lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Osa: II neeru- ja neeruvälised ilmingud täiskasvanud sebrakala tsüstinoosi mudelis

2.3.5. Ctns−/− Sebrafish näitab sarvkesta suurenenud paksust

Tsüstinoosmõjutab silmi, mille tulemuseks on tsüstiini kogunemine mitmetesse kudedesse, nagu iiris, sidekesta ja võrkkesta epiteel, kuid sarvkest on tsüstiini akumuleerumise tõttu kõige enam mõjutatud [19] ja selle paksus on suurem [20]. Kasutades H&E värvimist, märkisime, et ctns−/−sebrafish näitas sarvkesta stromaalse kihi paksust võrreldes metsiktüüpi (joonis 10A, B, E) sebrakalaga. Kuid me ei näidanud ilmseid kõrvalekaldeid ctns-/-sebrafish võrkkesta epiteelis (joonis 10C, D).

Joonis 9. Keskmine ujumiskiirus metsiktüüpi ja ctns−/−sebrafish. Keskmine kiirus on vähenenud ctns−/−sebrafishil võrreldes metsiktüübiga mõlemas soost. Keskmist ujumiskiirust mõõdetakse pikslites sekundis. Iga punkt tähistab ühte sebrakala, kokku n=6 metsiktüüpi ja n=6 ctns−/−18- kuu vanust sebrakala. Kahesuunaline ANOVA Fisheri vähima olulise erinevuse (PLSD) testiga: ** p <>

Joonis 10. Silma histoloogia metsiktüüpi ja ctns−/− sebrakaladel. (A, B) Esinduslikud kujutised metsiktüüpi (A) ja ctns−/− (B) 18-kuuse sebrakala sarvkestast. Sarvkesta stroomakiht (mustad nooleotsad ja mustad jooned). H&E värvimine. Skaala ribad tähistavad 50 µm. (C, D) Metsiktüüpi (A) ja ctns-/- (B) sebrakala võrkkesta esinduslikud kujutised. H&E värvimine. Skaala ribad tähistavad 50 µm. (E) Sarvkesta stromaalse kihi paksuse suhteline kvantifitseerimine. Iga punkt tähistab üht sarvkesta stromaalse kihi paksuse fiktsiooni. Paaritu t-test Welchi parandusega, kaheosaline: * p <>

2.3.6. Täiendavad Ctns−/− sebrakala fenotüübid

Lisaks ülalmainitud fenotüüpidele teostasime aju ja munasarja histoloogilise analüüsi, leidmata erinevusi metsiktüüpi sebrakala vahel. Lisaks hindasime ctns-/- ja metsiktüüpi sebrakala keha pikkust ja kaalu 18 kuu vanuselt ning leidsime suurenenud kehakaalu, samas kui leidsime mõlemast soost ctns-/-sebrakala kehapikkuse suurenemise võrreldes metsiktüübiga (S1pp).

3. Arutelu

Viimaste aastakümnete jooksultsüstinooson muutunud lapseea surmavast haigusest ravitavaks metaboolseks häireks, millega patsiendid võivad ellu jääda täiskasvanueas ja jõuda kõrgesse ikka [21,22]. Patsientide pikem elulemus paljastas uudsed haigusfenotüübid ja tekitas uusi küsimusi raviviiside patogeneesi ja pikaajaliste mõjude kohta. Sellega seoses muutub tsüstinoosi täiskasvanud loommudelite uurimine üha asjakohasemaks.

Käesolevas uuringus uurisime neerude ja ekstrarenaalset 18-kuulise täiskasvanud-sebra mudeli ilmingud, mis vastab inimese vanusele 40–50 aastat [23,24]. Esiteks kinnitasime, et täiskasvanud ctns−/− sebrakala mudel näitab tsüstiini kogunemist kogu kehas ja erinevates organites. Aastalneerud, täheldasime histoloogilisel tasemel PTEC kahjustuse märke, mida peegeldasid arvukad hüaliinitaolised eosinofiilsed tilgad, tsütoplasmaatilised vakuoolid ja harja piiride osaline kadu. Lisaks tekkis ctns−/−isastel sebrakalal glomerulaarne hüpertroofia. Lõpuks näitasime, et lõhustatud kaspaas 3 ekspressioon suurenes ctns-/-sebrafishi neerude PTEC-s, mis näitab, et apoptoos on seotud sebrakala nefropaatilise tsüstinoosi patogeneesiga. Alatestsüstinoospatsientidel esineb ka ekstrarenaalne ilminguid, uurisime oma sebrakala mudelis ctns-/- mutatsiooni mõju teistele elunditele. Huvitaval kombel leidsime, et ctns-/-mutatsioon põhjustas naha anatoomia kahjustusi ja mõjutab viljakust, liikumisaktiivsust ja silmi.

Lüsosoomid on rakusisese seedimise kohad ja neid peetakse raku metabolismi olulisteks koordinaatoriteks [25]. Kuna tegemist on lüsosomaalse ladestumise haigusega, on selle peamine omadustsüstinooson lüsosomaalne tsüstiini akumulatsioon [26,27]. Huvitaval kombel avastasime metsiktüübiga võrreldes 54-kordse tsüstiinisisalduse suurenemise 18-kuuse tsüstinoossebra kogu kehas, samas kui meie eelmises uuringus [10] esines tsüstinoosi sebrakala vastsete puhul 6 päeva pärast viljastamist 13-kordne kasv. Üldiselt näitavad need andmed, et tsüstiin koguneb tsüstinoossebrakala elu jooksul. Vedelikkromatograafia ja massispektromeetria analüüs on kinnitanud, et kõigi elundite hulgasneerudon tsüstiini akumulatsiooni eelistatud koht. Tsüstiiniga laetud PTEC-s [28, 29] on teatatud lüsosomaalsest tursest ja hüaliinitaolistest eosinofiilsetest tilkadest lüsosoomides ning inimese biopsiates ilmnevad tsüstiini kristallid polümorfsete kujuruumidena interstitsiaalsetes makrofaagides ja PTEC tsütoplasmas [27]. Inimese kudedes on tsüstiini akumuleerumine ja kristalliseerumine elu jooksul toimuv kumulatiivne protsess. Sisuliselt ei tuvastatud ctns-/-sebrakala vastsete staadiumis tsüstiinikristalle [10], samas kui meie pilootkatsetes leidsime, et tsüstiinikristallide polümorfne kuju ilmub 3 ja 6 kuu vanuselt ning on selgelt nähtav. 18-kuu vanuselt, mis viitab tsüstinoosi toime järkjärgulisele halvenemiseleneerud.

Klõpsake selleksTsistanche toime neeruhaiguste korral

Glomerulite histoloogiliste muutuste hindamiseks mõõtsime PAS-värvitud lõikudel Bowmani kapsli, glomerulaarkimbu ja ctns-/-sebrafish Bowmani ruumi pindala. Leidsime, et ctns−/−sebrafishil tekkis glomerulaarne hüpertroofia, mis viitab hüperfiltratsioonile. Sebrakala puhul täheldatud kergeid glomerulaarkahjustusi võib seostada sebrakala taastumisvõimeganeerud, mis võimaldab lisada uusi nefroneid, samuti parandada olemasolevaid nefroneid [30].

Lisaks histoloogilisele kahjustusele on näidatud, et tsüstiini akumulatsioon aktiveerib proteiinkinaasi, mis käivitab apoptoosi PTEC-s[12]. Seega hindasime lõhustatud kaspaasi-3 ekspressiooni PTEC-s ja leidsime, et ctns−/−sebrafish näitas kaspaasi-3 ja tuuma fragmentatsiooni suurenemist. Lõhustatud kaspaas-3 leiti peamiselt rakkudes, mis akumuleerisid tsütoplasmaatilisi vakuoole, mis viitab sellele, et vigastatud PTEC-s toimub apoptoos. Üks täiendav mehhanism, mis võib seletada suurenenud apoptoosi, võib olla reaktiivsete hapnikuliikide olemasolu tsüstiini akumulatsiooniga seotud glutatiooni vähenemise tõttu [31]. Siiski on vaja täiendavaid uuringuid, et hinnata, kas see mehhanism esineb ka ctns−/−sebrafish puhul.

Kuigineerudon esimesed ja kõige rängemalt kahjustatud elundid,tsüstinooson multisüsteemne haigus, millesse on haaratud erinevad organid, nagu nahk, sugunäärmed, silmad ja lihased. Kirjandusest on teada, et tsüstinoosihaigetel on sageli naha enneaegne vananemine, blondid juuksed ja hele nahavärv [13]. Viimane fenotüüp on tingitud tsüstinoiini transporteri kaasamisest melaniini sünteesi reguleerimisse[32] ja tumedama pigmentatsiooni säilitamisest äsja avastatud tsüsteiini transporteri MFSD12 [33] kaudu. Põnevalt oli meie täiskasvanud ctns−/−sebrafish mudelil hüpopigmenteeritud ja täpiline nahamuster ning melaniini jaotus halvenenud, mida vastsete staadiumis ei täheldatud [10].

Lisaks,tsüstinoospõhjustab meestel viljatust, samas kui naised on teadaolevalt viljakad [14]. Värskeimad andmed viitavad sellele, et viljatus võib olla tingitud progresseeruvast munandite degeneratsioonist, mis põhjustab sperma kvaliteedi muutumist, või obstruktsioonist meeste eritussüsteemi määratlemata osas. Ummistunud struktuurid võivad mõjutada sperma kvaliteeti, eriti piirkondades, kus kanalid on väga väikese läbimõõduga, näiteks retetestis[16]. Insebrafil, spermatosoidid on geeniprotsessis väga sarnased imetajatega; üks peamisi erinevusi on aga see, et tsüstides toimub spermatogenees [34]. Meie uuringus avastasime ctns−/−sebrafish’i spermatogeenses tsüstis suurenenud spermatosoidide arvu, kuid me ei leidnud märke munandite degeneratsioonist. Seetõttu võib kirjeldatud fenotüüp viidata obstruktsioonile munandite tasemel, mis põhjustab spermatosoidide vähem vabanemist keskkonda, kuid selle hüpoteesi kinnitamiseks on vaja täiendavaid uuringuid. Funktsionaalsel tasemel näib, et vähenenud munade arv ja vähenenud viljastatud munade arv peegeldab ctns−/−sebrafish viljakuse halvenemist.

Teine kliiniline ilmingtsüstinoos, mis tavaliselt mõjutab patsiente alates teisest elukümnendist, on müopaatia, mida iseloomustab lihaste kurnatus ja nõrkus [1]. Huvitaval kombel avastasime, et ctns-/-täiskasvanud sebrakalal on kontrollrühmaga võrreldes vähenenud lokomotoorne aktiivsus, mis viitab lihaste funktsiooni halvenemisele. Tuleb märkida, et seda fenotüüpi vastsetel ei esinenud [10], mis viitab sellele, et see mõjutab ctns−/−sebrafish haiguse hilisemas staadiumis. Sellest hoolimata ei tuvastatud lihastes nähtavaid histoloogilisi erinevusi. Lokomotoorse aktiivsuse vähenemine võib olla tingitud mitokondriaalsest düsfunktsioonist, mida rutiinsete histoloogiliste uuringute abil ei õnnestunud tuvastada [35–37]. Seega vajab tsüstinoosi sebrakala mitokondrite põhjalik iseloomustus täiendavat hindamist.

Lisaks ülalmainitud fenotüüpidele on mitmed uuringud näidanud, et tsüstinoosihaigetel ilmnevad ka silma sümptomid, nagu valgusfoobia ja blefarospasm [1], kusjuures sarvkest on üks silma enim mõjutatud osi, mille tulemuseks on tsüstiinikristallide kuhjumine ja paksuse suurenemine [20]. Sarvkesta suurenenud paksuse põhjuste kohta on aga vähe teada. Näiteks oletati, et kirjeldatud fenotüüp on tingitud epiteeli- ja/või endoteelirakkude subkliinilisest düsfunktsioonist, mis põhjustab tostromaledeemi[20]. Meie uuringus avastasime, et ctns−/−adultzebrafish displei suurenemine on sarvkesta stromaalse kihi paksus, mis näitab, et meie mudelil on sarvkesta düsfunktsiooni tunnused.tsüstinoos.

Cistanche eestneerudfunktsiooni

Üks peamisi lünki, millest tuleb igakülgseks arusaamiseks täitatsüstinooson loommudeli puudumine, mis kirjeldaks täielikult inimese haigust. On välja töötatud mitu hiiremudelit, mis näitavad tsüstiini akumuleerumist, kuid ei suuda täielikult reprodutseeridaneeru-fenotüüp [8,26]. Täpsemalt, C57BL/6 hiirel esines tsüstiini akumuleerumine mitmes elundis, mis suureneb koos vanusega [8]. Lisaks näitab C57BL/6 hiiremudel proksimaalseid torukujulisi kahjustusi alates 6. elukuust. Samamoodi süvenevad meie mudelis proksimaalsed torukujulised kahjustused aja jooksul. Kuid glomerulaarsel tasemel oli C57BL / 6 hiiremudel normaalne fenotüüp, samas kui meie täiskasvanud sebrakala mudel näitab glomerulaarset hüpertroofiat. Lisaks ei suuda hiiremudel C57BL/6 jäljendada inimestel täheldatud viljakuse langust, samas kui ctns-/-sebrafish mudelil on spermatogeensed tsüstid, mis on rikastatud spermatosoididega ja vähenenud munarakkude tootmine. Silmade tasandil näitavad nii hiire[38] kui ka sebrakala mudelid silmahäireid. Vastupidi, naha tasandil ei näita see hiiremudel häiritud melatoniini tootmist [8], mis ilmneb täiskasvanud sebrakala mudelis hüpopigmenteerunud nahamustrina. Lõpuks, käitumuslikul tasandil näitab meie ctns−/− sebrafimudel vähenenud liikumisaktiivsust, mis võib olla tingitud mitokondriaalse funktsiooni kahjustusest või suurenenud kehakaalu teisest mõjust.tsüstinoossebrakala. Üldiselt tundub, et meie ctns−/− sebrakala mudel kirjeldab paremini inimese haigust. Hiljuti Shimizu et al. tuvastas roti tüves uudse kongeense Ctnsugli mutatsioonineeru-kahjustused ja tsüstiini kristallid lüsosoomidesneerudajukoor [7]. Mudeli täpsem iseloomustus on aga veel puudu. Seetõttu on tungiv vajadus välja töötada ja iseloomustada uusi funktsionaalseid mudeleid, mis võtaksid kokku inimese haigused.

Kokkuvõtteks näitasime, et meie täiskasvanud ctns−/− sebrakala mudel reprodutseerib mitut inimese tsüstiini liivakasti fenotüüpi, mis võib olla kasulik haiguse patogeneesi uurimiseks täiskasvanutel ja uudsete ravimite pikaajaliste mõjude testimiseks neerude ja väliste kudede korrigeerimiseks.neeru-ilmingud.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Sebrakalade hooldus ja aretamine

Sebrakala käideldi ja hooldati vastavalt KU Leuveni loomade heaolu eeskirjadele (Eetiline kinnitus nr 142/2019). Sellesse uuringusse kaasasime 18 kuu vanused ctns−/−sebrafishi ja mõlemast soost metsikut tüüpi kontrollsebrakala. Ctns−/−zebrafish genereerimise üksikasju kirjeldati meie eelmises uuringus [10].

4.2. Tsüstiini mõõtmine

Tsüstiinitaset mõõdeti sebrakalal (metsiktüüpi isaskala,n=3ja ctns−/−isaskala, n=3) ja kogus väljendati ühikutes nmol/mg valke. Esmalt ohverdati sebrakala, sukeldades neid trikaiinmetaansulfonaati MS-222 (300 mg/L), seejärel töödeldi koeproove ultraheliga 200 µl 5 mM N-etüülmaleimiidi (NEM, Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), maksimaalselt 200 mg koe iga lüsaadi kohta. Seejärel lisati igale homogenaadile 100 µl 12-protsendilist sulfosalitsüülhapet (SSA) ja proove tsentrifuugiti 12,{15}} g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Tsüstiini sisaldavaid supernatante hoiti kuni analüüsimiseni temperatuuril -80 °C, samal ajal kui pelletid lahustati üleöö temperatuuril 4 °C 300 µl 0,1 M NaOH-s ja hoiti temperatuuril -80 °C kuni valgu mõõtmiseni Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit abil. Seejärel normaliseeriti tsüstiini kogus (nmol) iga proovi valgu kogusele (mg). Järgmisena lisati 50 µl tsüstiini sisaldavat supernatanti 50 µL sisestandardi lahusega (Cystine d6) ja segati 5 sekundit keerisega; seejärel ekstraheeriti segu 200 µL atsetonitriiliga, segati vorteksiga 30 sekundit ja seejärel tsentrifuugiti 16,000 g juures 9 minutit. Vedelikkromatograafia ja massispektromeetria analüüs viidi läbi UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technology, Santa Clara, CA, USA) abil, mis oli varustatud ESI-JET-STREAM allikaga, mis töötab positiivsete ioonide (ESI pluss) režiimis. Selle seadme juhtimiseks ja andmete analüüsimiseks kasutatud tarkvara oli MassHunter (tööjaam Agilent Technologies, Barcelona, ​​Hispaania). Kasutatud eralduskolonniks oli InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 × 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoksüliini ja eosiini ning perioodilise happe-nihkega värvimine

Sebrakala (metsikut tüüpi emakala, n=3; metsikut tüüpi isaskala, n=3; ctns−/−emane kala, n=3; ctns−/−isane kala, n=3) ohverdati sukeldamisega trikaiinmetaansulfonaati MS-222 (300 mg/L), seejärel fikseeriti kogu sebrakala 4% puhverdatud paraformaldehüüdis (4% PFA) temperatuuril 4 ◦C 1 nädala jooksul. . Pärast kahekordset PBS-ga pesemist viidi sebrakala veel üheks nädalaks katlakivi eemaldamiseks EDTA lahusesse (100 mM, pH=8), millele järgnes lisamine parafiini. Leicamikrotoomis (LeicaBiosystems, Wetzlar, Saksamaa) lõigatud (4- µm paksusega) parafiini sisseehitatud sebrakala kude. Sektsioonid värviti H&E ja PAS-iga vastavalt standardprotokollidele.

Sebrakala (metsiktüüpi emaskalad, n=3ja ctns-/-emaskalad, n=3) histoloogiliste uuringute jaoks eemaldati silmad tuumast ja fikseeriti 4-protsendilises PFA-s toatemperatuuril 4 tundi. Optimaalse lõiketemperatuuriga söötmesse (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Jaapan) tehti 10-µm krüolõiked (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokyo, Jaapan). Sektsioonid värviti H&E-ga vastavalt standardprotokollidele. Pildid tehti Leica ereda välja mikroskoobiga (Leica DM6, Wetzlar, Saksamaa).

4.4. Immunohistokeemia (lõhustatud kaspaasiga värvimine{2}})

Värskelt lõigatud sebrakala koega lõigud deparafineeriti ja rehüdreeriti. Sektsioonid allutati kuumuse poolt indutseeritud antigeeni otsimisele, kasutades 10 mM tsitraatpuhvrit (pH=6). Pärast blokeerimist 5% normaalse kitse seerumiga (NGS) dPBS-s inkubeeriti sektsioone küüliku lõhustumisvastase kaspaasiga-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, lahjendus 1:200), millele järgnes küülikuvastane aine. -Envision, HRP-märgistatud sekundaarne antikeha (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Negatiivse kontrollina kasutati tavalist küüliku seerumit. Kromogeenina kasutati diaminobensidiini (DAB, DAKO, Glostrup, Taani). Seejärel värviti sektsioonid H&E-ga, kuivatati ja paigaldati.

Neeruhaiguse ravi: Cistanche

4.5. Toluidiini sinine värvimine ja TEM

Sebrakalaneeru-koed (metsiktüüpi isane sebrakala, n=3 ja ctns−/−isane sebrakala, n=3) koguti ja fikseeriti EM-fikseerimispuhvris (1,5% glutaaraldehüüdi / 1% paraformaldehüüdi jaoks) . Seejärel fikseeriti neerukuded 2,5% glutaaraldehüüdi/1,2% akroleiiniga fikseerimispuhvris (0,1 mol/L kakodülaate, 0,1 mol/L sahharoosi, pH 7,4) ja 1 protsenti osmiumtetroksiidi ja sisestatud vaigule. Poolõhukesed lõigud (paksus 0.5-µm) värviti toluidiinsinisega. Üliõhukesed lõigud värviti uranüülatsetaadiga. Pildid koguti erinevate suurendustega JEM-1200 EX transmissioonelektronmikroskoopia abil (JEOL Ltd, Tokyo, Jaapan).

4.6. Digitaalne pildianalüüs

Värvitud slaidid digiteeriti Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA abil (Philips, Eindhoven, Holland)

4.6.1. Glomerulaarse hüpertroofia analüüs

Sebrakala glomerulaarse hüpertroofia analüüsimiseks mõõdeti PAS-värvitud objektiklaasidel Bowmani kapsli pindala (µm2), Bowmani ruumi ja glomerulaartufi. Kaasati kõik saadaolevad glomerulid sektsiooni kohta ja mõõdeti ImageJ tarkvara abil. Statistilise analüüsi jaoks kasutati iga sebrakala mõõtmiste keskmist.

4.6.2. Lõhustatud kaspaasi-3 ekspressioonianalüüs

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 protsenti positiivne värvumine). Statistilise analüüsi jaoks kasutati iga sebrakala skoori keskmist.

4.6.3. Sarvkesta stroomi analüüsi paksus

Sebrakala sarvkesta stroomi paksust (10-kordne suurendus) mõõdeti samadel kaugustel silma keskpunktist, kasutades sebrakala ImageJ tarkvara. Iga pildi jaoks tehti n=7 mõõtmist silma osa erinevates kohtades (kesk-, kesk-, perifeeria) piki sarvkesta intervalliga 100 µM. Statistilise analüüsi jaoks kasutati mõõtmiste keskmist.

4.7. Viljakuse uuring

Viljakust hinnati emase ja isase sebrakala paaritumise teel (metsiktüüpi isaskala, n=4 ja metsikut tüüpi emaskala, n=6 ja ctns−/−isaskala, n=4 ja ctns−/−emane kala, n=6) kudemisalusel. Järgmisel hommikul, tund pärast valgust, koguti embrüod ja registreeriti toodetud munade koguarv. Viljastunud munad sõeluti ja loendati valgusmikroskoopia abil viljatutest. Aretust viidi läbi n=7 korda nädalas järjest. Välja jäeti kaks katset, mille tulemuseks ei olnud samaaegselt munatootmine nii metsiktüüpi kui ka ctns−/−sebrakala puhul.

4.8. Liikumistegevus

Sebrakala (metsikut tüüpi emakala, n=6; metsikut tüüpi isaskala, n=6; ctns−/−emane kala, n=6; ctns−/−isane kala, n=6) paigutati tavalistesse eluruumidesse ja pärast 5-minutilist kohanemisaega filmiti 5 minutit. Video salvestati paagi peale asetatud GoPro® HERO 7 abil, pakkudes seega pealtvaadet ujuvatest kaladest. Eraldusvõime ja kaadrisagedus määrati vastavalt 1080 p (1920 × 1080) ja 30 kaadrit sekundis. Videoid analüüsiti rakendusega IDTracker.aitrajektoore jälgides kogu katse vältel. Seejärel analüüsiti trajektoore kohandatud pythoni koodiga, et tuletada iga rühma keskmine liikumiskiirus (pikslit sekundis) [39].

Cistanche-renaalne

4.9. Kehakaalu ja pikkuse mõõtmine

Sebrakala hävitati kastmisega 300 mg/loftricainemetaansulfonaati MS-222. Pärast välistele stiimulitele reageerimise puudumise kontrollimist asetati surmatud sebrakala paberrätikule ja kuivatati. Eutaniseeritud sebrakala pikkust hinnati nihiku abil, mõõdeti suu otsast sabavarreni. Eutaniseeritud sebrakala kaalu hinnati analüütilise skaalaga.

4.10. Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi SPSS-i (IBM, New York, NY, USA) ja GraphpadPrismi (GraphPadSoftware, LaJolla) abil. Kahe rühma andmeid analüüsiti paaristamata t-testis koos Welchi parandusega, kahesuunaline. Kahe kategoorilise sõltumatu muutuja andmeid analüüsiti kahesuunalise ANOVA-ga Fisheri vähima olulise erinevuse (PLSD) testiga. Erinevusi p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

4.11. Viljakuse uuring

Metsiktüüpi ja ctns-/-sebrakala munatootmise määrade võrdlemiseks viidi läbi Poissoni regressioonianalüüs, kasutades üldistatud hinnangulisi võrrandeid tugevate standardvigadega, et võtta arvesse määrade korrelatsiooni katsetega. Koefitsientide pakkumise võrdlemiseks kasutati metsiktüüpi ja ctns−/−zebrafish vahelisi mune. Viidi läbi alogiline regressioonianalüüs, kasutades üldistatud hindamisvõrrandeid koos tugevate standardvigadega, et võtta arvesse koefitsientide korrelatsiooni katsetes.

Täiendavad materjalid: järgmised on veebis saadaval aadressil https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22179398/s1.

Autori kaastööd: Conceptualization, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metoodika, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; tarkvara SPB, JH, LDG, HT, TN; valideerimine, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB ja EL; formaalne analüüs, SPB, JH, LDG, HT, TN; uurimine, LvdH, HJB, EL; ressursid, HJB ja EL; andmete kureerimine, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; kirjutamine - algse eelnõu ettevalmistamine SPB, JH; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, LvdH, HJB, EL; visualiseerimine, LvdH, HJB, EL; järelevalve, PdW, LvdH, HJB, EL; projektihaldus, LvdH, HJB, EL; rahastamise omandamine, HJB, EL Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine: autorid sooviksid tunnustada KULeuvenC1GranttoE.L-i sisemist raha. (C14/17/113), Hiina stipendiuminõukogu toetus JH-le (CSC n◦ 201508500109) ja FWO järeldoktorantuuri stipendium LDG-le (12I3820N).

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus: Uuring viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsiooni juhistele ja selle kiitis heaks KU Leuveni eetikakomitee nr 142/2019. Tänuavaldused: Täname: Didier Cagnini aju histoloogia hindamise eest nii ctns−/− kui ka metsiktüüpi sebrakala puhul, KathleeenLambaertsi, FrédéricHendrickx ja KimvanKelsti pideva toetuse ja abi eest KU Leuveni veekeskuses, Peter Neessi tehnilise toe eest. TEM ja Ron Wolterbeek statistilise analüüsi jaoks.

Huvide konflikt: autorid deklareerivad huvide konflikti. Rahastajad ei osalenud uuringu kavandamisel; andmete kogumisel, analüüsimisel või tõlgendamisel; käsikirja kirjutamisel või tulemuste avaldamise otsuses.

Viited

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtšenko, E. Tsüstinoos: ülevaade. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; et al. Heptaheliline valk PQLC2 on lüsosomaalne katioonsete aminohapete eksportija, mis on tsüsteamiini toime alusekstsüstinoosteraapia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtšenko, EN Nefropaatilise tsüstinoosi prognoosi parandamine. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Külaline, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; et al. Tsüsteamiinravi aeglustab nefropaatilise tsüstinoosi progresseerumist hilistel noorukitel ja täiskasvanutel. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Tsüsteamiinravi: tsüstinoosi ravi, mitte ravi. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtšenko, E. Tsüstinoosi molekulaarne alus: geograafiline jaotus, CTNS-geeni mutatsioonide funktsionaalsed tagajärjed ja parandamise potentsiaal. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Ctns geeni deletsioon põhjustab neerutuubulite düsfunktsiooni ja tsüstiini kuhjumist LEA/Tohmi rottidel. Mamm. Genoom 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Neeru fenotüüptsüstinooshiire mudel sõltub geneetilisest taustast. Nephrol. Helista. Siirdamine 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtšenko, EN GeneetilineNeerudHaigused: sebrakala mudelite esilekerkiv roll. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Tsüstinoos(ctns)sebrafishmutandid näitavad pronefrilist glomerulaati ja torukeste düsfunktsiooni. Sci. Vabariik 2017, 7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDANeerupatoloogia klass:Tsüstinoos. Olen. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Juunius, S.; Thoene, JG Suurenenud apoptoos tsüstinootilistes fibroblastides janeeru-proksimaalsed tuubulite epiteelirakud tulenevad proteiinkinaas C delta tsüsteinüülimisest. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; et al. Suurenenud sisemine naha vananemine nefropaatilise tsüstinoosi korral, hinnatud kõrglahutusega optilise koherentsustomograafia abil. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Tsüsteamiiniga ravitud meessoost tsüstinoosipatsientide viljakus. Viljakas. Steriilne. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtšenko, EN Esimene edukas viljastumine meessoost tsüstinoosipatsiendi poolt. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Munandite funktsioon infantiilse nefropaatilise tsüstinoosiga meestel. Humm. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Tsüstinoosiga naiste rasedus. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Idiopaatiline intrakraniaalne hüpertensioon tsüstinoosi korral. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Stromaalse kollageeni potentsiaalne roll tsüstiini kristalliseerumisel tsüstinoosiga patsientidel. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Sarvkesta paksus nefropaatilise tsüstinoosi korral. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Tsüstinoos: ravitava haiguse areng. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Pikaajalise tsüsteamiinravi mõju patsientideletsüstinoos. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) vananemise ja treeningu uurimise mudelina: Füüsiline võimekus ja treenitavus vähenevad koos vanusega. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Kahe sebrakala (Danio rerio) tüve eluiga ja vananevad fenotüübid. Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Lüsosoomide biogenees ja lüsosoomimembraani valgud: Trafficking meets function. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; et al. Intralüsosomaalne tsüstiini akumuleerumine hiirtel, kellel puudub tsüstinoos, valk, millel on tsüstinoosi puudus. Mol. Kamber. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Dediferentseerumine ja endolüsosomaalse sektsiooni aberratsioonid iseloomustavad nefropaatilise tsüstinoosi varajast staadiumi. Humm. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Mõned abistavad hüaliinpiiskade nefropaatia histoloogilist äratundmist üheksakümnepäevastes toksilisuse uuringutes. Toksikool. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Tsüstiini intratsellulaarne jaotumine tsüstiiniga koormatud proksimaalsetes tuubulites. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Sebrakala kasutamine podotsüütide geneesi uurimiseks neerude arengu ja regenereerimise ajal. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lüsosomaalne tsüstiini akumulatsioon soodustab mitokondriaalset depolarisatsiooni ja redoks-tundlike geenide esilekutsumist inimese neeru proksimaalsetes tubulaarsetes rakkudes. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Vestlus, P.; et al. Tsüstinosiin on melanosomaalne valk, mis reguleerib melaniini sünteesi. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12vahendab tsüsteiini importi melanosoomidesse ja lüsosoomidesse. Loodus 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Sebrakala (Danio rerio) spermatogeneesi histoloogiline ja stereoloogiline hindamine, rõhuasetusega spermatogoonilistele põlvkondadele. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Ebanormaalne mitokondriaalne autofagia nefropaatiastsüstinoos. Autofagia 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Ebatüüpilise mitokondriaalse tsüklilise AMP taseme mõju nefropaatilise tsüstinoosi korral. Kamber. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polištšuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polištšuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude mitokondrite dünaamika nefropaatilise tsüstinoosiga. Int. J. Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et al. Tsüstinoosi loomamudeli silmaanomaaliad jäljendavad haiguse patogeneesi. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavija, GG idtracker.ai: kõigi üksikisikute jälgimine väikestes või suurtes märgistamata loomade kollektiivides. Nat. Meetodid 2019, 16, 179–182. [CrossRef]