõtmisi. Salmonelloosi patogeneesis on seotud mitmed tegurid, näiteks patogeeni võime paljuneda põletikulises limaskestas, sõltuvalt toitainete omandamisest ja anaeroobsest hingamisest2. Toitainete kättesaadavus ei taga aga bakterite ellujäämist konkurentsikeskkonnas, kus on tihedalt asustatud teisi mikroorganisme. Seega annab Salmonella enterica võime metaboliseerida tetrationaati, kasutades tetrationaatreduktaasi, et toota energiaallikana 1,2-propaandiooli. Selle ensüümi moodustavad TtrA, TtrB ja TtrC. Esimene tsiteeritud alaühik kuulub molübdopteriini (MPT) superperekonda ja sellel on FeS-i siduv domeen, mis on seotud tetrationaadi redutseerimisega tiosulfaadiks (S2O3 2−)2–4. Te 1,2-propaandiooli kasutavad bakteriaalsed mikrokambrid (MCP). See struktuur koosneb seitsmest erinevast valgust, mille hulgas on PduA MCP struktuuri põhikomponent5. Esiteks muundatakse 1,2-propaandiool propioonaldehüüdiks, mis omakorda muudetakse propaandiooldehüdrataasi toimel propanooliks ja propionaadiks. See protsess tekitab fosforüülimise teel ATP, elektronide (1-propanooli) gradiendi NAD regenereerimisele ja vaheühendit (propionüül-CoA), mida saab kasutada süsiniku- ja energiaallikana kogu metüültsitraadi kaudu, kuna see sõltub sünteesitavast vitamiinist B12. endogeensel viisil6. Kanainfektsioonide ajal järgneb Salmonella enterica serovaride võimele tungida sooleepiteelirakkudesse ja makrofaagidesse ning ellu jääda immuunvastuse kõrvalehoidmine7. Selles kontekstis on infektsioon kriitiline faas, mis sõltub bakteri- ja peremeesrakkude vahelisest interaktsioonist ning bakterite võimest ületada sooleepiteeli barjäärid, et tagada selle koloniseerimine ja replikatsioon. Sellegipoolest aktiveerib see põletikulisi ja immuunvastuseid8, mis põhjustavad vastavalt endotsütoosi ja fagotsütoosi epiteeli- ja antigeeni esitlevate rakkude (APC) poolt. Nende rakkude antimikroobne toime kutsub esile kaasasündinud vastuse makrofaagide kaudu ja adaptiivne immuunvastuse koost sõltub CD4+ ja CD8+ aktivatsioonist9. Kanade Salmonella põhjustatud sooleinfektsiooni põhjustavate peremees-patogeeni interaktsioonide valgustamiseks hindame immuunsüsteemi rakkude populatsiooni soolestiku kolonisatsiooni ja süsteemse infektsiooni ajal kaubandusliku päritoluga lindudel, keda nakatavad Salmonella Enteritidis ja Salmonella Typhimurium metsiktüüpi mutantsed tüved. , mis kannab deletsioone tetrationaadi (ttrA) ja 1,2-propaandiooli (PDU) metaboliseerimisega seotud geenides.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Tulemused

Katse 1 – Salmonella Enteritidisega nakatumine.

Immuunvastuse rakkude kvantifitseerimise tulemused broilerite, kergete munakanade ja poolraskete munakanade pimesoole mandlites, pimesooles, niudesooles ja maksas on toodud tabelites 1, 2 ja 3. Leidsime rohkem CD-d. 4+ ja makrofaagirakkude infiltratsioon Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA-ga (SEΔttrAΔpduA) nakatunud broileritelt kui Salmonella Enteritidis metsiktüüpi tüvega (wt-SE) nakatunud broileritelt või nakatumata lindudelt kõigis hinnatud kudedes. Erandiks leiti CD4+ rakkude infiltratsioon 3 dpi juures pimesoole mandlites, niudesooles ja maksas ning makrofaagide infiltratsioon 3 ja 14 dpi maksas SEΔttrAΔpduA-ga nakatunud broileritelt. Lisaks täheldati SEΔttrAΔpduA-ga nakatunud lindudel suuremas koguses infiltreerunud CD8+ rakkude arvu 1 ja 7 dpi umbsooles ja maksas, 3 dpi umbsoole mandlites ja 14 dpi niudesooles. Seevastu wt-SE-ga nakatunud lindudel oli CD8+ rakkude infiltratsioon kõrge niudesooles ja umbsoole mandlites vastavalt 1 ja 7 dpi juures (tabel 1; täiendav joonis S1). Tabel 2 ja täiendav joonis S2 näitavad poolraskete munakanade kudedes leitud CD4+ ja CD8+ ning makrofaagide infiltratsiooni. Üldiselt oli rakuinfiltraatide piirkondade vahel suur erinevus nii nakatunud tüve kui ka uuritud kudede osas. SEΔttrAΔpduA-ga nakatunud lindudel olid suuremad alad kaetud CD4+ rakkudega (niudesooles 1 ja 14 dpi juures ning maksas 7 dpi juures) ja makrofaagidega (niudesooles 7 dpi juures ning maksas 3, 7 ja 14 dpi juures dpi), kui wt-SE-ga nakatunud lindude samas koes. Teisest küljest leiti CD8+ rakke suuremates kogustes wt-SE tüvega nakatunud lindude pimesoole mandlitest (1 ja 7 dpi juures) ja pimesoolest (3 dpi juures). Erinevalt broileritel ja poolrasketel munakanadel vallandas Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA kergete munakanade nakatamisel vähem intensiivse immuunvastuse rakupiirkonnad kui metsiktüüp. Wt-SE-ga nakatunud lindudel ilmnesid suuremad CD4+ infiltratsioonipiirkonnad pimesoole mandlites (1 ja 3 dpi juures), pimesooles (3, 7 ja 14 dpi juures), niudesooles (1 ja 7 dpi juures) ja maksas 14 dpi). Sarnaselt on väljakutsed SEΔttrAΔpduA-ga vähendanud nii CD8+ infiltratsioonipiirkondi umbsoole mandlites (1 dpi juures) kui ka niudesooles (7 ja 14 dpi juures) ning makrofaagid umbsoole mandlites ja umbsooles (3 dpi juures), võrreldes wt-SE-ga nakatunud lindudega. Nii SEΔttrAΔpduA kui ka wt-SE-ga nakatunud lindude maksas ei täheldatud olulisi muutusi CD8+ ja makrofaagirakkude immuunsüsteemi rakkude piirkonnas. Kergete munakanade väljakutse üksikasjalikud tulemused on näidatud tabelis 3 (vt täiendav joonis S3).

Tabel 1. Erinevate immuunvastuse rakkude kvantitatiivse jaotusega seotud oluliste erinevuste esitus Salmonella Enteritidis metsikute ja mutantsete tüvedega nakatunud broilerite elundites erinevatel päevadel pärast nakatumist. DPI, päevad pärast nakatumist; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis metsiktüüp; ns, olulist erinevust pole. Igas elundis ja DPI-s tähendab * erinevust kahesuunalise ANOVA abil, millele järgneb Bonferroni võrdlustest metsikute ja mutantsete tüvede väärtuste vahel (*P väiksem kui 0 või sellega võrdne.05; **P väiksem kui või võrdne 0.01; ***P Väiksem või võrdne 0,001; ****P Väiksem või võrdne 0,0001). Tabelis esitatud tüvi (∆-SE või wt-SE) on elundi sees oluline ja DPI on see, mis näitab iga raku peamist inflatsioonipiirkonda.

Tabel 2. Erinevate immuunvastuse rakkude kvantitatiivse jaotusega seotud oluliste erinevuste esitus Salmonella Enteritidis metsikute ja mutantsete tüvedega nakatunud poolraskete munakanade elundites erinevatel päevadel pärast nakatumist. DPI, päevad pärast nakatumist; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis metsiktüüp; ns, olulist erinevust pole. Igas elundis ja DPI-s tähendab * erinevust kahesuunalise ANOVA abil, millele järgneb Bonferroni võrdlustest metsikute ja mutantsete tüvede väärtuste vahel (*P Väiksem kui 0 või sellega võrdne.{{10}}5 **P Väiksem või võrdne 0,01; ***P Väiksem või võrdne 0,001; ****P Väiksem või võrdne 0,0001). Tabelis esitatud tüvi (∆-SE või wt-SE) on elundi sees oluline ja DPI on see, mis näitab iga raku peamist inflatsioonipiirkonda.

Tabel 3. Olulise erinevuse esitus, mis on seotud erinevate immuunvastuse rakkude kvantitatiivse jaotusega Salmonella Enteritidis metsikute ja mutantsete tüvedega nakatunud munakanade elundites erinevatel päevadel pärast nakatumist. DPI, päevad pärast nakatumist; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis metsiktüüp; ns, olulist erinevust pole. Igas elundis ja DPI-s tähendab * kahesuunalise ANOVA erinevust, millele järgneb Bonferroni võrdlustest metsikute ja mutantsete tüvede väärtuste vahel (*P väiksem kui 0 või sellega võrdne.{{10}}5 **P Väiksem või võrdne 0,01; ***P Väiksem või võrdne 0,001; ****P Väiksem või võrdne 0,0001). Tabelis esitatud tüvi (∆-SE või wt-SE) elundis ja DPI-s on see, mis näitab iga raku peamist infiltratsioonipiirkonda.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Katse 2 – Salmonella Typhimurium nakatamine.

Immuunvastuse rakkude kvantifitseerimise tulemused broilerite, poolraskete munakanade ja kergete munakanade umbsoole mandlites, pimesooles, niudesooles ja maksas on näidatud vastavalt tabelites 4, 5 ja 6. Üldiselt näitasid mutantse tüvega nakatunud broilerid kõigil neljal proovivõtupäeval positiivselt märgistatud ala, mis oli kõrgem kui Salmonella Typhimurium metsiktüüpi tüvega (wt-STM) nakatatud broileritel. Lisaks ei täheldatud nakatamata kontrollrühmades immuunvastuse rakkude muutusi. CD4+ rakkude pindalad kõigis broilerite kudedes saavutasid statistilise erinevuse 1 dpi juures, kusjuures Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA) infiltratsioonid olid suuremad. Märkimisväärne erinevus STM∆ttrA∆pduA- ja wt-STM-ga nakatunud lindude kvantifitseeritud immuunvastuse pindala vahel oli suuremad infiltratsioonid, kui nakatumine toimus mutantset tüve pimesooles ja niudesooles 1 dpi juures ja maksas. 14 dpi juures (CD8+ rakud); pimesooles, niudesooles ja maksas 1 ja 14 dpi juures (makrofaagid) (tabel 4; täiendav joonis S4). Poolraskete munalindude tulemused ei näidanud statistilist erinevust mutantsete ja metsiktüüpi tüvede nakatumise vahel pimesoole CD4+ rakkude ja pimesoole mandlite ja niudesoole CD8+ rakkude vahel kõigi 4 päeva jooksul. pärast nakatumist hinnatud (tabel 5; täiendav joonis S5). Kui aga täheldati immuunsüsteemi rakkude märkimisväärset kontsentratsiooniala, said poolrasked munakanad nakatada STM∆ttrA∆pduA: peamiste makrofaagide infiltratsiooniala kõigis uuritud kudedes (1 ja 14 dpi juures); CD4+ rakkude peamine infiltratsioonipiirkond pimesoole mandlites ja maksas (1, 7 ja 14 dpi juures) (tabel 5; täiendav joonis S5). Tabel 6 ja täiendav joonis S6 näitavad kergete munakanade kudedes leitud CD4+, CD8+ ja makrofaagide infiltratsiooni. STM∆ttrA∆pduA-ga nakatatud lindudel oli immuunsüsteemi vastuse rakkudega võrreldes CD4+ ja makrofaagirakkude põhipind umbsoole mandlites ja pimesooles (14 dpi juures) ning niudesooles (1 ja 14 dpi juures). wt-STM-ga nakatunud lindude samade kudede pindala. Nakatunud lindude umbsoole mandlites, pimesooles ja niudesooles ei leitud CD8+ infiltratsioonipiirkonna statistilist erinevust. Erinevalt teistes kudedes saadud tulemustest oli STM∆ttrA∆pduA-ga nakatunud lindude maksas CD4+ ja CD8+ rakkude immuunvastuse rakkude värvunud ala kõigi nelja dpi juures, ja makrofaagid 1 ja 14 dpi juures.

Tabel 4. Erinevate immuunvastuse rakkude kvantitatiivse jaotusega seotud oluliste erinevuste esitus Salmonella Typhimurium looduslike ja mutantsete tüvedega nakatunud broilerite elundites erinevatel päevadel pärast nakatumist. DPI, päevad pärast nakatumist; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium metsiktüüp; ns, olulist erinevust pole. Igas elundis ja DPI-s tähendab * erinevust kahesuunalise ANOVA abil, millele järgneb Bonferroni võrdlustest metsikute ja mutantsete tüvede väärtuste vahel (*P väiksem kui 0 või sellega võrdne.05; **P väiksem kui või võrdne 0.01; ***P Väiksem või võrdne 0,001; ****P Väiksem või võrdne 0,0001). Tabelis esitatud tüvi (∆-STM või wt-STM) on elundis oluline ja DPI on see, mis näitab iga raku peamist inflatsioonipiirkonda.

Tabel 5. Erinevate immuunvastuse rakkude kvantitatiivse jaotusega seotud oluliste erinevuste esitus Salmonella Typhimurium looduslike ja mutantsete tüvedega nakatunud poolraskete munakanade elundites erinevatel päevadel pärast nakatumist. DPI, päevad pärast nakatumist; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium metsiktüüp; ns, olulist erinevust pole. Igas elundis ja DPI-s tähendab * erinevust kahesuunalise ANOVA abil, millele järgneb Bonferroni võrdlustest metsikute ja mutantsete tüvede väärtuste vahel (*P Väiksem kui 0 või sellega võrdne.{{10}}5 **P Väiksem või võrdne 0,01; ***P Väiksem või võrdne 0,001; ****P Väiksem või võrdne 0,0001). Tabelis esitatud tüvi (∆-STM või wt-STM) on elundis oluline ja DPI on see, mis näitab iga raku peamist inflatsioonipiirkonda.

Tabel 6. Olulise erinevuse esitus, mis on seotud erinevate immuunvastuse rakkude kvantitatiivse jaotusega Salmonella Typhimurium looduslike ja mutantsete tüvedega nakatunud munakanade elundites erinevatel päevadel pärast nakatumist. DPI, päevad pärast nakatumist; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium metsiktüüp; ns, olulist erinevust pole. Igas elundis ja DPI-s tähendab * kahesuunalise ANOVA erinevust, millele järgneb Bonferroni võrdlustest metsikute ja mutantsete tüvede väärtuste vahel (*P väiksem kui 0 või sellega võrdne.{{10}}5 **P Väiksem või võrdne 0,01; ***P Väiksem või võrdne 0,001; ****P Väiksem või võrdne 0,0001). Tabelis esitatud tüvi (∆-STM või wt-STM) on oluline elundis ja DPI-s, mis näitab iga raku peamist infiltratsioonipiirkonda.

Arutelu

Anaeroobsetes tingimustes kokku puutudes võivad bakterid kasutada energia- ja hingamisallikatena tetrationaadi ja 1,2-propaandiooli metaboolseid substraate10. Seega on Salmonella spp. on pikka aega uuritud selle kohta, kuidas nende radade eest vastutavate geenide deletsioon mõjutaks nende ellujäämist peremeesorganismis. Meie teadmiste kohaselt avaldati ainult üks uuring, mis uuris samaaegselt tetrationaati ja propaandiooli kodeerivaid geenide rolle. Meie uurimisrühm teatas nende deletsioonide mõjust, hinnates Salmonella Enteritidis'e ja Salmonella Typhimurium'i süsteemset infektsiooni ja väljaheitega eritumist tibude kaubanduslikes liinides11. Selle teema arutelu suurendamiseks tõid praegused tulemused esile immuunraku, mis on infiltreerunud tibude liinide erinevatesse kudedesse, mis olid nakatatud nii metsikut tüüpi kui ka mutantsete tüvedega, mis kannavad deletsioone ttrA ja pduA geenides. 2-nädalase katse jooksul järgisid CD4+ ja CD8+ rakkude ja makrofaagide positiivselt värvunud alad enamasti sarnast mustrit, kus 1 ja 14 dpi juures on suurem arv immuunvastust rakud. Seda saab seletada peremeesorganismi kaitsesüsteemi esmase kontaktiga patogeeni tungimisel. Eelmine aruanne on näidanud, et isegi siis, kui Salmonella ei eritu 12 dpi juures, võib nakatumine muutuda positiivseks isegi siis, kui Salmonella ei eritu 12 dpi juures,12, selgitades, miks immuunsüsteemi rakkude pindala sagedusega 3 ja 7 dpi oli madalam, kuid suurenes. . Esmapilgul võib eeldada, et nii pduA kui ka ttrA kustutamisel väheneb peremeesorganismi esilekutsutud vastus, kuna need geenid mängivad olulist rolli ellujäämises Salmonella nakatumise ajal 2, 4, 13–15. Kuid meie tulemused, milles võrreldi topeltmutanti, millel puudusid mõlemad geenid, näitasid vastupidist, Salmonella Enteritidis'e ja Salmonella Typhimurium'i mutantsed tüved käivitasid kõrgema immuunvastuse rakud kui metsikut tüüpi tüved.

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

Lühim värvitud ala võib põhjustada sooletraktis suure arvu kolooniaid, mis kinnitab varasemat uuringut, kus Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA ja Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA tüvesid saadi rohkem kui nende metsiktüüpi korrelatsiooniproovidest11. . Salmonella võib käituda rakuvälise või intratsellulaarse bakterina, olenevalt saadaolevast toitainete repertuaarist, ning toimub lülitumisel soolestiku koloniseerimise ja peremeesrakkudesse sisenemise vahel16. Kui bakterid neelavad ja tapavad makrofaagid, kanduvad mõned peptiidifragmendid antigeeni esitleva raku pinnale, mida kodeerib II klassi histocompatibility complex (MHC). See peptiid-MHC II seondumine stimuleerib T-CD4+ lümfotsüüte. Kui aga bakterid otsustavad tungida peremeesrakku, sisenedes makrofaagi tsütoplasmasse, stimuleerib peptiidühendus teist tüüpi MHC, I klassiga, T-CD8+ lümfotsüütide tootmist17. Huvitav on see, et CD4+ ja CD8+ rakkudel on kogu katse vältel sama makrofaagide muster, esindades isegi erinevaid immuunvastuseid. Kuna CD4+ ja CD8+ rakud esindavad peamiselt T-lümfotsüüte, mis on osa adaptiivsest immuunvastusest, on makrofaagid osa kaasasündinud immuunvastusest9. Lisaks täheldasime, et broileritel on ekspressiivsemad positiivsed märgistatud alad kui munakanadel, mida kinnitas eelmine uuring, kus mutantsete tüvedega nakatunud broilerid näitasid näiteks invasiivsemat soolestiku kolonisatsiooni ja süsteemset infektsiooni11. Meie leiud viitavad sellele, et immunohistokeemia lähenemisviis pakub huvitavat teavet immuunvastuse rakkude käitumise kohta mitmel erineva kaubandusliku päritoluga organil Salmonella enterica serovaridega nakatumise ajal. Veelgi enam, käesolev uuring tõendab, et mõlema geeni kustutamine, isegi erinevates Salmonella tüvedes, põhjustas bakterid, mis kutsusid peremeesorganismis esile kõrgema immuunvastuse raku, mis näitab, et patogeen ei ole nõrgenenud. Võib arvata, et võib-olla suutis Salmonella leida teise ellujäämismehhanismi, mis muutus veelgi patogeensemaks. Eelmises uuringus on näidatud, et ttr- ja pdu-operonite kasutamine kooskõlas cob- ja PRP-operonitega on vajalik anaeroobseks hingamiseks16, mis paneb meid uskuma, et see pole vajalik ainult rohkemate geenide kustutamiseks igast operonist18, vaid meil on ka kaaluda kogu selle komplekti kustutamist, et jõuda vähem patogeensete Salmonella enterica tüvedeni.

materjalid ja meetodid

Katsed, mis viidi läbi vastavalt asjakohastele juhistele ja määrustele, kiitis heaks São Paulo osariigi ülikooli loomade kasutamise eetikakomitee (CEUA/Unesp Process-006621/18; 10. mail 2018), viidi läbi linnupatoloogias. Patoloogia, teriogenoloogia ja ühe tervise osakonna labor Sao Paulo osariigi ülikooli põllumajandus- ja veterinaariateaduste koolist (FCAV/Unesp), Jaboticabal, Brasiilia.

Bakteritüved ja mutantide ehitus.

Siin kasutatud bakteritüvesid säilitati külmutussöötmes, mis oli segatud Lysogeny puljongiga (LB; BD DifcoTM, USA), millele oli lisatud 30% glütserooli (Merck, BR-H30402394 228), ja säilitati ultra-sügavkülmikus (- 80 kraadi) FCAV/UNESP linnupatoloogia laboris. Salmonella Enteritidis P125109 (juurdepääsunumber: AM933172) ja Salmonella Typhimurium str. 9819 indutseeriti resistentsuseni nalidiksiinhappe ja spektinomütsiini suhtes (Nalr Spcr ) ja need andsid geneetilise tausta mutantsete tüvede konstrueerimiseks lambda-punase tehnikaga20 koos väikeste modifikatsioonidega, mida on kirjeldanud Saraiva et al.11. Siin konstrueeritud mutantsed bakterid on tekstis identifitseeritud kui SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) ja STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

In vivo eksperiment.

Katse 1 – Salmonella Enteritidis. Kaubanduslikest haudejaamadest saadi kolmkümmend kuus 1-päevast tibu kolmest erinevast liinist (broilerid, poolrasked munakanad ja kerged munakanad), kokku sada kaheksa looma. Saabumisel uuriti transpordikaardi kastide põhja, et kinnitada lindude salmonellavaba staatust21, ja loomi hoiti aklimatiseeritud ruumis metallpuurides ning neile anti antibiootikumivaba sööta ja vett ad libitum. Esimesel päeval valiti 24-h valgusprogramm, et tagada optimaalne vee- ja toiduneelamine, seejärel võeti esimesel nädalal kasutusele 12-h valgusprogramm, mis vähenes ülejäänud päevadel 8 tunnini. Inokulaat valmistati Berchieri Junior et al.22 järgi. Selleks inokuleeriti külmutatud kultuurid LB-sse ja inkubeeriti üleöö 37 kraadi juures kiirusel 15{15}} pööret minutis. Järgmisel päeval viidi bakterikultuurid värskesse söötmesse ja inkubeeriti 18 tundi samades tingimustes nagu varem. Seejärel inokuleeriti 0,2 ml kultuuridest, mis sisaldasid 108 kolooniaid moodustavat ühikut ml kohta (CFU/mL), suukaudselt metallsondiga otse lindude saaki. Moodustati üheksa rühma (A kuni I) ja jagati juhuslikult erinevate liinide ja tüvede järgi (tabel 7). Ühel, kolmel, seitsmel ja 14-päeval pärast nakatumist (dpi) surmati iga päev hommikuks kolm lindu rühma kohta emakakaela dislokatsiooni teel, et koguda umbsoole mandlite mediaalne osa, umbsool, ja niudesool ning maksa vasaku sagara distaalne osa edasiseks immunohistokeemia (IHC) analüüsiks. Selleks sukeldati proovid n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brasiilia) sisse, mis oli eelnevalt jahutatud vedelas lämmastikus. Vahetult pärast kudede külmutamist viidi see 2 ml krüotorusse (Corning, USA) ja konditsioneeriti vedelas lämmastikus. Pärast proovide võtmist hoiti kudesid kuni IHC protsessini -80 kraadi juures.

Katse 2 – Salmonella Typhimurium. See katse viidi läbi, järgides samu omadusi, mida mainiti eespool katses 1. Kolmkümmend kuus tibu (1 päeva vanused) jagati juhuslikult üheksa rühma (A kuni I) nende põlvnemise ja tüvede alusel (tabel 7).

Tabel 7. Moodustatud rühmad erinevate põlvkondade ja tüvede järgi. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis metsiktüüp; wt-STM, Salmonella Typhimurium metsiktüüp; NC, negatiivne kontroll.

Immunohistokeemia.

Kudede sektsioon. Kogutud proovid viidi -80 kraadi juurest krüostaadile (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Saksamaa) temperatuuril -22 kraadi, kus need blokeeriti individuaalselt ÜMT ühendiga (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Holland) 30 minuti jooksul enne. kuni 6 µm, kasutades madala profiiliga ühekordseid lõiketerasid (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Saksamaa). Tähelepanuväärne on, et lõigud tehti temperatuuril -22 kraadi, välja arvatud maksa lõigud, mis tehti temperatuuril -15 kraadi. Valmistati slaidid, mis sisaldasid iga märgistatud immuunraku vastuse kohta kolme iga organi läbilõike kordust, iga korduse vahel harvendades. Pintsli abil asetati koelõigu lõiked histoloogilistele objektiklaasidele, mida oli eelnevalt töödeldud polü-l-lüsiiniga (Sigma-Aldrich, Ühendkuningriik, kat. nr P4832) ja silaaniga (Sigma-Aldrich, USA, kat. nr 440574). Seejärel hoiti slaide kuni IHC värvimiseni temperatuuril –20 kraadi. Immuunrakkude värvimine. Esiteks sukeldati slaidid 200 ml jahutatud atsetooni (Acetone PA-ACS, Synth, Brasiilia) ja inkubeeriti -20 kraadi juures 10 minutit. Pärast seda viidi slaidid proovide kuivatamiseks 5 minutiks toatemperatuuril niiskuskambrisse (EasyPath®, Brasiilia). Seejärel pesti slaide PBS-iga ja koe dehüdratsiooni vältimiseks jäeti loik 5 minutiks seisma. Kümme, kuded sukeldati pimedas kohas 200 ml 4% H2O2 10 minuti jooksul ja pesti uuesti PBS-ga. Koelõikude ümbrus kuivatati absorbeeriva paberiga ja proovist juhiti mööda hüdrofoobse pliiatsi abil (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Taani). Lombist lahkumist korrati nagu varem. Immuunrakkude värvimiseks kasutati biotiinivaba komplekti Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection – Micropolymer (Abcam ©, USA), valides Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC) meetodi. Selleks eemaldati loik ja kudedesse lisati mittespetsiifilised taustavärvi blokeeriva reagendi tilgad. Objektiklaase hoiti niiskuskambris pimedas kohas 30 minutit, pesemisetappi korrati ja lisati 200 µL primaarset antikeha (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA), mis oli lahjendatud vahekorras 1:200 (v/v) antikeha lahjendusreagendiga (Antibody diluent, Abcam©, USA). Slaide inkubeeriti 4 kraadi juures 18 tundi. Järgmisel päeval pesti slaide nagu varem. Pärast liigse PBS-i eemaldamist lisati 10 sekundaarse antikeha tilgad (Reveal Complement, Abcam ©, USA) ja niiskuskamber pandi 30 minutiks pimedasse keskkonda. Seejärel lahjendati tilk 3,3'-diaminobensidiini (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) 1 ml substraadis (DAB Substrate, Abcam©, USA), millest piisab kolme slaidi jaoks, ja lisati kudede lõigud. Üks minut hiljem sukeldati slaidid 5 minutiks 200 ml dH2O-sse. Pärast seda viidi need plastkuubikusse, mis sisaldas Harrise hematoksüliini (Êxodo Científca, Brasiilia) ja jäeti 1 minutiks seisma. Tagantjärele pesti slaide 10 minutit madala rõhu all jooksva vee all. Slaidid esitati alkoholi-ksüleeni seeriale (70% alkohol, 90% alkohol, 100% alkohol, ksüleen I ja ksüleen II). Lõpuks asetati katteklaasid slaididele pärast tilga veevaba paigaldusvahendi (Entellan®, Merck, Brasiilia) lisamist. Kujutised koelõikudest tehti juhuslikult, valides viis juhuslikku vaatevälja, kasutades edasiseks statistiliseks analüüsiks optilist mikroskoopi (objektiiv 400×) (Coleman®, mudel N-120) digitaalkaamera adapteriga (joonis 1). ).

Andmete analüüs.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

CD{{0}} ja CD8+ rakkude ja makrofaagide protsent arvutati Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA) abil. Need kvantifitseeriti protsendiväärtustena immuunrakkude markeri positiivse pindala / kogupindala järgi. Statistiline analüüs ja graafika tehti macOS-i jaoks mõeldud tarkvara GraphPad Prism v.8.{11}}.1 abil (GraphPad Software, La Jolla California, USA) ning andmed esitati dispersioonanalüüsile (ANOVA), millele järgnes Bonferroni mitmekordne võrdlus, arvestades, et olulisuse tase on väiksem kui 5% (P väiksem või võrdne 0,05).

Joonis 1. Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA-ga nakatunud broileri pimesoole osa, mis näitab makrofaagide immuunreaktsioone, 7 päeva pärast nakatumist (×400; avidiini-biotiini streptavidiini peroksidaas, värvitud hematoksüliiniga).

Viited

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Inimese mittetüüfuse salmonelloosi allikad: ülevaade. Braz. J. Poult. Sci. 12(1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. Soolepõletik annab Salmonella jaoks hingamisteede elektronide aktseptori. Loodus 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Salmonella enterica poolt väävliühendite redutseerimisega seotud hingamisteede spetsiifilisus. Mikrobioloogia (Reading) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. Soolepõletik võimaldab Salmonellal kasutada mikrobiotaga konkureerimiseks etanoolamiini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Fukoosi ja 1,2-propaandiooli kasutamise reguleerimine Salmonella enterica serovari Typhimurium poolt. Esiosa. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Propionaadi katabolism Salmonella Typhimurium LT2-s: kaks erinevalt transkribeeritud ühikut hõlmavad prp lookust 8,5 sentiisoomi juures, prpR kodeerib sigma-54 aktivaatorite perekonna liiget ja prpBCDE geenide perekonda. moodustavad operoni. J. Bacteriol. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.{23}}.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR. 3 kultiveerimismeetodi ja PCR-analüüsi võrdlus Salmonella Gallinarum'i ja Salmonella Pullorumi tuvastamiseks linnusöödas. Poult. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.{7}} (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Immuunrakkude infiltratsiooni dünaamika kanade pimesoole lamina proprias pärast vastsündinute nakatumist Salmonella Enteritidis'e tüvega. Dev. Comp. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do system immune. Doenças das Aves (toim. AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Alternatiivne elektronaktseptortetrationaat toetab Salmonella enterica serovari Typhimurium B12-sõltuvat anaeroobset kasvu etanoolamiinil või 1,{{4} }propaandiool. J. Bacteriol. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.{12}}.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Salmonella enterica serovaride ttrA ja pduA geenide rolli dešifreerimine kana nakkuse mudelis. Lindude pathol. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL. Ristreaktiivsed rakulised ja humoraalsed immuunvastused Salmonella enterica serovaridele Typhimurium ja Enteritidis on seotud kaitsega heteroloogse korduva väljastamise vastu. Vet. Immunol. Immunopatool. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ Hingemattev saavutus: soolestiku mikrobiotaga konkureerimiseks sunnib Salmonella oma peremeesorganismi pakkuma hingamisteede elektronide aktseptorit. Soolestiku mikroobid 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. Salmonella kasutab soolepõletikust kasu saamiseks energiataksosid. PLoS patog. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Salmonella ja mikrobiota vahelised dünaamilised koostoimed seedetrakti keerulises nišis. Int. Sch. Res. Mitte. 2014, 1.–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzyme IIANtr reguleerib Salmonella invasiooni 1,2-propaandiooli ja propionaadi katabolismi kaudu. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Peremeesorganismi kaitsemehhanismid bakteriaalsete patogeenide vastu: kudede ja vere kaitsed. In Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (toim. Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelbergi külgastme geeni hingamisteede vajaduste kaotus kana infektsiooni mudelis. Mikroobide patoog. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Salmonella Typhimurium tüve F98 roojaga eritumise vähendamine kanadel, kes on vaktsineeritud eluga ja surmatud S. Typhimurium organismidega. Epidemiol. Nakata. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Escherichia coli K-12 kromosomaalsete geenide üheastmeline inaktiveerimine, kasutades PCR tooteid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. uurimine ühepäevaste lindude transpordikastis. Braz. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Vaatlused Salmonella enterica serovaride Pullorum ja Gallinarum püsivuse ja vertikaalse ülekandumise kohta kanadel: bakteriaalse ja peremehe geneetilise tausta mõju. Lindude pathol. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).