Fluorestseeruvate valguantikehade uurimistöö ja rakendused: nanokehadele keskenduv ülevaade

Abstraktne: Alates fluorestseeruvate valkude (FP-de) avastamisest on nende rikkalikud fluorestsentsspektrid ja fotokeemilised omadused soodustanud laialdasi bioloogiliste uuringute rakendusi. FP-sid saab klassifitseerida roheliseks fluorestsentsvalguks (GFP) ja selle derivaatideks, punaseks fluorestsentsvalguks (RFP) ja selle derivaatideks ning lähiinfrapuna FP-deks. FP-de pideva arendamisega on tekkinud FP-dele suunatud antikehad. Antikeha, immunoglobuliinide klass, on humoraalse immuunsuse peamine komponent, mis tunneb selgesõnaliselt ära ja seob antigeene. Ühest B-rakust pärinevat monoklonaalset antikeha on laialdaselt kasutatud immuunanalüüsis, in vitro diagnostikas ja ravimite väljatöötamisel. Nanokeha on uut tüüpi antikeha, mis koosneb täielikult raske ahela antikeha varieeruvast domeenist. Võrreldes tavaliste antikehadega saab neid väikeseid ja stabiilseid nanokehi elusrakkudes ekspresseerida ja funktsioneerida. Lisaks pääsevad nad hõlpsalt juurde sihtmärgi pinnal olevatele soontele, õmblustele või peidetud antigeensetele epitoopidele. See ülevaade annab ülevaate erinevatest FP-dest, nende antikehade, eriti nanokehade uurimistöö edusammudest ja FP-dele suunatud nanokehade täiustatud rakendustest. See ülevaade on abiks FP-dele suunatud nanokehade edasisel uurimisel, muutes raamprogrammid bioloogilistes uuringutes väärtuslikumaks.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Märksõnad: fluorestseeruv valk; monoklonaalne antikeha; nanokeha; teadusuuringute edenemine; rakendus

1. Sissejuhatus

Fluorestseeruv valk (FP) on biomeditsiini teadusuuringutes kõige sagedamini kasutatav valk. Pärast FP suurenenud kasutamist on välja töötatud ka FP antikehad. Võrreldes traditsioonilise antikehaga (joonis 1A), puuduvad kaamellaste (joonis 1B) raske ahela antikehadel (HCAb) ja haide immunoglobuliini uue antigeeni retseptoritel (IgNAR) (joonis 1C) loomulikult kerged ahelad. Ühedomeeniline antikeha (sdAb) on antikeha, mis koosneb täielikult HCAb või IgNAR varieeruvatest domeenidest. Selle molekulmass on 12–15 kDa, mis on umbes 1/10 monoklonaalse antikeha suurusest; seetõttu nimetatakse seda ka nanokehaks. Teadlased on erinevates valdkondades rakendanud nanokeha, millel on väiksem suurus, kõrge stabiilsus happe ja kuumuse suhtes, tugev läbitungimisvõime, geenitehnoloogia ja ekspressiooni lihtsus ning kõrge afiinsus. See pääseb hõlpsasti juurde sihtmärgi pinnal olevatele soontele, õmblustele või peidetud antigeensetele epitoopidele, tuvastades palju antigeene, mida tavalised antikehad ei suuda ära tunda [1]. Seetõttu on nanokehi kasutatud biomolekulidena organismides ja rakukultuurisüsteemides arengubioloogias, kristalseid šaperoneid stabiilse bioloogia konformatsioonilise seisundi jaoks, ensüümi aktiivsuse regulaatorite või inhibiitoritena, immunohistokeemiliste reagentidena biokeemilises analüüsis ning sekundaarsete antikehadena immunoblotanalüüsis ja immunofluorestsentsis [2]. –6]. Spetsiifiliselt FP-ga seonduvaid nanokehi kasutatakse laialdaselt subtsellulaarses lokaliseerimises, rakusisese signaaliraja uuringutes, elusrakkude pildistamisel ja sihitud nanomaterjalides [7–9]. Eelkõige on nanokehadel ainulaadsed eelised tavapäraste IgG antikehade ees ülikõrge eraldusvõimega pildistamisel.

Joonis 1. IgG (A), kaameli HCAb (B) ja hai IgNAR (C) struktuuriskeemid. VH, raske ahela varieeruv piirkond; VL, kerge ahela muutuv piirkond; CH/C, raske ahela konstantne piirkond; CL, kerge ahela konstantne piirkond; VHH, HCAb muutuv domeen; VNAR, IgNARi muutuv domeen.

2. Fluorestseeruvate valkude ülevaade

2.1. Fluorestseeruvate valkude avastamine

Luminestsents on mereselgrootute seas tavaline nähtus. Koelenteraadid, sealhulgas meduusid, hüdra ja korallid, kiirgavad ultraviolettkiirguse (UV) või sinise valguse käes rohelist fluorestsentsi, samas kui ctenofoorid kiirgavad sinist fluorestsentsi. Roheline fluorestsentsvalk (GFP) tuvastati esmakordselt Aequorea victorias Shimomura et al. aastal 1962 [10] ning seejärel klooniti ja ekspresseeriti 1985. aastal [11]. Metsiktüüpi GFP (wtGFP) ainulaadsed omadused ja stabiilne struktuur on seetõttu meelitanud paljusid teadlasi seda uurima. Sellest ajast alates on Tisen ja tema kolleegid olemasolevatele teadmistele ja selle kristallstruktuurile tuginedes genereerinud mutatsiooni teel erinevaid GFP valke, millel on erinevad fluorestseeruvad omadused ja töötanud välja GFP luminestsentsmehhanismi [12]. GFP-ga seotud uuringute osas võitsid kolm teadlast (Shimomura, Chalfie ja Tsien) 2008. aasta Nobeli keemiaauhinna GFP avastamise ja nende silmapaistva panuse eest selle rakendamisel.

Esivanemate punane fluorestsentsvalk (RFP), nimelt DsRed, klooniti 1999. aastal mittebioluminestseeruvatest riffikorallidest [13]. RFP-d saab kasutada koos GFP-ga teaduslike probleemide lahendamiseks, mida GFP üksi ei suuda lahendada. Kõige tähtsam on see, et tänu madalale RFP taustale intratsellulaarses pildistamises sobib see paremini kasutamiseks bioteaduslikes uuringutes [14,15]. Paljude teadlaste jõupingutustega on teatatud, et FP-de fluorestsentsspektrid katavad kogu nähtava piirkonna ja isegi infrapunase piirkonna, pakkudes hulgaliselt tööriistu valkude visualiseerimiseks ja kvantifitseerimiseks elusrakkudes [16]. Joonis 2 võtab kokku FP-de arengu.

Joonis 2. Fluorestseeruvate valkude areng. GFP, roheline fluorestseeruv valk; BFP, sinine fluorestseeruv valk; EGFP, täiustatud roheline fluorestseeruv valk; YFP, kollane fluorestseeruv valk; RFP, punane fluorestseeruv valk; VHH, raske ahela varieeruv domeen; VNAR, muutuv uus antigeeni retseptor. Kahvaturoheline marker näitab GFP rakendamise uuringute edenemist ja kollane roheline marker näitab GFP antikehade uurimise edenemist.

2.2. GFP struktuur ja funktsionaalsed omadused

GFP on looduslikult esinev, kerakujuline ja lahustuv happeline FP. GFP põhistruktuur koosneb monomeerist, mis koosneb 238 aminohappejäägist molekulmassiga 27–30 kDa. Selle kristallstruktuuril on keskpunkt, mille moodustavad 11 paralleelset ahelat, mis moodustavad silindrilise, tihedalt pakitud tünnistruktuuri. Silindri keskosa on kaitstud valgust kiirgava 4-(p-hüdroksübensülideen)-5-imidasolinooni rühmaga, mis on ühendatud selle spiraaliga, kusjuures mõlemad otsad on suletud lühikeste heeliksi segmentidega [17,18]. Kromofoori küpsemine ei vaja muud kofaktorit peale O2 [19]. GFP neelab sinist valgust või UV-valgust ja kiirgab rohelist fluorestsentsi, mille peamine ergastuspiik on 395 nm, madalaim ergastuspiik on 475 nm ja emissioonipiik on 509 nm. GFP on äärmiselt stabiilne ja talub kergesti töötlemist kõrgel temperatuuril. Formaldehüüdi fikseerimine või parafiini manustamine ei mõjuta selle fluorestsentsomadusi. FP-de struktuuri ja küpsemisprotsessi põhjaliku uurimise kaudu kujundavad üha rohkem teadlasi FP-de struktuuri ümber, et pakkuda neile uusi funktsioone ja omadusi, edendades veelgi nende arendamist ja rakendamist.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

2.3. GFP derivaadid

GFP rakenduste piiravad tegurid on pH, kloriidioonide tundlikkus ja halb fotostabiilsus. GFP sihipärased modifikatsioonid parandavad need vead, suurendades selle kvantsaagist, heledust, molaarset ekstinktsioonikoefitsienti ja fotostabiilsust. Lisaks on loodud mitu GFP derivaati, et laiendada eralduvate värvide valikut, sealhulgas sinine, ultramariin, tsüaan ja kollane.

Vastuseks wtGFP madalale fluorestsentsi intensiivsusele sinise valguse ergutamisel ja selle ebastabiilsele ekspressioonile imetajarakkudes, Zhang et al. konstrueeris GFP (F64L ja S65T) aminohappe asendus, nimelt täiustatud GFP (EGFP), mille fluorestsentsi intensiivsust suurendatakse 35- korda [20]. EGFP on endiselt kõige sagedamini kasutatav FP mutant rohelise valguse piirkonnas, arvestades selle head fotostabiilsust ja suurt heledust. Lisaks on optimeeritud GFP voltimisomadusi, saades supervoltimisvõimega superkausta GFP (sfGFP). SfGFP-l on kuus uut mutatsiooni, sealhulgas S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V ja A206V. sfGFP võib tõhusalt voltida isegi siis, kui seda ekspresseeritakse liitmisel lahustumatute valkudega, tagades selle fluorestsentsi heleduse [21]. GFPuv, teine ​​GFP modifitseeritud vorm, on optimeeritud fluorestsentsi jaoks UV-valguses. See genereerib eredamat rohelist fluorestsentsi UV-valguse juuresolekul, mille ergastuspiik on 395 nm ja emissioonipiik 509 nm juures, ning seda saab kasutada erinevate rakusiseste valkude asukoha määramiseks [22, 23]. GFPuv-s esineb kolm aminohappe asendust, sealhulgas F99S, M153T ja V163A. Need mutatsioonid kutsuvad esile GFPuv 18-korda tugevama ekspressiooni kui wtGFP E. coli's. GFPuv geen on sünteetiline geen, kus viis madala sagedusega Arg koodonit asendatakse E. coli jaoks sobivate koodonitega, et tagada GFPuv efektiivne ekspressioon.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Y66H saidile suunatud mutatsioon konstrueerib sinise fluorestseeruva valgu (BFP), mille ergastuspiik on 384 nm ja emissioonipiik ~ 445 nm juures. Selle ergastusspekter on lähedane UV-valgusele, mis kahjustab rakke töötamise ajal, ja selle lühike emissioonilainepikkus kutsub esile rakkudes autofluorestsentsi. Enhanced BFP (EBFP) on nõrgalt luminestseeruv ja vähe vastupidav fotovalgendusele ja happele ning kõrge taustasignaaliga raku pildistamiseks. Välja on töötatud kolm heledamat EBFP mutanti, sealhulgas Azurite [24], EBFP2 [25] ja mTagBFP [26], mis on 1.6-, 2.0- ja 3.{13} } korda heledam kui EBFP. mTagBFP, eredaim BFP, pärineb punase fluorestsentsvalgu (RFP) TagRFP [27] mutandist, ekstinktsioonikoefitsiendiga 52,000 M−1 cm−1 ja kvantsaagisega {{19 }}.63, mis parandab oluliselt selle vastupidavust fotovalgendusele. Y66F mutatsioon wtGFP-s annab ultramariini fluorestseeruva valgu, mille emissiooni lainepikkus on 442 nm [28]. GFP-Y66F variandi madal fluorestsentsi kvantsaagis piirab aga tõsiselt selle rakendatavust pildistamisel. GFP-Y66F edasine mutatsioon aminohapete asendustega T65Q, Y145G, H148S ja T203V annab tulemuseks ultramariini fluorestseeruva valgu Sirius, mis on 25 korda heledam kui GFP-Y66F [29].

Tsüaani fluorestsentsvalgu (CFP) ergastuspiik on 449 nm juures ja emissioonipiik ~ 482 nm juures, spektriomadused jäävad BFP ja EGFP vahele. Sarnaselt BFP-ga kasutatakse CFP konstrueerimiseks Y66W saidipõhist mutatsiooni. CFP-l on oma silmapaistva fotostabiilsuse tõttu laialdased rakendused mitmevärvilise pildistamise ja lokaliseerimise uurimisel. Näiteks CFP-d kodeeriv geen on optimeeritud inimese koodonite eelistamiseks ja on nüüd kaubanduslikult saadaval kaubanime AmCyan1 (Clontech) all. Lisaks on mitmeid mutante, mis on heledamad kui täiustatud CFP (ECFP), näiteks Cerulean, mTFP (kaks korda heledam kui Cerulean) ja türkiissinine (umbes kaks korda heledam kui ECFP) [21,30].

Kollase fluorestseeruva valgu (YFP) mutatsioonid ei ole piiratud kromofoori Y66 tuumas, vaid Y66 struktuuriliselt külgnevates jääkides. YFP ergastuspiik on ~ 518 nm, emissioonipiik on ~ 531 nm. Võrreldes GFP-ga, nihkub YFP fluorestsents punase spektri suunas, mis on peamiselt tingitud Thr asendamisest Tyr-ga positsioonis 203. Enhanced YFP (EYFP) on üks fluorestseeruvamaid ja laialdasemalt kasutatavaid FP biosensoreid rakusisese pH ja pH tuvastamiseks. kloriidioonide kontsentratsioonid. Siiski on see väga tundlik happe- ja kloriidioonide suhtes ning on vähem fotostabiilne kui paljud meduusist pärinevad FP-d [31]. EYFP täiustatud versioonid mCitrine ja mVenus on praegu enim kasutatud YFP [32,33]. GFP ja selle derivaatide fotofüüsikalised omadused on kokku võetud tabelis 1.

Tabel 1. GFP, RFP ja nende derivaatide fotofüüsikalised omadused.

Tabel 1. Jätk.

2.4. RFP tuletised

RFP on veel üks laialdaselt kasutatav FP. DsRed on tetrameer, mis kipub valkude liitmisel moodustama multimeere ja võib olla rakusisese ekspressiooni korral toksiline, seega on see konstrueeritud monomeeride saamiseks. Kõige tähelepanuväärsem RFP on perekond "mFruit", sealhulgas mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine ja mStrawberry (tabel 1), millest kõige eelistatum on mCherry mutatsioonidega K163Q ja K83L. mCherryl on kiire küpsemine, head monomeersed omadused ja parem fotostabiilsus, kuigi see on vähem hele [34]. TagRFP monomeeri kujul on aga umbes kolm kuni neli korda heledam kui mCherry, muutes selle suhteliselt heledaks monomeerseks RFP-ks, mis on praegu saadaval [27]. mKate on uudne monomeerne kaugpunane fluorestseeruv valk, mis on tuletatud TagRFP neljakohalisest mutatsioonist ja mille ergastuspiik on 588 nm juures ja emissioonipiik 635 nm juures, mis on ainult 45% heledam kui EGFP; selle dimerisatsioonivalk Katushka on 67% sama hele kui EGFP [35]. V38A, S165A ja K238R aminohapete asendustega mKate mutandil mKate2 on ligikaudu kaks korda suurem heledus kui mKate [36]. Võrreldes GFP ja RFP-ga on mKate'il ja Katushkal parem pildistamise sügavus ja rikkalikumad optilised signaalid objektisisese fluorestsentskujutise jaoks [35]. Seega on kaugpunaste fluorestseeruvate valkude arendamine väärtuslikum in vivo biopildistamiseks.

2.5. Lähi-infrapuna FP-d

Lähi-infrapuna (NIR) FP-d on pilditöötlusrakendustes valgumärgistena väga soovitud. Enamik NIR FP-sid on loodud bakteriaalsete fütokroomi fotoretseptorite (BphP) alusel [37]. Esimene elusloomade pildistamisel kasutatav NIR FP on IFP1.4, BphP-st tuletatud fluorestseeruv valk, mis fluorestseerub, seondudes biliverdiini (BV) kromofooriga [38]. DNA segamise ja juhusliku mutageneesi abil töötatakse seejärel välja heledam IFP2.0 [39]. Kuigi monomeersed IFP1.4 ja IFP2.{11}} on saavutatavad BphP dimerisatsiooniliidese katkestamisega, kipuvad need siiski kõrgete kontsentratsioonide korral dimeriseeruma. Looduslik monomeerne infrapuna fluorestsentsvalk (IFP) mIFP töötati välja 2015. aastal [40]. On tõestatud, et mIFP-l on helipildiefektid Drosophila vastsetes ja neuronites. Štšerbakova jt. kavandas kolm eredat monomeerset NIR FP-d, millel on erinevad spektrid, nimelt miRFP670, miRFP703 ja miRFP709 [41]. BphP-st tuletatud NIR FP-d vajavad BV kromofoori kovalentseks kinnitamiseks minimaalselt kahte domeeni, PAS-i (Per-ARNT-Sim) ja GAF-i (cGMP fosfodiesteraas-adenülaattsüklaas-FhlA), ja neil on ka keerukas "kaheksa sõlme" struktuur. sidudes topoloogiliselt GAF-i ja PAS-i domeenid, mis mõjutab nende voltimist. Seetõttu kasutatakse NIR-i FP-de, näiteks smURFP-de, projekteerimiseks teist klassi bakteriaalseid fotoretseptoreid, allofükotsüaniine (APC) [42]. Kuigi APC-põhised NIR FP-d on väiksemad, seovad nad BV-d vähem tõhusalt, mis põhjustab imetajate rakkudes oluliselt väiksema heleduse kui BphP-st tuletatud NIR FP-d. BphP- ja APC-põhiste NIR FP-de defektide ületamiseks töötati tsüanobakteriokroomist (CBCR) välja ühe domeeniga NIR FP nimega miRFP670nano, mis esindab esimest CBCR-st tuletatud NIR FP-d, mis suudab tõhusalt siduda endogeenset BV kromofoori ja kiirata eredat fluorestsentsi. imetajarakud [43]. MiRFP670nano oluline eelis BphP-st tuletatud NIR FP-de ees on kõrge fotostabiilsus. Täiustatud miRFP670nano3, millel on vanemliku miRFP670nano suhtes 14 mutatsiooni, omab sarnast fotostabiilsust kui miRFP670nano [44]. Tabel 2 võtab kokku NIR FP fotofüüsikalised omadused.

Tabel 2. NIR FP fotofüüsikalised omadused.

Raamprogrammide avastamine ja rakendamine on andnud kaasaegse bioloogia jaoks võimsa uurimisvahendi. Tänapäeval on FP-dest saanud üks levinumaid vahendeid, mida teadlased kasutavad oma rakenduste laiendamiseks paljudele uurimisvaldkondadele, nagu geeniekspressiooni reguleerimine, organellide märgistamine, signaaliülekanne, ravimite sõelumine ja biomolekulaarsed koostoimed. Enamik FP-sid ekspresseerivaid kloonimisvektoreid on müügil ja on saadaval kaubandusettevõtete kaudu.

3. Fluorestseeruva valgu antikeha uurimise edusammud

3.1. Monoklonaalseid antikehi sihtivad fluorestseeruvad valgud

Antikeha on teatud tüüpi immunoglobuliin, mida eritavad B-lümfotsüüdid. Monoklonaalsed antikehad koosnevad kahest raskest ahelast ja kahest kergest ahelast, kusjuures raske ahel koosneb ühest varieeruvast piirkonnast (VH) ja kolmest konstantsest piirkonnast (CH) ning kerge ahel ühest muutuvast piirkonnast (VL) ja ühest konstantsest piirkonnast (CL). ). Rasked ahelad on kovalentselt seotud disulfiidsidemetega ja kerge ahela CL piirkond on mittekovalentselt seotud raske ahela CH1 domeeniga, moodustades stabiilse antikehamolekuli [45]. Tänu oma spetsiifilisele retseptoriga seondumisvõimele toodavad monoklonaalsed antikehad mitmesuguseid bioloogilisi toimeid, nagu klassikaline blokeerimine, neutraliseerimine, komplemendi aktiveerimine, sihtrakkude tapmine Fc retseptori kaudu ja immuunaktiivsuse reguleerimine. Need on kriitilised bioloogilised makromolekulid, mida kasutatakse laialdaselt immuunanalüüsis, in vitro diagnostikas ja ravimite väljatöötamisel. Polüklonaalsed antikehad on segu heterotüüpsetest antikehadest, mis on saadud mitme B-raku immuunvastuse protsessist ja iga antikeha tunneb ära sama antigeeni erineva epitoobi [45]. Võrreldes polüklonaalsete antikehadega tuvastavad monoklonaalsed antikehad spetsiifiliselt epitoobi antigeenil ja neil on väiksem tõenäosus ristreageerida teiste valkudega, tekitades seega madalaid taustavärvimise signaale. Lisaks on monoklonaalsete antikehade tulemuste reprodutseeritavus samades katsetingimustes kõrgem kui polüklonaalsete antikehade puhul.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%) puhastatakse lihtsa 2-sammu tehnikaga, kasutades mAb FMU-GFP.{3}}seotud Sepharose 4B vaiku. Lisaks saab kõiki GFP-ga seotud funktsionaalseid rekombinantseid sihtvalke GFP epitoobi tõttu rakkudest kergesti ja otse eraldada. Need andmed viitavad sellele, et see meetod on GFP puhastamisel tõhusam kui mis tahes saadaolev meetod ja lahendab enamiku GFP puhastusmeetodite madala saagise ja puhtuse probleemi.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

3.2. Nanokeedi sihtmärgiks fluorestseeruvad valgud

3.2.1. Nanobody tutvustus

Monoklonaalsete antikehade omased omadused, nagu nende suur molekulmass, keeruline struktuur ja piiratud bioloogiline aktiivsus, on üha enam piiranud nende edasist kasutamist. Seetõttu on kiiresti vaja välja töötada alternatiivid monoklonaalsetele antikehadele. 1989. aastal Ward et al. valmistas ainult raske ahelaga antikeha varieeruva domeeni, millel oli nõrk seondumisvõime lüsosüümiga, suurendades huvi sdAb-uuringute vastu [48]. 1993. aastal avaldasid Hamers Casterman jt. avastas esimest korda kaameli seerumis uut tüüpi antikeha, mis erineb täielikult traditsioonilistest imetajate antikehadest [49]. Seda tüüpi antikeha nimetatakse kergete ahelate loomuliku puudumise tõttu HCAb-ks. HCAb koosneb CH2-st, CH3-st, hingepiirkonnast ja HCAb (VHH) varieeruvast domeenist, kuid sellel on siiski täielik antigeeni sidumisvõime. 1995. aastal kirjutasid Greenberg jt. avastas õdehaidel ainult raske ahelaga antikehad, mida tuntakse kui IgNAR-i [50]. See esineb nii sekretoorses kui ka membraaniga seotud vormis ning koosneb muutuvast piirkonnast, mida nimetatakse muutuva uue antigeeni retseptoriks (VNAR), ja mitmest konstantsest piirkonnast. Seejärel on IgNAR leitud vobbegonghail, ogahail, sarvhail ja valgetähnilisel bambushail, täiendades sdAb-de repertuaari. Nanokehale on iseloomulikud omadused: väike molekulmass, kõrge afiinsus, tugev stabiilsus, hea lahustuvus, tugev koesse tungimine ja peidetud antigeeniepitoopide äratundmine. See on äratanud suuremat tähelepanu haiguste diagnoosimisel, immuunreagentidel, patogeenide tuvastamisel ja ravimite väljatöötamisel [51]. Molekulaarbioloogia tehnikate arendamise ja geneetiliselt muundatud antikehade valmistamise tehnoloogia täiustamisega on nanokehadest saanud populaarne immuunanalüüsi uurimisvaldkond. Joonis 3 võtab kokku nanokeha senisest arengust.

Joonis 3. Nanokeha areng. Helesinine marker näitab nanokehade ravimite uurimise edenemist. FDA, toidu- ja ravimiamet; EMA, Euroopa Ravimiamet; NMPA, riiklik meditsiinitoodete amet; HCAb, raske ahela antikeha; IgNAR, Ig uue antigeeni retseptorid; sdAb, ühedomeeniline antikeha; VHH, HCAb muutuv domeen; VNAR, IgNARi muutuv domeen; PD-L1, programmeeritud rakusurm 1 ligand 1.

3.2.2. Nanokeedi sihtmärgiks fluorestseeruvad valgud

Fluorestseeruvad valgud on muutnud rakubioloogiat ja biokeemiat, pakkudes lihtsalt kasutatavaid geeniga kodeeritud fluorestsentsvalgu markereid. Valgukarkassraamatukogude sünteesi ja valimise kaudu paralleelse arenduse käigus on välja töötatud mitmeid tihedalt siduvaid aineid teadusuuringute ja ravimite sihtmärkide jaoks [52]. Näiteks on nanokehade väljatöötamine, mida on lihtsam valida parema stabiilsuse, lahustuvuse ja saagisega [53]. Erinevalt traditsioonilistest antikehadest on need väikesed ja stabiilsed nanokehad elusrakkudes funktsionaalsed. Seetõttu on FP-ga spetsiifilise seondumisaktiivsusega nanokeha võimas tööriist FP liitmiseks, eraldamiseks ja rakutehnoloogiaks erinevates bioloogiliste uuringute valdkondades.

• Camelidae päritolu nanokehad, mis on suunatud GFP-le

GFP-ga on sulandatud mitmesugused suurepäraste subtsellulaarsete lokaliseerimisomadustega valgud, luues visuaalsed antigeenid valkude tuvastamiseks otse erinevates subtsellulaarsetes osades. 2006. aastal tegid Rothbauer jt. skriiniti GFP-spetsiifilise antikeha fragmenti (cAbGFP4), immuniseerides alpakat GFP-ga [54]. Pinnaplasmonresonantsanalüüs (SPR) cAbGFP4 ja GFP antigeeni vahelise interaktsiooni kohta näitas kõrget afiinsust (KD=0,23 nM). Lisaks kombineeriti anti-GFP nanokeha monomeerse RFP-ga, saades nähtava GFP-d siduva antikeha, mida kasutati GFP-vastase nanokeha leviku uurimiseks elusrakkudes. Geelfiltrimise, immunoblotimise ja konfokaalse mikroskoopia testidega näidati, et GFP-spetsiifiline nanokeha jaotus imetajarakkudes stabiilselt ilma tuvastatava valgu lagunemise või agregatsioonita, mida tavaliselt leitakse üheahelaliste muutuvate fragmentide puhul. Veelgi enam, Kubala et al. iseloomustas GFP:cAbGFP4 kompleksi (joonis 4A) röntgenkristallograafia ja isotermilise tiitrimise kalorimeetria (ITC) [55] abil, paljastades aluse nanokehade kõrgele afiinsusele ja spetsiifilisusele valkudega seondumisel. 2020. aastal tuvastati faagikuvari abil neli erinevat GFP-vastast nanokeha, mida nimetatakse A12, B9, D5 ja E6 [56]. Natiivse PAGE ja immunosadestamise testid näitasid, et need nanokehad võivad siduda GFP-d in vitro ja in vivo.

Joonis 4. GFP-nanokeha kompleksi skeem. (A) cAbGFP4 (PDB: 3OGO, oranž); (B) GBP1 (esialgne eelarveprojekt: 3K1K, helesinine); (C) GBP4 (EPB: 3G9A, roosa); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, kollane); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, magenta). (F) Ülaltoodud nanokehade struktuurne superpositsioon GFP kompleksiga. GFP on näidatud rohelise värviga.

Valgu konformatsioon on tihedalt seotud funktsiooniga ja seda kontrollivad tavaliselt regulatiivsed tegurid. Axel et al. tuvastas seitse GFP-spetsiifilist sideainet, nimelt GFP-siduvaid valke (GBP) 1–7 [57]. Nende hulgas suurendas GBP1 GFP fluorestsentsi 10- korda, samas kui GBP4 indutseeris GFP fluorestsentsi 5-kordse vähenemise; seetõttu nimetati neid vastavalt "võimendajateks" ja "minimaatoriteks". GFP-nanokeha kompleksi struktuurianalüüsid (joonis 4B, C) näitasid, et need kaks nanokeha põhjustasid kromofoorikeskkonnas tagasihoidlikke vastandlikke muutusi, muutes selle neeldumisomadusi [58]. Lisaks tuvastati 25 GFP-spetsiifilist nanokeha (LaG), mille KD väärtused olid vahemikus 0,5 nM kuni üle 20 µM [59]. Kahevalentne nanokeha (LaG-16-LaG-2) näitas suurimat afiinsust KD väärtusega 36 pM. Lisaks suurenes GFP maksimaalne fluorestsentsi intensiivsus ~ 60%, kui seda inkubeeriti liigse LaG valguga. Zhang et al. teatas LaG16-ga komplekseeritud GFPuv kristallstruktuurist (joonis 4D) eraldusvõimega 1, 67 Å [60]. LaG16 sidumissait GFP tünnil asus GFP võimendaja teisel küljel. Seega liideti LaG16 ja GFP-võimendaja (GS)4 linkeriga. Kahevalentse nanokeha afiinsus oli 0, 5 nM, mis näitab ülikõrge afiinsusega sihtvalgu sidujate kavandamise teostatavust, dimeriseerides 2 nanokeha, mis seonduvad erinevate epitoopidega.

2014. aastal tegid Twair jt. valmistas sfGFP ja immuniseeris täiskasvanud üheküürkaameli. Eraldati seitse anti-sfGFP nanokeha, mis olid suunatud kolmele epitoobile (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 ja 08) [61]. ELISA ja immuunblotanalüüside põhjal tuvastasid need nanokehad sfGFP, mis on märgistatud vabaks või kasvuhormooniga liidetuks. Lisaks määrati sfGFP-ga kompleksis oleva nanokeha NbsfGFP02 kristallstruktuur (joonis 4E) eraldusvõimega 2, 2 Å. Biokihi interferomeetria (BLI) abil määrati afiinsus NbsfGFP02 ja sfGFP vahel 15,8 nM. NbsfGFP02 sulamistemperatuur oli 75,6 kraadi [62]; seega on see tulevane GFP nanokehade kandidaat rakendustes, mis nõuavad karme testimistingimusi. Enamikku nanokehi saab funktsionaalselt ekspresseerida in vivo plasmiidi transfektsiooni kaudu eukarüootsetesse rakkudesse. Seega on nanokehad suurepärane vahend elusrakkude struktuursete või dünaamiliste tunnuste tuvastamiseks. 2020. aastal töötasid Zhou jt. pakkus välja uudse meetodi konstrueeritud GFP-d siduvate nanokehade (cAbGFP4) ekspresseerimiseks in vitro transkriptsiooni (IVT) mRNA-na, mida nimetatakse nanokeha-mCherryks [63]. Transleerimata piirkondade ja keemiliselt modifitseeritud nukleotiidide ja polü(A) sabaga kaetud pöördkorgi analoogidega mRNA valmistati in vitro ja kasutati transfektsiooniks. Erinevalt plasmiidse DNA abil ekspresseeritud nanokehast tuvastati IVT mRNA-ga ekspresseeritud anti-GFP nanokeha 3 tunni jooksul pärast transfektsiooni ja lagunes 48 tunni jooksul. Seetõttu võimaldab nanokeha kodeeritud mRNA ekspresseerimine elusrakkudes nanokeha tõhusat kohaletoimetamist.

• Haidest saadud nanokehad, mis sihivad GFP-d.

Wei et al. näitasid, et bambushaid tekitasid tõhusa immuunvastuse GFP immuniseerimise vastu, mida iseloomustas kõrgenenud lümfotsüütide arv ja antigeenispetsiifilised IgNAR-id [64]. Kokku eraldati immuniseeritud bambushaidest 7 anti-GFP nanokeha, sealhulgas BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 ja 105, mille afiinsus oli kuni 0,3 nM, mis viitab sellele, et bambushaid toota kõrge afiinsusega IgNAR-e. Lisaks konstrueeriti bi-paratoopilised VNAR-id, millel oli kõrgeim afiinsus GFP suhtes (20, 7 pM), ja anti-GFP nanokehade kui intrakehade iseloom valideeriti imetajarakkudes. Need leiud kiirendavad bambushai sdAb-de uurimist ja edenemist, et pakkuda biomeditsiinitööstusele odavaid ja hõlpsasti kasutatavaid nanokehi.

• Nanokehad, mis on suunatud teistele fluorestseeruvatele valkudele.

Masabi on ere monomeerne roheline fluorestseeruv valk. Li et al. konstrueeris edukalt 4 × 107 transformandist koosneva antikehade raamatukogu, immuniseerides kaameleid mWasabiga kui antigeeniga, ja skriiniti 3 kõrge afiinsusega mWasabi-spetsiifilist nanokeha, mida nimetatakse Nb4, Nb6 ja Nb27 [65]. Need nanokehad tundsid ära wasabi üksi või koos programmeeritud surmaga 1 (PD-1). Kokku tuvastati 6 kõrge spetsiifilisusega mCherryt sihtivat nanokeha (LaM), mille KD väärtused jäid vahemikku 0,18 nM kuni 63 nM [59]. Lisaks eraldati kolm nanomolaarse sidumisafiinsusega iRFP{16}}spetsiifilist nanokeha (BSR1, BSR3 ja BSR4) [64]. Need andmed viitavad sellele, et bambushaide immuniseerimine võib toota kõrge afiinsusega nanokehi. Üldiselt võimaldab nanokehade võime siduda rakulisi valke ja meelitada ligi FP sulandvalke, mis võimaldab elusrakkudes rakulisi protsesse ja struktuure täpselt kontrollida. See multifunktsionaalne FP-nanolõks võimaldab teha mikroskoopilisi, biokeemilisi ja funktsionaalseid analüüse sama valgu ainulaadse kombinatsiooniga. FP-sid sihivad nanokehad on kokku võetud tabelis 3.

Tabel 3. Kokkuvõte FP-dele suunatud nanokehadest.

4. Fluorestseeruva valgu nanokeha rakendused

4.1. Rakendused valgu tuvastamisel

4.1.1. Intratsellulaarsete valkude tuvastamine

Valgu funktsiooni mõistmine nõuab usaldusväärset ja kvantifitseeritavat kõrge eraldusvõimega valgu lokaliseerimist. Kuigi antikehade kasutamine sihtvalkude märgistamiseks on molekulaarbioloogias hästi välja kujunenud, piirab seda tehnikat tavapäraste antikehade suurus ja multivalentsus. Arvestades nanokehade väikest suurust, saab neid kasutada intratsellulaarse pildistamise märgistusainetena pärast ligeerimist fluorestseeruvate molekulide, ensüümide, peptiidide, retseptorite, biotiini ja muude ravimitega. Näiteks FP-vastaseid nanokehi kasutati ülieraldusvõimega mikroskoopiapildistamisel, kui need olid märgistatud orgaaniliste värvainetega [66, 67]. Ptk2 rakud, mis ekspresseerivad pidevalt tubuliini YFP-d, pildistati seda lähenemisviisi kasutades ja eraldusvõimet parandati 269 ± 37 Å-ni, võrreldes tavaliste antikehadega ligikaudu 450 Å.

Nanokehade vahendatud märgistamine pakub kiiret ja mitmekülgset meetodit peaaegu kõigi üldkasutatavate FP-st tuletatud liitstruktuuride märgistamiseks keeruka ühemolekulilise lokaliseerimismikroskoopia (SMLM) pildistamiseks. Täpsemalt saab kahevärviline SMLM uurida mis tahes funktsionaalsete GFP ja RFP liitkonstruktsioonide subtsellulaarset lokaliseerimist, kui GFP ja RFP vastaseid nanokehi kasutatakse samaaegselt [68]. Seega saab kahevärvilise SMLM-kujutise abil kiiresti lahendada arvukalt bioloogilisi probleeme. Ariotti jt. pakkus välja modulaarse lähenemisviisi ensüümipõhise valgu märgistamise jaoks, mis võimaldab parandada kiirust ja proovide võtmist rakusisese valkude jaotumise analüüsimiseks EM-resolutsiooniga [7]. Kujundades GBP4 otse modifitseeritud sojaoa askorbaatperoksidaasi (APEX) märgisele, näidati, et APEXi saab suunata mis tahes huvipakkuvale GFP-märgistatud valgule. APEX-GBP4 liitmine tagab märkimisväärse kõrge eraldusvõimega valgu lokaliseerimise organellide alamdomeenidesse ja lühendab oluliselt aega subtsellulaarse valgu jaotuse iseloomustamiseks. Lisaks võimaldab see endogeensetel tasemetel ekspresseeritud GFP-märgistatud valkude EM-resolutsiooni.

Loodi FP-spetsiifiliste nanokehasid kodeerivate plasmiidide tööriistakast, mis liideti funktsionaalseteks mooduliteks. See tööriistakast võimaldab visualiseerida ja manipuleerida rakusiseseid signaaliradu elusrakkudes, laiendades oluliselt selle kasutusalasid in vivo [9]. Nende hulka kuuluvad fluorestseeruvad andurid Ca2+, H+ ja ATP/ADP dünaamiliseks visualiseerimiseks ning oligomeersed või heterodimeersed moodulid, mis võimaldavad valkude värbamist või isoleerimist ja organellide vaheliste membraanikontaktide äratundmist. 2017. aastal tegid Herce jt. kasutas rakku tungivat peptiidi (CPP) antikehade transportimiseks otse rakkudesse immunomärgistamiseks ja antigeeniga manipuleerimiseks [69]. Ehitati süsteem, mis kasutas ära tsüklilise arginiinirikka CPP kõrget afiinsust RNA suhtes tuumas. Sidudes tsüklilise arginiinirikka CPP GFP nanokehaga, saab rakkudes otse jälgida GFP ümberpaiknemist tuumas (joonis 5A). Seetõttu saab seda visualiseeritud süsteemi kasutada valgu asukoha jälgimiseks ja erinevate CPP-de efektiivsuse kvantitatiivseks võrdlemiseks.

Fluorestsentsresonantsenergia ülekande (FRET) tehnikat kasutatakse laialdaselt bioteaduste uuringutes, kuna see võimaldab signaalmolekule dünaamiliselt reaalajas tuvastada elusrakkudes füsioloogilistes tingimustes. Tänu oma erakordsele tundlikkusele ja spetsiifilisusele muutub ajalahutusega Försteri resonantsenergia ülekandel (TR-FRET) põhinev analüüs biomeditsiinilistes uuringutes üha populaarsemaks. Nanokehadel põhinev TR-FRET-meetod võimaldab hõlpsalt kvantifitseerida fluorestseeruvaid (suland)valke lüsaatides palju suurema tundlikkusega kui tavalised fluorestsentsi intensiivsuse näidud [70].

Joonis 5. Fluorestseeruva valgu nanokeha rakendused. (A) Valkude ja valgu interaktsioonide visualiseerimine. Rakku tungivate peptiididega (CPP) seotud anti-GFP nanokehad (Nb) võivad tungida läbi raku tuuma. Kui GFP-märgistatud valk ei interakteeru RFP-märgistatud valguga, lokaliseerub ainult GFP-märgistatud valk Nb-CPP kaudu tuumasse, näidates rohelist värvi. Kui aga kaks valku interakteeruvad, lokaliseeruvad mõlemad valgud ümber tuuma, näidates kollast värvi. (B) GFP nanokeha võimaldab äsja eksotsütoositud vesiikulite valke selektiivselt märgistada. Etapp 1: vesiikulite valk seotakse GFP-ga ja inkubeeritakse mittefluorestseeruva nanokehaga (NbGFP), mille tulemuseks on GFP kättesaamatus fluorestsentsi siduva nanokehaga (NbGFP*). Etapp 2 ja 3: Pärast raku eksotsütoosi stimuleerimist eksponeeritakse uus vesiikulite valk plasmamembraanile ja seda saab märgistada NbGFP* abil. (C) Degradeerunud skemaatiline illustratsioon. Valgu selektiivne lagunemine toimub ubikvitiini raja kaudu, mille viib läbi kompleksne ensüümide seeria. F-boxi valk (FBP) SKP1-CUL1-F-box valgu ligaasikompleksides (SCF) liidetakse anti-GFP nanokehaga (Nb), et tuvastada GFP sulandvalk ja ubikvitiini konjugeeriv ensüüm (E2) seob kovalentselt mitu ubikvitiini molekuli sihtvalguga. Seejärel lagundatakse polüubikvitineeritud valk proteasoomi poolt. (D) BiCAPi skemaatiline kirjeldus. HER valk on liidetud GFP N-terminaalsete (GFP1) või C-terminaalsete (GFP2) fragmentidega. Kui kaks fusiooni moodustavad dimeeri, voldib GFP uuesti kokku ja fluorestseerub. Seejärel rikastatakse HER-dimeeri ja sellega interakteeruvaid valke, kasutades GFP nanokeha, millel puudub seostumisvõime GFP fragmentidega ja mis võimaldab seega dimeeri eraldamist. (E) GFP-sõltuv transkriptsioonisüsteem. DNA-siduv domeen (DBD) ja aktiveerimisdomeen (AD) on sulandatud vastavalt GFP nanokehaga 1 (Nb1) ja GFP nanokehaga 2 (Nb2). GFP juuresolekul võivad DBD-Nb1 ja AD-Nb2 aktiveerida ülesvoolu aktiveeriva järjestuse (UAS) reportergeeni, mis viib sihtgeenide ülesreguleerimiseni. (F) GFP-märgistatud valkude äratundmine DNA nanostruktuuridel. Kahe sidumissaidiga DNA nanostruktuurid ligeeritakse magnetvaigule, seotakse GFP nanokehaga (Nb) komplementaarse aluste sidumise teel ja inkubeeritakse seejärel GFP-märgistatud valkudega. Seega saab GFP-ga märgistatud valke täpselt nanostruktuuride külge kinnitada.

Joonis 5. Jätk.

4.1.2. Valkude tuvastamine raku pinnal

Bakteripinna ekraan on paljutõotav tehnoloogia raku külge kinnitatud valkude tootmiseks ja terve raku katalüsaatorite kujundamiseks. Kuigi pinna kuvamiseks kasutatakse erinevaid välismembraani valke, pole pinna kuvasüsteemide hindamiseks ja arendamiseks saadaval lihtsaid, universaalseid ja suure läbilaskevõimega ühilduvaid meetodeid. Lisaks on keeruline teha vahet rakusiseste ja pinnal kuvatavate valkude vahel. Wendel et al. konstrueeris fluorestsentsil põhineva pinnaekraani tuvastamise süsteemi, ühendades GFP-nanokeha välismembraani ankrutega [71]. Ankruteks valiti kaks tavaliselt kasutatavat välismembraani valku: välismembraani valk A (OmpA) ja autotransporter (C-IgAP). Seega on kaks erinevat kuvamoodulit konstrueeritud, ühendades OmpA või C-IgAP GFP-spetsiifiliste nanokehadega, mis visualiseeritakse puhastatud GFP välise lisamisega. Kuigi GFP-d saab raku pinnal kuvada, väldib see uus meetod valepositiivsete tulemuste probleemi, kuna ainult siis, kui GFP seondub rakupinnal oleva nanokehaga, saavad rakud toota fluorestsentssignaali. Analüüs ühildub paljude fluorestsentsi tuvastamise meetoditega, sealhulgas terve raku fluorestsentsi tuvastamine plaadil, geelisisene fluorestsents, mikroskoopia ja voolutsütomeetria. See odav ja hõlpsasti loetav pinnakuvamise meetod aitab demonstreerida valkude transpordimehhanismi elusrakkude pinnale, võimaldades tulevikus ratsionaalselt arendada bakteriaalseid pinnakuvamise süsteeme ja tugevaid täisrakulisi biokatalüsaatoreid.

Neurotransmitterite vabanemine nõuab eksotsütoosi, endotsütoosi ja uute fusioonivesiikulite moodustumist. Mis juhtub vesiikulite valkudega pärast eksotsütoosi, kui need jäävad plasmamembraanile, on halvasti mõistetav. Need valgud on sageli konjugeeritud pH-tundlike GFP fragmentidega (fluor). Kuna pHluoriini pildistamist piirab tavaliselt vesiikulitest mitu korda suuremate laikude difraktsioon, on anti-GFP nanokehade kasutamine eksotsütoositud vesiikulite selektiivseks märgistamiseks väärtuslik [72]. Sidudes anti-GFP nanokehad keemiliste fluorofooridega, mis sobivad ülilahutusvõimega pildistamiseks, saab pHluoriiniga märgistatud valkude suurust ja intensiivsust erinevates tingimustes tuvastada viisil, mis pole võimalik ainult pHluoriiniga. Eksotsütoosi stimuleerimisel eksponeeritakse uued vesiikulivalgud plasmamembraanile ja seejärel seonduvad fluorestseeruvalt märgistatud nanokehad pHluoriiniga (joonis 5B). Seega on nanokehadel põhinev pHluoriini tuvastamine paljutõotav vahend eksotsütoosijärgsete sündmuste uurimiseks neuronites.

4.2. Valgumolekulide sihipärase lagunemise rakendused

Võrreldes geenide redigeerimise ja RNA interferentsiga on biomolekulide otsene manipuleerimine valgu tasemel tõhusam viis valgu funktsioonide uurimiseks, ületades piiranguid, nagu potentsiaalsed sihtmärgivälised mõjud, geenide inaktiveerimine ja olulise geeni fenotüübi funktsiooni kadumine. Valkude sihipärane lagunemine on praegu peamine uurimisstrateegia huvipakkuvate valkude funktsiooni kadumise ja proteolüüsi saavutamiseks. Nanokehadel põhinev valkude lagundaja võib aidata saavutada huvipakkuvate valkude kiiret lagunemist ja pöörduvat reguleerimist. Caussinus et al. töötas välja valkude lagundamise meetodi sihtmärk-GFP sulandvalkude otseseks ja kiireks kahanemiseks mis tahes eukarüootses süsteemis [73]. Lühidalt, GFP sulandvalgu hävitamiseks liidetakse anti-GFP nanokeha F-box valguga (FBP) SKP1-CUL1-F-box valgu (SCF) E3 ligaasi kompleksides. GFP sulandvalgu äratundmiseks. Ubikvitiini konjugeeriv ensüüm (E2) seob kovalentselt mitu ubikvitiini molekuli sihtmärk-GFP sulandvalguga. Seejärel lagundab SCF kompleks polüubikvitineeritud valku; seega on sihtvalgu eemaldamist lihtne jälgida (joonis 5C). Seda tehnikat, mida nimetatakse degradeeruvaks roheliseks fluorestsentsvalguks (deGradFP), on kasutatud GFP ja selle fusioonide lagundamiseks imetajarakkudes, sebrakala embrüote [74] ja taimedes [75].

4.3. Rakendused bimolekulaarse komplementatsiooni afiinsuspuhastussüsteemis

2016. aastal Croucher jt. töötas välja bimolekulaarse komplementatsiooni afiinsuspuhastussüsteemi (BiCAP), mis suudab tõhusalt eristada inimese epidermaalse kasvufaktori retseptori (HER) dimeeri (homoloogset ja heteroloogilist) monomeerist [76]. Selles süsteemis on FP molekuli kaks komplementaarset fragmenti sulandatud kahe HER valguga (HER1, HER2 või HER3). Neid kahte fragmenti ei saa spontaanselt kokku panna aktiivseteks fluorestseeruvateks valkudeks. Kuid oletame, et kaks HER valku interakteeruvad üksteisega. Sel juhul on need kaks fragmenti ruumiliselt üksteise lähedal ja täiendavad, rekonstrueerides need täielikuks ja aktiivseks fluorestseeruvaks valguks (joonis 5D). HER dimeeri ja sellega interakteeruvaid valke saab rikastada GFP nanokeha abil, millel ei olnud afiinsust GFP fragmentide suhtes, võimaldades seega dimeeri eraldamist ja rikastamist. Tuvastatud valkude analüüsimisel selgus, et kolmel dimeeril (HER2:HER2, HER2:HER3 ja HER1:HER2) on ühised interakteeruvad valgud ja nende spetsiifiline interaktsioon. FAM59A, valk, mis interakteeris spetsiifiliselt HER1:HER3 dimeeriga, vahendas rakuvälise signaaliga reguleeritud kinaasi raja aktiveerimist, pakkudes uut sihtmärki rinnavähi ravis.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

4.4. Rakendused muudes valdkondades

Haiguste varajane in vitro diagnoosimine ja terapeutilise toime jälgimine on haiguse diagnoosimisel suur probleem. Ideaalsel kontrastainel peaks olema hea kudede läbitungimine, kõrge antigeeniafiinsus ja kiire kliirens, minimaalselt kahjustades normaalseid kudesid. Nanokehadel on potentsiaal olla ideaalsed pildistamisained, mis võivad läbida veresooni ja siseneda kudedesse parema pildistamise ja terapeutiliste rakenduste jaoks.

FP-d mitte ainult ei valgusta rakke ja bioloogilisi protsesse, vaid loovad ka suurepärased karkassid, kuna neil puudub seos paljude peremeesvalgu võrkudega. Kasutades GBP-sid ja GFP-d karkassina bioloogiliselt aktiivse kompleksi moodustumise juhtimiseks, Tang et al. lõi hübriidsete transkriptsioonifaktorite raamatukogu, mis kontrollib ainult geeniekspressiooni GFP ja selle derivaatide juuresolekul [77]. GFP tootmine kontrollib rakuspetsiifiliste geenide ekspressiooni (joonis 5E) ja soodustab hiire võrkkesta ja aju talitlushäireid. Lisaks on GFP transgeenseid hiiri ja sebrakala tüvesid modifitseeritud, et saavutada närviahelate fotogeneetiliseks jälgimiseks GFP-sõltuv transkriptsioon. See töö kehtestab GFP positsiooni mitmekülgse karkassina ja avab ukse erinevate GFP-märgistatud rakkude selektiivseks manipuleerimiseks transgeensetes tüvedes. Sellest lähtuvalt saab rakuspetsiifiliste karkassidena mitmerakulistes organismides välja töötada ka teisi intratsellulaarseid tooteid.

DNA nanostruktuurid on muutunud oluliseks ja tõhusaks vahendiks ensüümide aktiivsuse ja valkude funktsiooni uurimiseks. Universaalsete strateegiate väljatöötamine valgukomplekside moodustamiseks DNA nanostruktuuridel on aga keeruline. Üks raskusi on huvipakkuvate valkude kinnitumine DNA nanostruktuuridele. Sommese jt. pakkus välja uudse lähenemisviisi DNA nanostruktuuride märgistamiseks [78]. Funktsionaliseerides need GFP nanokehaga, saab valgu sidumise võimet täpselt kontrollida (joonis 5F). Võrreldes GFP-spetsiifiliste DNA aptameeridega, on nanokehadel suurem spetsiifilisus, stabiilsus ja afiinsus GFP suhtes. Seetõttu on DNA nanostruktuuride rakendamist programmeeritava karkassina bioloogilistes uuringutes oluliselt lihtsustatud, ühendades DNA nanostruktuurid rakkudes, arengubioloogias ja valkude biokeemias tavaliselt leiduvate FP-dega.

5. Arutelu tulevikuväljavaadete üle

Võrreldes traditsiooniliste antikehadega on nanokehadel paremad füüsikalised ja keemilised omadused ning neid on lihtsam ekspresseerida ja skriinida. Nanokehad on oma ehituselt palju lihtsamad kui tavalised antikehad. Neid kodeerib üks geen ja mikroorganismid võivad neid kergesti toota, vähendades oluliselt tootmiskulusid. Kuigi nanokehad pakuvad antikehade uurimisel läbimurret, vajavad mõned probleemid siiski lahendamist. Ühelt poolt on nende puuduseks ebamugav kasutamine ja loomade immuniseerimise kõrge hind. Lisaks, kuna HCAb ja IgNAR on perifeerse vere monotsüütides rohkesti, skriinitakse FP antigeenidele suunatud nanokehi tavaliselt spetsiifilistest Camelidae või haide immuunraamatukogudest. Seoses raamatukogude ehitamise ja nanokehade arendamise tehnoloogiate küpsemisega on FP-spetsiifiliste nanokehade sõelumine sünteetilistest raamatukogudest uus suund, mis aitab üle saada loomade immuniseerimise ebamugavusest, lühendab katseperioodi ja vähendab oluliselt kulusid. Teisest küljest, kuigi nanokehade sõelumine ja ekspressioon on suhteliselt lihtne, on potentsiaalsete rakendusväärtustega FP nanokehade saamine väga keeruline protsess. Faagi nanokehade raamatukogude sõelumine ei saa vältida valepositiivseid tulemusi, mis on põhjustatud filamentse faagi pinna seondumisest antigeeniga, samas kui pärmi ja bakterite nanokehade raamatukogude väike maht on nanokehade skriinimisel veel üks keeruline probleem.

Nanokehade kasutamine FP vastu kasvab ka tulevikus. (1) Intratsellulaarsete antikehade tehnoloogia arenedes on muutunud kättesaadavaks rakusiseste molekulide tuvastamine elusrakkudes. Nanokehadel on selles osas ainulaadsed eelised, kuna (i) nanokeha on väike ja rakku sisenemise efektiivsus on palju suurem kui traditsioonilistel antikehadel; ja (ii) nanokeha saab ekspresseerida ja funktsioneerida elusrakkudes. (2) Bispetsiifiline nanokeha on teatud tüüpi kunstlikult modifitseeritud antikeha, mis suudab spetsiifiliselt siduda samaaegselt kahte erinevat antigeeni. Seda saab hõlpsasti konstrueerida monovalentsetest nanokehadest ja ekspresseerida mikroorganismides. Seega pakuvad FP-vastased nanokehad bispetsiifiliste nanokehade arendamiseks laialdast rakendusväljavaadet.

6. Järeldused

Selles artiklis käsitletakse FP päritolu, struktuuri ja omadusi. Samuti on kokku võetud FP-dele suunatud monoklonaalsed antikehad ja nanokehad ning nende rakendused. Kuigi antikehad on väärtuslikud vahendid bioloogiliste komponentide kuvamiseks immobiliseeritud rakkudes, piirab traditsiooniliste antikehade kasutamist elusrakkudes nende muutuvate raskete ja kergete ahelate ebaefektiivne voltimine ja kokkupanek. Antikehade otsene mikrosüst on peamine meetod, mida kasutatakse antikehade intratsellulaarsetes rakendustes, mis on tehniliselt keeruline ja rakkudele stressirohke. Kaamelist või haist pärinevad ühedomeenilised antikehad tunnevad antigeene ära nende raskete ahelate varieeruvate domeenide kaudu. Neid väikeseid ja stabiilseid nanokehi saab ekspresseerida ja elusrakkudes funktsioneerida. Seetõttu muudab FP-dele suunatud nanokehade genereerimine need bioloogilistes uuringutes väärtuslikumaks.

Viited

1. Muyldermans, S. Nanokehad: looduslikud ühedomeenilised antikehad. Annu. Rev. Biochem. 2013, 82, 775–797. [CrossRef] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanokehad ja rekombinantsed sideained rakubioloogias. J. Cell Biol. 2015, 209, 633–644. [CrossRef] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburg, A.; Brewer, R.; Ingram, J.; Kingsepp, C.; Ploegh, HL Gripiviiruse nukleoproteiini spetsiifiliste kaameli ühedomeeniliste antikehade intratsellulaarne ekspressioon paljastab selle tuuma lokaliseerimise eripärad. J. Virol. 2015, 89, 2792–2800. [CrossRef] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanokehad G valgu-seotud retseptori struktuuri ja funktsiooni uurimiseks. Annu. Rev. Pharmacol. Toksikool. 2017, 57, 19–37. [CrossRef]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. Dpp levik on vajalik mediaalseks, kuid mitte lateraalseks tiivaketta kasvuks. Loodus 2015, 527, 317–322. [CrossRef]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter – nanokehade liitmised (RAN-kehad) kui mitmekülgsed, väikesed, tundlikud immunohistokeemilised reaktiivid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2018, 115, 2126–2131. [CrossRef]

7. Ariotti, N.; saal, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG GFP-märgistatud valkude modulaarne tuvastamine kiireks skriinimiseks elektronmikroskoopia abil rakkudes ja organismides. Dev. Cell 2015, 35, 513–525. [CrossRef]

8. Früholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaoglu, Ü.; Pimpl, P. Nanokeha poolt käivitatud VSR-ide lukustamine paljastab ligandi ümberlaadimise Golgis. Nat. Commun. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole, DL; Taylor, CW Funktsionaliseeritud nanokehade geneetiliselt kodeeritud tööriistakomplekt fluorestseeruvate valkude vastu rakusisese signaalimise visualiseerimiseks ja manipuleerimiseks. BMC Biol. 2019, 17, 41. [CrossRef]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Aequoriini helendava hüdromedusaani bioluminestseeruva valgu ekstraheerimine, puhastamine ja omadused, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 1962, 59, 223–239. [CrossRef]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ Bioluminestseeruvat kaltsiumi siduvat valku equoriini kodeeriva cDNA kloonimine ja ekspressioon. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 126, 1259–1268. [CrossRef]

12. Heim, R.; Prasher, DC; Tsien, RY Rohelise fluorestseeruva valgu lainepikkuse mutatsioonid ja translatsioonijärgne autooksüdatsioon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12501–12504. [CrossRef]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zarasky, AG; Markelov, ML; Lukyanov, SA Mittebioluminestseeruvate Anthozoa liikide fluorestseeruvad valgud. Nat. Biotehnoloogia. 1999, 17, 969–973. [CrossRef]

14. Park, N.; Song, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY Vacciniaga seotud kinaas 3 (VRK3) määrab ööpäevase perioodi ja amplituudi, mõjutades kellavalkude subtsellulaarset lokaliseerimist imetajarakkudes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2017, 487, 320–326. [CrossRef]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. Notch Signaling Pathway reguleerib angiogeneesi endoteelirakkude kaudu 3D ühiskultuuri mudelis. J. Cell. Physiol. 2016, 232, 1548–1558. [CrossRef]

16. Rodriguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY Fluorestseeruvate ja fotoaktiivsete valkude kasvav ja helendav tööriistakast. Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 111–129. [CrossRef]

17. Yang, F.; Moss, LG; Phillips, GN, Jr. Rohelise fluorestseeruva valgu molekulaarstruktuur. Nat. Biotehnoloogia. 1996, 14, 1246–1251. [CrossRef]

18. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Gross, LA; Tsien, RY; Remington, SJ Aequorea victoria rohelise fluorestseeruva valgu kristallstruktuur. Teadus 1996, 273, 1392–1395. [CrossRef]

19. Reid, BG; Flynn, GC kromofoori moodustumine rohelises fluorestsentsvalgus. Biochemistry 1997, 36, 6786–6791. [CrossRef]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR Täiustatud roheline fluorestseeruv valk võimaldab geeniülekannet imetajarakkudes tundlikult tuvastada. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227, 707–711. [CrossRef]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Superkausta rohelise fluorestseeruva valgu projekteerimine ja iseloomustus. Nat. Biotehnoloogia. 2006, 24, 79–88. [CrossRef] [PubMed]

22. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP täiustatud rohelist fluorestseeruvat valku molekulaarse evolutsiooni abil, kasutades DNA segamist. Nat. Biotehnoloogia. 1996, 14, 315–319. [CrossRef] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, I.; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Lihtne kloonimisstrateegia, kasutades positiivse/negatiivse indikaatorina GFPuv geeni. Anal. Biochem. 2011, 416, 237–239. [CrossRef] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, PS Blue fluorestseeruvad valgud, millel on suurem heledus ja fotostabiilsus struktuurselt suunatud raamatukogust. Nat. Biotehnoloogia. 2006, 24, 1569–1571. [CrossRef] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE Uute kromofoorstruktuuride uurimine viib paremate siniste fluorestseeruvate valkude tuvastamiseni. Biochemistry 2007, 46, 5904–5910. [CrossRef]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslova, EA; Tšudakov, DM; Verkhusha, VV Punase fluorestseeruva valgu muundamine helesiniseks sondiks. Chem. Biol. 2008, 15, 1116–1124. [CrossRef]

27. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukjanov, K.; Lukjanov, S.; Gadella, T.; et al. Hele monomeerpunane fluorestseeruv valk pikendatud fluorestsentsi elueaga. Nat. Methods 2007, 4, 555–557. [CrossRef]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Gross, LA; Tsien, RY Roheliste fluorestseeruvate valkude mõistmine, täiustamine ja kasutamine. Trends Biochem. Sci. 1995, 20, 448–455. [CrossRef]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Ultramariinne fluorestseeruv valk, millel on suurenenud fotostabiilsus ja pH-tundlikkus. Nat. Methods 2009, 6, 351–353. [CrossRef]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Fluorestsentsi eluea sõeluuringuga tuvastatud eredad tsüaani fluorestseeruvad valgu variandid. Nat. Methods 2010, 7, 137–139. [CrossRef]

31. Päev, RN; Davidson, MW Fluorestseeruva valgu palett: vahendid raku pildistamiseks. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2887–2921. [CrossRef]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacharias, DA; Tsien, RY Kollase fluorestseeruva valgu keskkonnatundlikkuse vähendamine. J. Biol. Chem. 2001, 276, 29188–29194. [CrossRef]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Park, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. Kiire ja tõhusa küpsemisega kollase fluorestseeruva valgu variant rakubioloogilisteks rakendusteks. Nat. Biotehnoloogia. 2002, 20, 87–90. [CrossRef]

34. Shaner, NC; Campbell, RE; Steinbach, PA; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Discosoma sp. punane fluorestseeruv valk. Nat. Biotehnoloogia. 2004, 22, 1567–1572. [CrossRef]

35. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Chepurnõh, TV; Fradkov, AF; Ermakova, GV; Solovjova, EA; Lukjanov, KA; Bogdanova, EA; Zarasky, AG; Lukjanov, S.; et al. Erkpunane fluorestseeruv valk kogu keha pildistamiseks. Nat. Methods 2007, 4, 741–746. [CrossRef]

36. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermakova, GV; Solovjova, EA; Chepurnõh, TV; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletnev, VZ; Sarapuu, KL; Roche, PM; et al. Kaugpunased fluorestseeruvad märgised valgu pildistamiseks eluskudedes. Biochem. J. 2009, 418, 567–574. [CrossRef]

37. Oliinyk, OS; Tšernov, KG; Verkhusha, VV bakteriaalsed fütokroomid, tsüanobakteriokroomid ja allofükotsüaniinid lähi-infrapuna fluorestsentssondide allikana. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. Shu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, PA; Tsien, RY Bakteriaalsest fütokroomist valmistatud infrapuna-fluorestseeruvate valkude ekspressioon imetajatel. Teadus 2009, 324, 804–807. [CrossRef]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, DA; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; et al. Täiustatud monomeerne infrapuna fluorestseeruv valk neuronite ja kasvaja aju kuvamiseks. Nat. Commun. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, parlamendiliige; Reade, A.; Makhijani, K.; Song, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; et al. Looduslikult monomeerne infrapuna fluorestseeruv valk valkude märgistamiseks in vivo. Nat. Meetodid 2015, 12, 763–765. [CrossRef]

41. Štšerbakova, DM; Balaban, M.; Emelyanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Heledad monomeersed lähi-infrapuna fluorestseeruvad valgud märgistena ja biosensoritena mitmemõõtmeliseks pildistamiseks. Nat. Commun. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodriguez, EA; Tran, GN; Gross, LA; Crisp, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Kaugepunane fluorestseeruv valk arenes välja tsüanobakteriaalsest fükobiliproteiinist. Nat. Meetodid 2016, 13, 763–769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Šemetov, AA; Pletnev, S.; Štšerbakova, DM; Verkhusha, VV Väikseim peaaegu infrapuna fluorestseeruv valk arenes välja tsüanobakteriokroomist kui mitmekülgne märgis spektraalseks multipleksimiseks. Nat. Commun. 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. Oliinyk, OS; Balaban, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV Ühe domeeniga lähi-infrapunavalk loob karkassi antigeenist sõltuvatele fluorestseeruvatele nanokehadele. Nat. Meetodid 2022, 19, 740–750. [CrossRef] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM edusammud antikehade disainis. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2015, 17, 191–216. [CrossRef]

46. ​​Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Rohelise fluorestsentsvalgu (GFP) vastase monoklonaalse antikeha tootmine ja iseloomustamine. Neurosci. Res. 1997, 28, S122. [CrossRef]

47. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Song, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. Kõrge puhtuse ja saagisega GFP sulandvalkude puhastamine monoklonaalse antikehaga seotud afiinsuskolonnkromatograafia abil. Protein Expr. Purif. 2008, 59, 138–143. [CrossRef]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Escherichia coli-st sekreteeritud üksikute immunoglobuliini varieeruvate domeenide repertuaari sidumistegevused. Loodus 1989, 341, 544–546. [CrossRef]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Hammers, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Looduslikult esinevad antikehad, millel puuduvad kerged ahelad. Loodus 1993, 363, 446–448. [CrossRef]

50. Greenberg, AS; Avila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, EC; Flajnik, MF Uus antigeeniretseptori geeniperekond, mis läbib haide ümberkorraldamise ja ulatusliku somaatilise mitmekesistumise. Nat. Cell Biol. 1995, 374, 168–173. [CrossRef]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Nanokehapõhised tooted uurimis- ja diagnostikavahenditena. Trends Biotechnol. 2014, 32, 263–270. [CrossRef]

52. Skerra, A. Alternatiivsed mitte-antikehade karkassid molekulaarseks äratundmiseks. Curr. Arvamus. Biotehnoloogia. 2007, 18, 295–304. [CrossRef]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; et al. Kaameli immunoglobuliinid ja nanokehade tehnoloogia. Veter. Immunol. Immunopatool. 2009, 128, 178–183. [CrossRef]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tillib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; et al. Antigeenide sihtimine ja jälgimine elusrakkudes fluorestseeruvate nanokehadega. Nat. Methods 2006, 3, 887–889. [CrossRef]

55. Kubala, MH; Kovtun, O.; Aleksandrov, K.; Collins, BM GFP struktuurne ja termodünaamiline analüüs: GFP-nanokeha kompleks. Protein Sci. 2010, 19, 2389–2401. [CrossRef]

56. Fang, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Spetsiaalselt rohelise fluorestsentsvalgu vastu suunatud nanokehade väljatöötamine ja tootmine. Rakendus Microbiol. Biotehnoloogia. 2020, 104, 4837–4848. [CrossRef]

57. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; et al. Valgu omaduste moduleerimine elusrakkudes nanokehade abil. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 2009, 17, 133–138. [CrossRef]

58. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. Mitmekülgne nanolõks biokeemiliste ja funktsionaalsete uuringute jaoks fluorestsentsfusioonvalkudega. Mol. Kamber. Proteom. 2008, 7, 282–289. [CrossRef]

59. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; et al. Tugev torujuhe mitmekülgsete nanokehade repertuaaride kiireks tootmiseks. Nat. Meetodid 2014, 11, 1253–1260. [CrossRef]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Anti-GFP nanokehade tandemite kui ülikõrge afiinsusega puhastusreagentide struktuuripõhine projekteerimine. Sci. Vabariik 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Superkausta GFP sulandvalkude jaoks spetsiifiliste kaameli nanokehade iseloomustus. Mol. Biol. Vabariik 2014, 41, 6887–6898. [CrossRef] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Struktuursed ülevaated kahest erinevast nanokehast, mis tunnevad ära sama rohelise fluorestseeruva valgu epitoopi. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2021, 565, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Nanokehade/VHH-de kiire kohaletoimetamine elusrakkudesse in vitro transkribeeritud mRNA ekspressiooni kaudu. Mol. Ther.-Methods Clin. Dev. 2020, 17, 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; et al. Bambushai kui väikeloommudel ühe domeeni antikehade tootmiseks. Esiosa. Bioeng. Biotehnoloogia. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. MWasabi fluorestseeruvate valku siduvate nanokehade genereerimine. Anal. Biochem. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platonova, E.; Eghlidi, HM; Ewers, H. Lihtne ja mitmekülgne meetod GFP-põhiseks ülilahutusvõimega mikroskoopiaks nanokehade kaudu. Nat. Methods 2012, 9, 582–584. [CrossRef]

67. Beghein, E.; Getemans, J. Nanokehatehnoloogia: mitmekülgne tööriistakomplekt mikroskoopiliseks pildistamiseks, valgu ja valgu interaktsiooni analüüsiks ja valgu funktsioonide uurimiseks. Esiosa. Immunol. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. Platonova, E.; Talvine üleujutus, CM; Junemann, A.; Albrecht, D.; Faix, J.; Ewers, H. GFP või RFP derivaatidega märgistatud molekulide ühemolekulaarne mikroskoopia imetajarakkudes, kasutades nanokehasidujaid. Meetodid 2015, 88, 89–97. [CrossRef]

69. Herce, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, AK; Mann, FA; Fillies, M.; Kasper, M.-A.; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; et al. Rakku läbilaskvad nanokehad sihipäraseks immunomärgistamiseks ja antigeenide manipuleerimiseks elusrakkudes. Nat. Chem. 2017, 9, 762–771. [CrossRef]

70. Payne, NC; Mazitschek, R. Tiny Titans: Nanobodies as Powerful Tools for TR-FRET Assay Development. Anal. Sens. 2022, 2, e202200020. [CrossRef]

71. Wendel, S.; Fischer, EK; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH Nanokeha: GFP bakteriplatvorm, mis võimaldab funktsionaalset ensüümide kuvamist ja kuvamisvõimsuse hõlpsat kvantifitseerimist. Microb. Cell Factories 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz, KJ; Rizzoli, SO GFP nanokehad paljastavad hiljuti eksotsütoositud pHluoriini molekulid. Sci. Vabariik 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanca, O.; Affolter, M. Anti-GFP nanokeha poolt vahendatud fluorestseeruva sulandvalgu knockout. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 2011, 19, 117–121. [CrossRef]

74. Shin, YJ; Park, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, KS; Park, OK; Kwon, S.-H.; Jeon, SH; Trinh, LA; Fraser, S.; et al. Nanokehale suunatud E3-ubikvitiini ligaasi kompleks lagundab tuumavalke. Sci. Vabariik 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Nanobody-Directed Specific Degradation of Proteins by 26S-Proteasome in Plants. Esiosa. Plant Sci. 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Shearer, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; et al. Bimolekulaarse komplementatsiooni afiinsuspuhastus (BiCAP) näitab ERBB2 dimeeride dimeerispetsiifilisi valkude interaktsioone. Sci. Signaal. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Nanokehapõhine süsteem, mis kasutab rakuspetsiifilise geenimanipulatsiooni karkassidena fluorestseeruvaid valke. Cell 2013, 154, 928–939. [CrossRef]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Valgukomplekside kujundamine DNA nanostruktuuridel GFP nanokeha abil. Protein Sci. 2016, 25, 2089–2094. [CrossRef]