Beluga läätse eeltöötluse neerude kaitsev toime isheemia-reperfusioonikahjustuse korral

Syng-ook Lee,¹ Nii noor Chun,²EunHye Lee,²Bomi Kim,²BoHyun Yoon,² et al

Taust ja eesmärk. Ägeda põhjustatud isheemia/reperfusiooni (I/R) vigastusneerudkahju, põhjustab histopatoloogilisi muutusi, tuubulite rakkude apoptoosi, põletikku, oksüdatsiooni ja neerufunktsiooni kaotust. Hindasime beluga läätse eeltöötluse kaitseefekte I/R vigastuste vastu. Materjalid ja meetodid. Hiired jagati nelja rühma: normaalsed, ravimata, madala (2 mg) ja suure annusega (8 mg) beluga läätsega ravirühmad. Beluga läätse manustati suukaudselt 2 nädalat, millele järgnes kahepoolne neeruisheemia 20 minutit ja reperfusioon 30 minutit. Vereproovid janeerudkudesid koguti ja analüüsiti, et uurida neerufunktsiooni, histopatoloogiat, epiteeli ja endoteelirakkekahju, apoptoos, oksüdatiivne stress ja põletikulised reaktsioonid. Tulemused. Eeltöödeldud rühmad säilitasid neerufunktsiooni, vere uurea lämmastiku (BUN) ja kreatiniini tasemega võrreldes teiste rühmadega oluliselt madalamad. Histopatoloogiline analüüs näitas proksimaalse tuubuli vigastuse vähenemist ja vigastusega seotud molekulide arvu vähenemist (neerudvigastusmolekuli 1 (KIM-1) ja neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL)) sekretsiooni eeltöödeldud rühmades võrreldes teiste rühmadega. Terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi dUTP hüüdotsa märgistamise (TUNEL-) positiivsed rakud ja apoptoosiga seotud molekulide (Fas ja kaspaas 3) sekretsioon vähenesid eeltöödeldud rühmades võrreldes teiste rühmadega märkimisväärselt. Eeltöödeldud rühmad näitasid positiivset mikroveresoonega seotud geeni (diferentseerumisklastri (CD31)) ekspressiooni ja negatiivset adhesioonimolekuli (rakusisese adhesioonimolekuli 1 (ICAM-1)) ekspressiooni. Eeltöötlemise rühmades täheldati antioksüdantset toimet, kus oli vähenenud malonaldehüüdi (MDA) ekspressioon ja suurenenud antioksüdantse ensüümi (superoksiiddismutaas (SOD), katalaas (CAT), glutatioon (GSH) ja glutatioonperoksüdaas (GPx)) sekretsioon. Eeltöödeldud rühmades inhibeeriti F4/80 pluss makrofaagid ja CD4 pluss T-rakkude infiltratsioon ning põletikueelse tsütokiini (interleukiin- (IL-) 1, IL-6 ja tuumori nekroosifaktori (TNF-) tase langes; aga põletikuvastaste tsütokiinide (transformeeriv kasvufaktor (TGF-), IL-10 ja IL-22) tase tõusis. Järeldused. Beluga läätse eeltöötlus näitas kaitset I/R-indutseeritud neerukahjustuse vastu antiapoptootilise, põletikuvastase ja antioksüdantse toime kaudu.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche propiedaadiddeserticola takistabneerudhaigus, proovi saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Isheemia/reperfusiooni (I/R) vigastus osalise nefrektoomia või neerusiirdamise ajal põhjustab ägedaneeru-vigastus [1, 2] ja võib põhjustada neerufunktsiooni pöördumatut halvenemist [3]. Isheemia käivitab neerutuubulite epiteelirakkudes apoptoosi, mis võimendab interstitsiaalsete rakkude põletikulisi reaktsioone. Reperfusioon indutseerib mikrovaskulaarseid kahjustusi, mis soodustab põletikuliste rakkude migratsiooni läbi adhesioonifaktori ekspressiooni endoteelirakkude pinnal [4–8]. I/R vigastus põhjustab ka oksüdatiivset stressi, suurendades reaktiivseid hapniku liike (ROS) ja vähendades antioksüdantsete ensüümide aktiivsust [9], mille tulemuseks on põletikueelsete tegurite suurenenud tootmine [10], kaspaaside raja aktiveerimine ja apoptootilise rakusurma suurenemine, mis lõpuks põhjustada neerufunktsiooni kaotust [11]. I/R-indutseeritud neerukahjustuse vältimiseks on pakutud välja antioksüdantsete ainete kasutamine, millel on põletikuvastane ja antiapoptootiline funktsioon [10–14].

Läätsede kultivarid (roheline, punane, prantsuse või beluga) sisaldavad erinevaid bioaktiivseid ühendeid, eriti antioksüdante [15]. Nende polüfenoolide ja flavonoidide üldsisaldus on vastavalt 27,30–30,30 mg (parkhappe ekvivalendid)/g kuni 13,14–16,29 mg (kvertsetiini ekvivalendid)/g [16]. On näidatud, et Beluga läätsedel on märkimisväärselt kõrge polüfenoolide sisaldus ja ROS-i eemaldav toime [16]. Meie meeskond teatas läätsede antioksüdantsest toimest, kasutades in vitro maksarakuliini katset [16]. Võrreldes teiste läätsesortidega näitasid Beluga läätsed AML-12 rakkudes olulist kaitsvat toimet alkoholist põhjustatud tsütotoksilisuse vastu. Beluga läätsede põletikuvastast toimet täheldati ka lipopolüsahhariidiga töödeldud RAW264.7 rakkudes [17]. Beluga läätsega töötlemine vähendas märkimisväärselt lämmastikoksiidi (NO) tootmist ja indutseeritava NO süntaasi (iNOS) ekspressiooni tuumafaktori E2-seotud faktori 2- (Nrf2-) vahendatud heemi ülesreguleerimise kaudu. oksügenaasi-1 (HO-1) rada. Need in vitro katsed viitasid beluga läätsede antioksüdatiivsele ja põletikuvastasele toimele.

Beluga läätsede rakenduste laiendamiseks rakendasime neid neerude I / R vigastuse hiiremudelile ja hindasime neerude kaitsvat toimet. Selle katse jaoks manustati eeltöötlusena beluga läätsi 2 nädalat, millele järgnes isheemia 20 minutit ja reperfusioon 30 minutit. Beluga läätse eeltöötluse neerude kaitsvat toimet kontrolliti neerufunktsiooni, histopatoloogia, epiteeli- ja endoteelirakkude kahjustuste, apoptoosi, oksüdatiivse stressi ja põletikuliste reaktsioonide analüüsiga. Me oletasime, et eeltöötlus beluga läätsedega hoiab ära I/R-indutseeritud neerukahjustuse antioksüdantse, põletikuvastase ja antiapoptootilise toime kaudu.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Loomarühmad ja ravitingimused.

Kõik protseduurid viidi läbi loomaprotokolli abil, mille on heaks kiitnud Yeungnam University institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (AEC{0}}). Hiired (ICR, 8 nädala vanused, isased, 23–25 g, Orient, Seongnam, Korea) jaotati juhuslikult järgmisse 4 rühma (n =7 rühma kohta): (1) normaalne, normaalne kontrollrühm; (2) töötlemata, soolalahusega töödeldud rühm; (3) Madala, väikese doosiga (2mg/100μL soolalahus/-BioMed Research International hiir), 14-päevane suukaudselt manustatud beluga läätse eeltöötlusrühm; ja (4) suure annusega (8 mg/100 μL soolalahus hiire kohta), 14-päevane suukaudselt manustatav beluga lääts, eeltöötlusrühm. Beluga läätsed hankis prof Syng-Ook Lee (Keimyungi ülikool, Daegu, Korea) ning ekstrakti valmistamist ja bioaktiivsete ühendite analüüsi kirjeldati eelmises uuringus [16]. Pärast töötlemist pandi loomad lamavasse asendisse, anesteesia alla ja tehti selja sisselõige [1]. Mõlema neeru neeruarter ja veenid suleti vaskulaarse klambriga 20 minutiks, millele järgnes 30 minutiline reperfusioon vastavalt eelnevalt kirjeldatud protokollile [18, 19]. Veri koguti südame punktsiooniga ja neerud ekstraheeriti. Neerud pesti fosfaatpuhverdatud soolalahusega; ühte neeru kasutati RNA ja valgu ekstraheerimiseks, samas kui teist neeru kasutati histoloogiliseks analüüsiks.

2.2. Histopatoloogilised ja immunohistokeemilised (IHC) analüüsid.

Histopatoloogilised uuringud viidi läbi, kasutades hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimist ning vigastusi hinnati järgmiste tegurite alusel: luumenisse langevate tuubulite rakkude olemasolu, tuuma kadu kooritud rakkudes, luminaalne praht, kollaps luminaalruum ja immuunrakkude infiltratsioon. . Hinded saavutas patoloogiline spetsialist: skoor 0, torukujuline vigastus puudub; skoor 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 protsenti tuubulitest on vigastatud. IHC analüüsi jaoks fikseeriti neer 4% paraformaldehüüdiga ja parafiiniga manustatud proovid lõigati 5 μm osadeks. H&E ja IHC värvimine viidi läbi, järgides rutiinseid protsesse. Sektsioonidele kanti immuunrakkude (F4/80 ja diferentseerumisklastri 8 (CD8), Abcam, Cambridge, UK) ja endoteelirakkude (CD31 ja intratsellulaarne adhesioonimolekul 1 (ICAM-1), Abcam) vastaseid primaarseid antikehi. 24 tundi 4 kraadi juures (lahjendus 1:200), millele järgneb sekundaarne antikeha (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA), 1 tund toatemperatuuril ja 4′,6-diamidino{ {19}}tuumade värvimiseks kasutati fenüülindooli (DAPI).

2.3. Valgu analüüs.

Neerufunktsiooni analüüsiks eraldati seerum ilma antikoagulandita ning seerumi kreatiniini ja vere uurea lämmastiku (BUN) kontsentratsioon tuvastati kreatiniini kolorimeetrilise analüüsi komplekti ja Quanti-Chrom Urea Assay komplekti (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA) abil. ), vastavalt. Neerutuubulite/veresoonte vigastuse, oksüdatiivse stressi, antioksüdantsete ensüümide ja apoptoosi hindamiseks homogeniseeriti neerukude iga vastava puhvriga. Neerutuubulite epiteelirakkude kahjustuse analüüsimiseks hinnati neerukahjustuse molekuli-1 (KIM-1) ja neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL) kontsentratsioone, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) (USCN Life Science Inc. ., Wuhan, Hiina). Apoptoosi analüüsimiseks mõõdeti Fas ja kaspaas 3 kontsentratsioone, kasutades vastavaid ELISA komplekte (Abcam). Oksüdatiivse stressi hindamiseks mõõdeti malonaldehüüdi (MDA) taset MDA analüüsikomplekti abil (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, Hiina). Antioksüdantsete ensüümide, sealhulgas superoksiidi dismutaasi (SOD), katalaasi (CAT), glutatiooni (GSH) ja glutatioonperoksüdaasi (GPx) aktiivsust mõõdeti SOD testikomplekti (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), CAT analüüsikomplekti abil. Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), vastavalt GSH fluoromeetrilise analüüsi komplekti ja GPx analüüsikomplekti (BioVision Inc.). Kõiki komplekte kasutati vastavalt tootja juhistele.

2.4. Geeniekspressiooni analüüs.

Kogu RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga ja cDNA sünteesiti 20 ug kogu RNA-st, kasutades cDNA sünteesikomplekti (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Reaalajas PCR tingimused olid järgmised: 95 kraadi 10 minutit, millele järgnes 40 tsüklit 95 kraadi 10 sekundit, 60 kraadi 50 sekundit ja 72 kraadi 20 sekundit. Geeni amplifikatsioon tuvastati SYBR rohelise abil ja ekspressiooni analüüsimiseks kasutati 2-ΔΔCt meetodit. Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris, kasutades järgmisi praimerite järjestusi: interleukiin- (IL-) 1, 5'-gcccatcctctgagactcat-3′ ja 5'-aggccacagg-tattttgtcg-3′; IL-6, 5′-agttgccttcttgggactga-3′ ja 5′ -tccacgatttcccagagaac-3′; tuumori nekroosifaktor (TNF-), 5'-agcccccagtctgtatcctt-3' ja 5'-ctccctttgcagaactcagg-3′; transformeeriv kasvufaktor (TGF-), 5'-tggttgtagaggg-caaggac-3′ ja 5'-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ ja 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ ja 5′-tagcactgactcctcggaac- 3′; ja glütseraldehüüd-3'-fosfaatdehüdrogenaas (GAPDH), 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3′ ja 5′-cctgcttcac-caccttcttga-3′ .

2.5. TUNELi analüüs.

Apoptoosi hindamiseks viidi läbi TdT-vahendatud dUTP hüüdotsa märgistamise (TUNEL) test, kasutades apoptoosi tuvastamise komplekti (Chemicon, Bedford, MA, USA), järgides tootja juhiseid. Lühidalt, deparafineeritud ja rehüdreeritud slaidid lõigati valkude eemaldamiseks 20 ug/ml proteinaas K-ga 37 kraadi juures 15 tundi ja töödeldi endogeense peroksidaasi kustutamiseks 3,0% vesinikperoksiidiga. Slaidid sukeldati 1x TdT tasakaalustuspuhvrisse ja lisati 1 tunniks 37 kraadi juures TdT ensüümi töötugevus. Digoksigeniinivastast konjugaati kanti 3'-OH DNA otsale 30 minutiks ja värv töötati välja, kasutades peroksüdaasi substraati 3 minuti jooksul. Pärast DAPI-ravi paigaldati slaidid. TUNEL-positiivsed tuumad loendati iga koeproovi kõigis nägemisväljades 200-kordse suurendusega.

2.6. Statistiline analüüs.

Kõik väärtused on väljendatud keskmise ± standardhälbena. Olulisi erinevusi I/R-neerukahjustuse rühmas ja beluga läätse-I/R eelravi rühmades hinnati dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes Tukey post hoc test SPSS-is (Sotsiaalteaduste statistikapakett v. 9). 2}}; Chicago, IL, USA). p väärtused < 0,05="" peeti="">

cistanche salsa eelised

3. Tulemused

3.1. Beluga läätse eeltöötluse mõju neerufunktsioonile.

Mõlemad eeltöödeldud rühmad näitasid märkimisväärset kaitseefekti I/R vigastuste vastu (joonis 1). Keskmine BUN ja seerumi kreatiniini kontsentratsioon ravimata rühmas olid vastavalt 89 :92 ± 7:29 mg/dl ja 0:48 ± 0: 16 mg/dl. Eeltöödeldud rühmades vähenes oluliselt BUN (madal: 22:6±3:67mg/dl; kõrge: 21:6±3:17mg/dl) ja seerumi kreatiniinitase (madal: 0:25 ± {{19} }:04mg/dL; kõrge: 0:23 ± 0:04mg/dL) kontsentratsioonid võrreldes ravimata rühmaga (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. Beluga läätse eeltöötluse mõju tubulaarsete epiteelirakkude vigastustele ja apoptoosile.

Tubulaarset vigastust, eriti epiteelirakkude atroofiat, täheldati sageli neeru välimises medullas ning aeg-ajalt tuvastati neerude neerudes eksfolieerunud rakkude tuumakadu, luminaalset prahti neerutuubulis, kollapsit luminaalset ruumi ja interstitsiaalseid neutrofiilide infiltraate. ravimata rühm (joonis 2(a)). Seevastu eeltöödeldud rühmade neerud näitasid peaaegu normaalset rakulist morfoloogiat ja torukujulisi vigastusi täheldati harvemini suure annuse rühmas kui väikese annuse rühmas. Kui vigastust väljendati protsendina pindalaühiku kohta, vähenes vigastuse skoor eeltöödeldud rühmades (madal: 2:0±0:93; kõrge: 1:5± {{ 11}}:53) võrreldes ravimata rühmaga (2:87 ± 1:25) (joonis 2(b)). KIM-1 ja NGAL sekretsiooni uurimisel (joonis 2(c)) näitasid ELISA tulemused, et KIM-1 sisaldus langes eeltöödeldud rühmades (madal: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg; kõrge: 1827:83 ± 278:26 pg/mg) võrreldes ravimata rühmaga (1977:83 ± 184:49 pg/mg). NGAL-i ekspressioon vähenes märkimisväärselt suurte annustega rühmas (489:34 ± 19:95 pg/mg) võrreldes madala annuse (527:36 ± 15:19 pg/mL) ja ravimata rühmadega (537:05 ± 15): 70 pg/mg) rühmad (lk<>

Seejärel analüüsiti, kas tubulaarsete epiteelirakkude vigastus põhjustas apoptoosi. Raku apoptoosi hinnati fragmenteeritud kromosomaalse DNA tuvastamise teel, kasutades TUNEL-testi (joonis 2 (d)). TUNEL-positiivseid rakke täheldati eeltöödeldud rühmades harva (madal: 5:00 ± 1:22; kõrge: 2:25 ± 1:09). Seevastu ravimata rühmas oli suhteliselt suurenenud TUNEL-positiivsete rakkude arv medulla välimises piirkonnas (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

I/R poolt indutseeritud tubulaarsete epiteelirakkude apoptoos.

3.3. Beluga läätse eeltöötluse mõju endoteelirakkude vigastusele.

Beluga läätse eeltöötluse mõju endoteelirakkudele kontrolliti IHC-ga, kasutades CD31 antikeha (joonis 3 (a)). Normaalses rühmas tuvastati CD31-positiivsed veresooned, kuid ravimata rühmas CD31-positiivseid rakke ei tuvastatud, mis viitab I/R-indutseeritud vaskulaarsele häirele. Suure annusega eeltöötlemise rühmas ilmnesid CD{7}}positiivsed rakud peritubulaarsetes kapillaarides, mis viitab suures annuses beluga läätse eeltöötluse veresooni kaitsvale toimele. Endoteelirakke uuriti adhesioonimolekuli ICAM{10}} tuvastamise teel ja positiivseid rakke tuvastati sagedamini töötlemata rühma torukujulises piirkonnas (46:4±41:7 rakud/slaid) võrreldes eeltöödeldud rühmadega ( madal: 5:77 ± 1:01 rakku/slaid; kõrge: 3:72 ± 1:05 rakku/- slaid) (joonis 3(b)). Need tulemused näitasid, et beluga läätse eeltöötlus säilitas kapillaare ja inhibeeris adhesioonimolekuli aktivatsiooni endoteelirakkude pinnal.

3.4. Beluga läätse eeltöötluse mõju oksüdatiivsele stressile.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), SOD jaoks (madal: 360:21 ± 56:42U/mL; kõrge: 362:7{{ 36}} ± 70 :32 U/mL ja töötlemata: 333:52 ± 41:58 U/mL), CAT (madal: 3:64 ± 1:09 nmol/g; kõrge: 3:21 ± 0:76 nmol/g); ja töötlemata: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH (madal: 4:13 ± 0:53 nmol/mg; kõrge: 4:56 ± 0:69 nmol/mg; ja töötlemata: 3:59 ± 0 :53 nmol/mg) ja GPx (madal: 198:89 ± 48:43 U/ug; kõrge: 219:61 ± 138:08 U/ug; töötlemata: 165:14 ± 34:73 U/ug). Kuigi need erinevused ei olnud statistiliselt olulised, näitasid need tulemused, et beluga läätse eeltöötlus hoidis ära I/R-indutseeritud neerude oksüdatiivse stressi, suurendades neerude antioksüdantide potentsiaali.

3.5. Beluga läätse eeltöötluse mõju immuunrakkude infiltratsioonile, tsütokiinidele ja põletikule. Apoptoosist põhjustatud põletiku hindamiseks analüüsiti makrofaagide (F4/80 pluss) ja T-rakkude (CD4 pluss) infiltratsiooni ning põletikueelset tsütokiini (IL-1, IL-6 ja TNF-) vabanemist. IHC analüüsi põhjal täheldati eeltöödeldud rühmades vähem F4/80 pluss ja CD4 pluss infilteerivaid immuunrakke kui ravimata rühmas (joonis 5(a)). Reaalajas tehtud PCR analüüs näitas, et põletikku tekitavate tsütokiinide (IL-1, TNF- ja IL 6) neerude mRNA tasemed langesid eeltöödeldud rühmas võrreldes ravimata rühmaga (joonis 5(b). )). Siiski tõusid põletikuvastaste tsütokiinide (TGF- ja IL-22) mRNA tasemed eeltöödeldud rühmades võrreldes ravimata rühmadega, välja arvatud IL-10 (joonis 5(c)). Need tulemused näitasid, et I/R-indutseeritud neerupõletiku kahjustusi saab ennetada beluga läätsede eeltöötlusega tänu põletikuvastasele toimele, kuigi IL{28}} see ei mõjutanud.

antotsüaniini lisand

4. Arutelu

I/R-i põhjustatud neerukahjustust iseloomustab traditsiooniliselt kiire neerufunktsiooni langus [20]. Neerufunktsiooni saab hinnata BUN-i ja seerumi kreatiniini väärtuste abil, mis on lämmastikku sisaldavad metaboolsed lõpp-produktid, mis näitavad glomerulaarfiltri funktsiooni [21]. Ravimata rühmal ilmnesid oluliselt suurenenud BUN (89:92 ± 7:29 mg/dl) ja kreatiniini (0:48 ± {{2{22}}}}: 16 mg/dl) väärtused, mis viitab funktsionaalsele neerupuudulikkusele. indutseeritud I/R. Beluga läätsedega eeltöödeldud rühmad näitasid aga märkimisväärselt vähenenud BUN-i (madal: 22:6±3:67mg/dl; kõrge: 21:6±3:17mg/dL) ja seerumi kreatiniinisisaldust (madal: 0): 25 ± 0: 04 mg/dl; kõrge: 0:23 ± 0:04 mg/dl) väärtused (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

Neerufunktsiooni langus viitab glomerulaarfiltratsiooni probleemidele, mis on põhjustatud glomerulaarfiltri tagumisest lekkest läbi tubulaarse epiteeli, mis kujutab endast piirkonda, mis on I/R poolt kõige rängemalt vigastatud [23]. I/R põhjustas kooritud raku tuumakadu, luminaalset prahti neerutuubulitel ja kokkuvarisenud luminaalseid tühikuid tubulaarsetes epiteelirakkudes. Eeltöödeldud rühmad näitasid annusest sõltuval viisil vähenenud histopatoloogilist tubulaarset kahjustust. Täheldatud histopatoloogilist tuubulikahjustust kinnitati molekulaarsete markerite KIM-1 ja NGAL [24] hindamisega. KIM-1 on fosfatidüülseriini retseptor, mis toimib apoptootilise raku äratundmise molekulina, kandes vigastatud raku lüsosoomi apoptootilise/nekrootilise raku fagotsütoosi, apoptootilise prahi eemaldamise ja põletikulise reaktsiooni piiramise eesmärgil [25]. NGAL on väike siderofoorne valk, mis seondub inimese neutrofiilidest saadud želatinaasidega. NGAL-i ekspresseeritakse normaalsetes neerudes harva, kuid ägedad, isheemilised või toksilised neerukahjustused põhjustavad NGAL-i sekretsiooni epiteelirakkude poolt proksimaalsetes/distaalsetes tuubulites, mis suurendab NGAL-i kontsentratsiooni uriinis ja veres; seega saab NGAL-i kasutada uudse varajase biomarkerina I/R-indutseeritud ägeda neerupuudulikkuse korral[26]. Eeltöödeldud rühmades vähenes KIM-1 ja NGAL sekretsioon ning suurte annustega eelravi saanud rühmas vähenes NGAL sekretsioon oluliselt võrreldes ravimata rühmaga. Täheldatud tubulaarsete vigastuste ning KIM{10}} ja NGAL-i valgu sekretsiooni vähenemine näitas, et beluga läätse eeltöötlus avaldas kaitsvat toimet I/R poolt põhjustatud tubulaarsete epiteelirakkude kahjustuste vastu.

Kui I/R vigastus on tõsine, puhastatakse kahjustatud rakud apoptootilise raja kaudu, mis on patofüsioloogiline rakusurma mehhanism [27]. Apoptoosispetsiifilist DNA kahjustust saab tuvastada TUNEL-testi abil.

TUNEL-positiivseid rakke täheldati sageli töötlemata rühmas, samas kui beluga läätsega eeltöödeldud rühmades vähenes TUNEL-positiivsete rakkude arv annusest sõltuval viisil. Seda apoptoosi histoloogilist tõendit kinnitati Fas ja kaspaas 3 ekspressioonide uurimisega. Fas on ligand, mis seondub rakusurma retseptoriga ja mida esialgu täheldatakse programmeeritud rakusurma ajal [28]. Kaspaas 3 on apoptootilise rakusurma raja rakusisene täitmisensüüm, mille tulemuseks on apoptootilise keha moodustumine [29]. Fas ja kaspaas 3 valkude süntees olid eeltöödeldud rühmas märkimisväärselt vähenenud võrreldes ravimata rühmaga, kinnitades, et beluga läätse eeltöötlus võib inhibeerida apoptootilist signaaliülekannet pärast I/R vigastust.

I/R vigastus kutsub esile ka neerude mikroveresoonte kadumise [30], mille tulemuseks on patohistoloogilised muutused endoteelirakkudes [20]. Neeru mikroveresoonte kahjustus tuvastati endoteelirakkude markeri CD31 vastase antikehaga [30]. CD31 ekspressiooni ravimata rühmas ei tuvastatud, mis viitab neerude mikroveresoonte kadumisele. Suure annusega eeltöödeldud rühm näitas siiski positiivset CD31 ekspressiooni, mille veresoonte tihedus oli sarnane normaalses rühmas, mis näitas, et beluga läätse eeltöötlus suurtes annustes avaldas endoteelirakkude säilimisele kaitsvat toimet. Kahjustatud endoteelirakud ekspresseerivad endoteeli-leukotsüütide adhesioonimolekule, nagu ICAM-1 [31]. Suurenenud adhesioonimolekulid võivad põhjustada leukotsüütide aktivatsiooni, kapillaaride obstruktsiooni, tsütokiinide tootmist ja põletikueelseid reaktsioone [32]. Töötlemata rühmal ilmnes positiivne ICAM-1 ekspressioon, mis viitab endoteelirakkude kahjustusest põhjustatud suurenenud adhesioonimolekuli ekspressioonile. Suure annusega eeltöödeldud rühmal ilmnes aga negatiivne ICAM{15}} ekspressioon, mis viitab beluga läätse eeltöötluse kaitsvale toimele endoteelirakkude säilitamisel nii funktsionaalselt kui ka füsioloogiliselt. Hooldatud vaskulaarsed struktuurid võivad tagada pideva verevoolu, tarnides hapnikku ja toitaineid kudedesse ja rakkudesse, mis on kahjustatud I/R poolt, aidates kaasa neerude funktsionaalsele ja histoloogilisele taastumisele.

Reperfusioon taastab kahjustatud rakkude hapnikuvarustuse, mis võib vallandada oksüdatiivse stressiga seotud ensüümide ekspressiooni, mis muudavad hapniku ROS-iks [33]. ROS on ebastabiilsed ja väga reaktiivsed tooted, mis tekitavad vabu radikaale, mis põhjustavad raku valkude, lipiidide ja nukleiinhapete muutumise kaudu DNA kahjustusi, apoptoosi ja nekroosi. Vabad radikaalid kahjustavad küllastumata rasvhappeid rakumembraanis, mille tulemuseks on lipiidide peroksüdatsioon [34]. Lipiidperoksiid laguneb seejärel MDA-ks, mis vähendab antioksüdantsete ensüümide aktiivsust, nagu SOD, GPx, GSH ja CAT [35]. SOD katalüüsib superoksiidi dismutatsiooni hapnikuks ja vesinikperoksiidiks, mida CAT veelgi lagundab. GPx on peamine antioksüdantne ensüüm, mis eemaldab peroksiidi GSH abil. GSH võib koos GPx-ga detoksifitseerida mitmesuguseid oksüdatiivseid tooteid. MDA ja antioksüdantsete ensüümide tasemed näitasid ELISA analüüsis pöördvõrdelist seost. Eeltöödeldud rühmades oli MDA ekspressioon suhteliselt madal, kuid antioksüdantsete ensüümide ekspressioon oli kõrge, võrreldes nende vastavate tasemetega töötlemata rühmas.

Need tulemused näitasid, et beluga läätse eeltöötlus võib vähendada I / R-indutseeritud neerukahjustust, blokeerides oksüdatiivse stressi rada, pärssides membraani lipiidide peroksüdatsiooni ja aktiveerides antioksüdantseid ensüüme.

Reperfusioon käivitab ka veresoonte endoteelirakkude aktivatsiooni, mille tulemuseks on ICAM-1 ekspressioon raku pinnal. Ekspresseeritud ICAM-1 ühendub neutrofiilidega lümfotsüütide funktsiooniga seotud antigeeni-1 (LFA-1) kaudu, mille tulemuseks on neutrofiilide kinnitumine endoteelirakkudele, neutrofiilide infllatsioon ja põletikuliste ainete sekretsioon. tsütokiinid neutrofiilide poolt [36]. Pärast neutrofiilide ilmumist kahjustatud piirkonda toimub F4/80 pluss makrofaagide infiltratsioon. Makrofaagid eristuvad sõltuvalt ajast ja ümbritsevast keskkonnast põletikku soodustavateks M1 ja põletikuvastasteks M2 fenotüüpideks. M1 makrofaagid sekreteerivad põletikuvastaseid tsütokiine (IL-1, TNF- ja IL- 6), mis on seotud I/R-indutseeritud neerukahjustusega, samas kui M2 makrofaagid sekreteerivad põletikuvastaseid tsütokiine (TGF-, IL{ {19}} ja IL-22) [37, 38]. Makrofaagid stimuleerivad ka CD4 pluss T-rakkude aktivatsiooni. Aktiveeritud T-rakud sünteesivad interferooni (IFN-), mis võimendab immuunvastust M1 makrofaagide aktiveerimise kaudu [39]. Selles uuringus näitasid beluga läätsega eeltöödeldud rühmad inhibeerivat toimet F4/80 pluss makrofaagide ja CD4 pluss T-rakkude infiltatsiooni vastu neerukoore piirkonda, mille tulemuseks oli IL-1, IL-6 vähenenud ekspressioon, ja TNF-mRNA ning TGF-, IL-10 ja IL-22 mRNA suurenenud ekspressioon. Need tulemused näitasid, et beluga läätse eeltöötlus võib vähendada põletikulist vastust, inhibeerides immuunrakkude sissetungi ja vähendades põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni.

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõttes näitasid beluga läätse eeltöötlusrühmad proksimaalse tuubuli vigastuse vähenemist, vigastusega seotud molekulide sekretsiooni vähenemist, TUNEL-positiivsete rakkude vähenemist, apoptoosiga seotud molekulide sekretsiooni vähenemist, positiivset mikroveresoonte ekspressiooni, negatiivset adhesioonimarkeri ekspressiooni, antioksüdantset toimet ja põletikuvastast toimet. vastuseid. Seetõttu avaldas beluga läätse eeltöötlus antiapoptootilise, põletikuvastase ja antioksüdatiivse toime kaudu kaitsvat toimet I/R-indutseeritud neerukahjustuse vastu. Selle uuringu tulemuste põhjal saab neerufunktsiooni säilitada, kasutades beluga läätsede ravi I/R vigastustega seotud kliinilistes olukordades, nagu osaline nefrektoomia.

flavonoidide toidulisandid neerudes

Andmete kättesaadavus

Andmed on saadaval nõudmisel.

Avalikustamine

Käsikirja kokkuvõttest teatati Korea Uroloogide Assotsiatsiooni 72. aastakoosolekul.

Huvide konfliktid

Huvide konflikte ei ole.

Autorite kaastööd

Sellesse töösse panustasid võrdselt Syng-ook Lee ja So Young Chun.

Tänuavaldused

Seda tööd toetas Kyungpooki riikliku ülikooli haigla biomeditsiiniuuringute instituudi toetus (2019).

1 Keimyungi ülikooli toiduteaduse ja -tehnoloogia osakond, Daegu 42601, Korea Vabariik

2BioMedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41940, Korea Vabariik

3 Laboratory Animal Research Support Team, Yeungnam University Hospital, Daegu 42415, Korea Vabariik

4 Sisehaiguste osakond, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Korea Vabariik

5 Kyungpooki riikliku ülikooli meditsiinikooli uroloogia osakond, Daegu 41566, Korea Vabariik

6 Patoloogia osakond, meditsiinikool, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea Vabariik

7 Uroloogia osakond, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Korea Vabariik

Viited

[1] SY Chun, DH Kim, JS Kim jt, "Uudne seljalõhe lähenes mitteisheemilisele osalisele nefrektoomia meetodile neerukoe regenereerimiseks hiiremudelis", Tissue engineering and regenerative medicine, vol. 15, nr. 4, lk 453–466, 2018.

[2] M. Agrawal ja R. Swartz, "Äge neerupuudulikkus", American Family Physician, kd. 61, nr. 7, lk 2077–2088, 2000.

[3] KR Tuttle, "Isheemiline nefropaatia", Current Opinion in Nephrology and Hypertension, vol. 10, ei. 2, lk 167–173,2001.

[4] K. Singbartl ja K. Ley, "Kaitse isheemia-reperfusioonist põhjustatud raske ägeda neerupuudulikkuse eest E-selektiini blokeerimisega", Critical Care Medicine, vol. 28, nr. 7, lk 2507–2514, 2000.

[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette ja NL Tilney, "Tsütokiini adhesioonimolekuli kaskaad roti neeru isheemia/reperfusioonikahjustuse korral. Inhibeerimine lahustuva P-selektiini ligandiga", The Journal of kliiniline uuring, vol. 99, nr. 11, lk 2682–2890, 1997.

[6] J. Niu, J. Wu, X. Li ja F. Zhang, "Endoteliini -1/endoteliin retseptori A seos hiire neerude põletikuga pärast ägedat isheemiat/reperfusiooni", Molecular Medicine Reports, vol. . 11, nr. 5, lk 3981–3987, 2015.

[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen jt, "Peroksiidi II mõju neeruisheemia/reperfusioonikahjustuse põhjustatud apoptoosile rottidel", Experimental and Therapeutic Medicine, vol. 9, nr. 3, lk 817–822, 2015.

[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han jt, "Isheemia/reperfusioonist põhjustatud karbonaadi ekspressioon soodustab apoptoosi ja kahjustab neerufunktsiooni taastumist: atsidoosi ja Gpr4 roll", PLoS One, vol. 9, nr. 10, artikkel e110944, 2014.

[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, JA Thompson ja LA MacMillan-Crow, "Oksüdatiivse stressi mitokondriaalsed sihtmärgid neeruisheemia/reperfusiooni ajal", Archives of Biochemistry and biophysics, vol. 412, nr. 1, lk 27–33, 2003.

[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk et al., "Põletik ja kaspaasi aktivatsioon pikaajalise neeruisheemia/reperfusioonikahjustuse ja immunosupressiooni korral rottidel", Kidney International, vol. 68, nr. 5, lk 2050–2067, 2005.

[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien ja MK Lai, "Isheemiline konditsioneerimine lühikeste reperfusiooniperioodidega nõrgendab neeruisheemiat/reperfusioonist põhjustatud apoptoosi ja autofagiat rottidel", Journal of biomedical science, vol. 16, nr. 1, 2009.

[12] EM El Morsy, MA Ahmed ja AA Ahmed, "Neeruisheemia/reperfusioonikahjustuse nõrgenemine açai ekstrakti eelkonditsioneerimisega rotimudelis", Life sciences, vol. 123, lk 35–42, 2015.

[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal jt, "Hyperbaric hapnikuteraapia leevendab oksüdatiivset stressi ja koekahjustust neeruisheemia/reperfusioonikahjustuse korral rottidel", Renal Failure, vol. 34, nr. 10, lk 1305–1308, 2012.

[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu jt, "Osooni oksüdatiivne eelkonditsioneerimine inhibeerib põletikku ja apoptoosi neeruisheemia/reperfusioonikahjustuse rotimudelis", European Journal of pharmacology, vol. 581, nr. 3, lk 306–314, 2008.

[15] BJ Xu, SH Yuan ja SK Chang, "Jahehooaja kaunviljade ja muude valitud kaunviljade fenoolse koostise, antioksüdantide võimekuse ja värvuse võrdlevad analüüsid", Journal of Food Science, vol. 72, nr. 2, lk S167–S177, 2007.

[16] SO Lee ja SH Lee, "Erinevate kultivaride läätseekstraktide polüfenoolisisaldus ja antioksüdantne toime", Korea Toiduteaduse ja Toitumise Ühingu ajakiri, vol. 45, nr. 7, lk 973–979, 2016.

[17] SO Lee ja SH Lee, "Beluga läätse metanooliekstrakti nrf2-vahendatud põletikuvastane toime LPS-iga töödeldud RAW264.7 rakkudes", 2018. aasta KFN rahvusvaheline sümpoosion ja aastakoosolek, lk {{ 7}}, Busan, Korea, 2018.

[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay jt, "Neeru isheemia-reperfusioonikahjustus: vigastuse ja regeneratsiooni hiiremudel", JoVE (Journal of Visualized Experiments), nr. 88, lk. 8. 2014.

[19] Q. Wei ja Z. Dong, "Hiire mudel isheemilise ägeda neerukahjustuse kohta: tehnilised märkused ja trikid", American Journal of Physiology-Renal Physiology, vol. 303, nr. 11, lk F1487–F1494, 2012.

[20] JV Bonventre ja L. Yang, "Isheemilise ägeda neerukahjustuse raku patofüsioloogia", The Journal of Clinical Investigation, vol. 121, nr. 11, lk 4210–4221, 2011.