Hiljutised edusammud puugiantigeenide avastamisel ja puugivastase vaktsiini väljatöötamisel, 1. osa

Abstraktne:

Puugid võivad tõsiselt mõjutada inimeste ja loomade tervist kogu maailmas, põhjustades igal aastal märkimisväärset majanduslikku kahju. Puukide tõrjeks kasutatakse laialdaselt keemilisi akaritsiide, mis mõjutavad keskkonda negatiivselt ja põhjustavad akaritsiididele vastupidavate puugipopulatsioonide teket. Vaktsiini peetakse üheks parimaks alternatiivseks vahendiks puukide ja puukide kaudu levivate haiguste tõrjeks, kuna see on odavam ja tõhusam kui keemiline tõrje. Paljud antigeenipõhised vaktsiinid on välja töötatud transkriptoomika, genoomika ja proteoomiliste tehnikate praeguste edusammude tulemusena.

Mõned neist (nt Gavac® ja TickGARD®) on kaubanduslikult saadaval ja neid kasutatakse tavaliselt erinevates riikides. Lisaks uuritakse märkimisväärset hulka uudseid antigeene uute puugivastaste vaktsiinide väljatöötamise perspektiivis.

Uute ja tõhusamate antigeenipõhiste vaktsiinide väljatöötamiseks, sealhulgas erinevate epitoopide tõhususe hindamiseks erinevate puugiliikide vastu, on aga vaja rohkem uuringuid, et kinnitada nende ristreaktiivsust ja kõrget immunogeensust. Selles ülevaates käsitleme hiljutisi edusamme antigeenipõhiste (traditsiooniliste ja RNA-põhiste) vaktsiinide väljatöötamisel ning anname lühikese ülevaate uudsete antigeenide hiljutistest avastustest koos nende allikate, omaduste ja nende testimiseks kasutatud meetoditega. tõhusust.

Antigeenid on ained, mis võivad põhjustada immuunvastust, sealhulgas bakterid, viirused, rakud jne. Immuunsus on organismi võime reageerida välistele antigeenidele, sealhulgas kaasasündinud immuunsusele ja omandatud immuunsusele. Antigeenide ja immuunsuse vaheline seos on tihe ning immuunsus suudab antigeene ära tunda ja rünnata, kaitstes seeläbi keha haiguste eest. Näiteks kui inimkeha puutub kokku teatud patogeeniga, tunneb immuunsüsteem selle antigeeni ära ja toodab selle ründamiseks antikehi, et haigust vältida. Seetõttu on antigeenide ja immuunsuse koosmõju hea tervise säilitamise oluline mehhanism. Seega peame sellest vaatenurgast oma igapäevaelus tähelepanu pöörama oma immuunsuse parandamisele. Cistanche mõjutab oluliselt immuunsust. Cistanche on rikas mitmesuguste antioksüdantsete ainete poolest, nagu C-vitamiin, C-vitamiin, karotenoidid jne. Need koostisosad võivad eemaldada vabu radikaale, vähendada oksüdatiivset stressi ja parandada immuunsüsteemi vastupanuvõimet.

Klõpsake cistanche deserticola toidulisandit

Märksõnad:

vaktsinoomika; antigeeni kandidaadid; puugivastane vaktsiin; puugikontroll.

1. Sissejuhatus

Puugid on ektoparasiidid, mis nakatavad inimesi ja loomi ning põhjustavad märkimisväärset majanduslikku kahju. Need on sääskede järel tähtsuselt teisel kohal haiguste leviku vektorid inimestel [1,2]. Nad on ka üks olulisemaid vektoreid selliste haiguste edasikandmisel, mis mõjutavad ülemaailmset veisetööstust ja lemmikloomi [3–5]. Puukidel on vähe looduslikke vaenlasi, mistõttu on puukide nakatumise kontrollimine keeruline. Keemilised akaritsiidid on olnud vaid osaliselt tõhusad, millel on mitmeid mittesihtotstarbelisi puudusi, sealhulgas akaritsiididele vastupidavate puukide valik ning keskkonna ja loomsete saaduste saastumine kemikaalide jääkidega [6].

Lisaks kasutatakse erinevates riikides puukide kaudu levivate haiguste tõrjeks mõningaid antigeenipõhiseid vaktsiine; Siiski on vaja uusi ja tõhusamaid lähenemisviise, sealhulgas uute vaktsiinide väljatöötamist, mis on suunatud puukide nakatumise ja patogeenidega nakatumise vastu [7, 8].

Traditsiooniliselt on põhimõte „isoleeri – inaktiveeri – süsti” mänginud olulist rolli parasiitide/patogeenide tõrjeks mõeldud vaktsiini väljatöötamisel ja väljatöötamisel. Esimese põlvkonna vaktsiinid koosnesid elus, nõrgestatud või surmatud patogeenidest. Teise põlvkonna vaktsiinid koosnesid puhastatud parasiidi/patogeeni komponentidest ja töötati välja rakukultuuri, polüsahhariidide keemia, rekombinantse DNA tehnoloogia ja immunoloogia edusammude tulemusena [9,10]. Genoomika ja muu "oomika" areng viimase kahe aastakümne jooksul on toonud kaasa "kolmanda põlvkonna" vaktsiinide väljatöötamise, mis põhinevad sellistel tehnoloogiatel nagu funktsionaalne oomika, pöördvaktsinoloogia ja süsteemibioloogia lähenemisviis.

Tavapäraste vaktsiinide väljatöötamise lähenemisviiside piirangute ületamiseks on vaktsiinide väljatöötamine muutunud rohkem kohandatud, keskendudes antigeeniosadele, mis on suunatud kaitsvate immuunvastuste poolt [11, 12], võttes arvesse patogeeni ja selle interaktsiooni peremehe immuunsüsteem [13]. Seetõttu toetub kaasaegne vaktsiinoloogia üha enam uudsetele oomikatele, mis kasutavad suure läbilaskevõimega tipptehnoloogiaid, nagu genoomika, transkriptoomika ja proteoomika, ning põhiimmunoloogia, peremeespatogeeni bioloogia, immunoomika, arenenud bioinformaatika, arvutusliku modelleerimise ja täiustatud edusamme. mõistmist ja tehnoloogilisi uuendusi.

Võrreldes kemikaalide kasutamisega on vaktsineerimine mõistlik valik, kuna puukide nakatumise tõrje on keskkonnasõbralik ja kuluefektiivne [12,14]. Kuigi vaktsineerimine on ratsionaalne strateegia puukide nakatumise tõrjeks, on seni turule toodud vaid mõned vaktsiinid, kusjuures ristreaktiivse immuunsuse esilekutsumine puugiliikide vastu on minimaalne [15].

Uute vaktsiinide väljatöötamiseks on ülioluline tuvastada ja iseloomustada uudsed antigeenikandidaadid, mis oleksid konserveeritumad ja suudaksid tekitada peremeesliikides ristreaktiivset immuunsust. Selle ülevaate eesmärk on anda ülevaade traditsioonilistest ja RNA-põhistest vaktsiinidest ja nende kasutamise võimalustest ning uudsetest antigeenidest, mida on võimalik ära kasutada vaktsiini väljatöötamisel paljutõotavate antigeenikandidaatidena.

2. Antigeenide identifitseerimine: puugivastase vaktsiini väljatöötamise teekaart

Antigeenide tuvastamine on puugivastase vaktsiini väljatöötamiseks ülimalt oluline. On ülioluline mõista molekulaarseid mehhanisme, mis on seotud peremees-parasiidi-patogeeni interaktsioonidega, et tuvastada antigeeni kandidaadid, mis tõenäoliselt toimivad vaktsiini väljatöötamise kandidaatidena/sihtmärkidena. Ideaalne antigeenikandidaat kutsub peremeesorganismis esile pikaajalise ja tõhusa immuunvastuse [16,17]. Pärast seda, kui Allen ja Humphreys avaldasid 1979. aastal oma leiud, on tehtud palju uuringuid, milles on kasutatud erinevaid antigeene, sealhulgas terveid puugihomogenaate ja siseorganeid, et kutsuda esile puugivastase immuunsuse erinev tase [16].

Alates Ixodes scapularisest, esimesest sekveneeritavast puugiliigist, on ilmnenud mitu uut võimalust puukide nakatumise eest kaitsvate antigeenide ennustamiseks, skriinimiseks ja tuvastamiseks [18]. Praegu on saadaval palju nukleotiidide ja valkude andmebaase erinevatest puukide kudedest ja arengufaasidest ning teada on palju erinevaid puuke mõjutavaid stiimuleid, nagu puukide toitmine või patogeenidega nakatumine [17,19].

Tõenäosus valida puukide nakatumise ja patogeenidega nakatumise tõrjeks puukidest pärinevaid kaitsvaid antigeeni kandidaate on samuti suurenenud tänu hiljutistele edusammudele oomikatehnoloogiates (st transkriptoomika, proteoomika ja metaboloomika) [20]. Lisaks on pöördvaktsinoloogia (RV) või vaktsiinoomika kasutamine võimaldanud avastada uusi vaktsiini antigeeni kandidaate [20].

Selle tulemusena on hinnatud sünteetilisi ja rekombinantseid valke ning näidatud, et need suudavad esile kutsuda teatud tasemel kaitsva immuunsuse. Selle jaotise eesmärk on arutleda erinevatest kudedest pärinevate antigeenikandidaatide üle, mis on identifitseeritud, hinnatud nende efektiivsuse osas ja mida peetakse potentsiaalseteks kandidaatideks puugivastase vaktsiini väljatöötamiseks, tuginedes olemasolevale kirjandusele (tabel 1 ja Joonis 1).

Joonis 1. Ülevaade puugivaktsiini antigeenide sihtmärkide jaotus- ja efektiivsuse hindamise skeemist puukide nakatumise ja puukide kaudu levivate haiguste ennetamiseks.

2.1. Munaga seotud antigeeni kandidaadid

Munakollane on puukide arengu oluline komponent, kuna see toimib erinevate valkude reservuaarina, mis mängivad nende lülijalgsete embrüonaalses arengus otsustavat rolli [21,22]. Nagu putukatel, sünteesitakse ka puukide rasvases kehas munakollase valke [21,23]. Munakollane laguneb munades leiduvate eri tüüpi ensüümide abil. Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) on näide munakollase proteinaasist, mis on eraldatud R. microplus'i munadest ja mille kohta on teatatud, et see osaleb puugi embrüogeneesi protsessis.

Eelkõige mängivad need ensüümid võtmerolli vitelliini, munakollase peamise valgulise komponendi, lagunemisel [21]. BYC eraldasid esmakordselt da Silva Vaz Jr jt. [24] R. microplus'i munadest ja seejärel inokuleeriti veistesse, et teha kindlaks selle roll peremeesorganismi immuunsuse esilekutsumisel. Leiti, et see ensüüm pakub osalist kaitset puukide eest ja käivitab veistel kaitsva immuunvastuse, kuid selle efektiivsus oli 14–36 protsenti. Järgnevas uuringus ekspresseeriti rekombinantset BYC valku prokarüootses ekspressioonisüsteemis (E. coli).

Huvitaval kombel näitas rekombinantne valk üldiselt kõrgemat efektiivsust (25,24 protsenti) võrreldes ensüümiga, mis eraldati otse munakollasest [25,26]. Selgus, et selle valgu efektiivsust võivad mõjutada mitmesugused tegurid, näiteks võib BYC valgu valmistamise meetod mõjutada valgu struktuuri ja lõpuks ka selle funktsioone. Lisaks võib see variatsioon olla seotud ka puugi tüve või muude katsetingimustega [24].

Vitelliin, lipoglükoproteiin, mis esineb sarnaselt teiste munakollaste valkudega ka munakollases, sünteesitakse lülijalgsete rasvakehades [27,28]. Puukide puhul on vitelliin või vitellogeniinid munade arengus ja munarakkudes üliolulised, nagu näitab kolme vitellogeniini geeni vaigistamine H. longicornis'es [29]. Vitellini valk puhastati puugimunadest kuue suure molekulmassiga (44–107 kDa) polüpeptiidi mittekovalentse kompleksina. Paralleelselt selle uuringuga eraldati ja puhastati R. microplus vastsetest 80 kDa glükoproteiin (GP80).

Seejärel inokuleeriti mõlemad valgud, et uurida nende efektiivsust. Vitellini ja GP80 vaktsineerimine näitas üldist 68-protsendilist efektiivsust, mis viitab sellele, et mõlemat antigeeni sisaldav vaktsiin võib esile kutsuda immuunvastuse ja pakkuda ka osalist kaitset R. microplus'e vastu lammastel [28].

Tähelepanuväärne on see, et kui rekombinantne hexahis-GP80 (HH-GP80), mis oli valesti volditud ja glükosüülimata, süstiti peremeesorganismi samades katsetingimustes, ei näidanud see mingit efektiivsust [28]. Ülaltoodud uuringu tulemuste põhjal näib, et vitelliini ja GP80 vaktsineerimine võib lammastel esile kutsuda immuunvastuse ja võib lambaid osaliselt kaitsta puugi B. micro plus eest. HH-GP80 õige voltimine on selle aktiivsuse jaoks ülioluline, kuna kaitsvad epitoobid on seotud valgu ja/või sellega seotud oligosahhariidide voltimisega ning need epitoobid on selle aktiivsuse jaoks olulised.

Vitellini lagundav tsüsteiini endopeptidaas (VTDCE) on teine ​​munaga seotud ensüüm, mille tuvastasid ja eraldasid Seixas et al. [30]. Sarnaselt BYC-ga ei sünteesita seda ensümaatilist valku R. microplusi munasarjas ja see on seotud vitelliini hüdrolüüsiga, pakkudes seeläbi toitaineid arenevatele embrüotele.

Siiski leiti, et mõlemad ensüümid reguleerivad vitelliini hüdrolüüsi erinevalt [30]. Sama uurimisrühm analüüsis hiljem puhastatud VTDCE valku antigeenina ja leidis, et see valk pakub ka osalist kaitset puukide vastu, kuna kariloomade immuniseerimine andis tulemuseks 21-protsendilise efektiivsuse ja 17,6-protsendilise vähenemise viljakate munade massis [31]. Munaga seotud valgud BYC ja VTDCE pakkusid peremeesorganismile piiratud kaitset puukide nakatumise eest ja seetõttu ei tundu need vaktsiinis üksinda kasutamisel sobivad antigeenikandidaadid.

2.2. Süljenäärmega seotud antigeeni kandidaadid

Puugid sisaldavad angiotensiini konverteeriva ensüümi sarnast valku, mis suudab kontrollida vererõhku, reguleerides vedeliku mahtu, sarnaselt imetajate angiotensiini konverteeriva ensüümiga [32,33]. See kontroll võimaldab puugil pidevalt toituda peremehe verest. Puugi B. micro plus süljenäärmed ja kesksool sisaldavad vähesel määral glükoproteiini, mille nimi on Bm91 [32]. Bm91 ei sisaldu praegu kaubanduslikes puugivastastes vaktsiinides, kuid seda peetakse puukide tõrje kandidaadiks [34]. Kui rekombinantset Bm91 valku hinnati üksinda looduslike puukide nakatumisega välitingimustes, valmistasid tulemused pettumust, kuna selle valgu efektiivsus oli vaid 6 protsenti, mis tundub puugitõrje vaktsiini väljatöötamiseks sobimatu [35].

Kui aga E. coli-s toodetud rekombinantne Bm91 valk kombineeriti Bm86-ga (antigeenikandidaat, mida kasutatakse kaubanduslikes vaktsiinides) ja seejärel kasutati seda valgukombinatsiooni vaktsiinina, olid tulemused palju lootustandvamad. , kuna Bm91 lisamine suurendas Bm86 antigeeni [33] efektiivsust, mis viitab sellele, et nende kahe valgu (Bm91 ja Bm86) kombinatsioon näib olevat tõhus strateegia uue antigeeni väljatöötamiseks. - puugivaktsiin.

Süljenäärmete transkriptoomilised ja diferentsiaalgeeniekspressiooni analüüsid on näidanud, et puukide (nt R. microplus ja Dermacentor andersoni) liikide genoom sisaldab valgujärjestust, mida nimetatakse flagelliformseks siidivalguks [36,37]. Diferentsiaalse geeniekspressiooni iseloomustus R. microplus'i süljenäärmetes vastuseks A. marginale'i infektsioonile tõi esile molekulaarsed mehhanismid, kuidas puuk patogeeniga suhtleb. Hilisemad funktsionaalsed uuringud on näidanud, et flagelliformne siidivalk (SILK) võib mängida olulist rolli A. marginale nakatumisel ja paljunemisel puukides. Puukidest ja patogeenidest pärinevate molekulide vaheline interaktsioon on seotud A. marginale paljunemisega süljenäärmerakkudes [36,38].

Pärast seda uuringut tehti ettepanek, et flagelliformne siidivalk võiks olla sobiv antigeenikandidaat vaktsiini väljatöötamiseks. Selleks on Merino et al. [14] tootis rekombinantset flagelliformset siidivalku ja analüüsis selle antigeenset aktiivsust, süstides seda veise peremeesorganismi. Leiti, et rekombinantne valk on suurepärane antigeenne kandidaat, kuna see kaitses veistel 62 protsenti puukide nakatumise ja puukide kaudu leviva infektsiooni (nt babesioosi) eest. Vaktsineerimine flagelliformse siidivalguga vähendas A. marginale paljunemist veistel. Antigeenispetsiifiliste antikehade tiitrid korreleerusid puukide nakatumise ja patogeeni nakatumise vähenemisega, mis näitab, et vaktsiini toime tuleneb antikeha vastusest.

Lisaks mõjutas geeni kodeerivate vaktsiiniantigeenide ekspressiooni veistel toituvates puukides vaktsineerimine ja kaasnakkus A. marginale ja B. bigeminaga. Seega näib, et vaktsiinid, mis kasutavad vektori ja patogeeni interaktsioonis osalevaid puugivalke, võivad olla tõhusad nii puukide nakatumise tõrjeks kui ka patogeeniga nakatumise ärahoidmiseks [14].

Salp15 on I. scapularis'e immuunsupressiivne süljevalk molekulmassiga 15 kDa, mis pärsib CD4 pluss T-rakkude aktivatsiooni, komplemendi aktiivsust, tsütokiinide tootmist ja dendriitrakkude funktsiooni peremeesorganismis [39–41]. Järgnevad uuringud uurisid Salp15 molekulaarset mehhanismi. Välispinna valku OspC toodab B. burgdorferi raku välispinnal. Spiroheetide (B. burgdorferi spirochetes) tootmine nakatunud puukide kesksooles algab siis, kui see toitub peremeesorganismi verest, mis seejärel peremeesorganismile transporditakse.

Süljenäärmetest väljumisel ja B. burgdorferi spiroheetide peremeesorganismile ülekandmisel interakteerub Salp15 füüsiliselt OspC-ga B. burgdorferi spiroheetide pinnal, mis hõlbustab spiroheetide ellujäämist, patogeeni ülekandumist ja peremeesorganismi nakatumist [38,42 ]. Salp15-OspC interaktsioon võib seega potentsiaalselt varjata OspC-d peremeesorganismi immuunvastuse eest, nii et spiroheet on immuunvastuse eest kaitstud [38]. Hiljuti kasutati Salp15 rekombinantse valgu sünteesimiseks Escherichia coli ekspressioonisüsteemi ja leiti, et süsteem on tõhus selle valgu tootmisel märkimisväärse saagisega ja hea lahustuvusega. Need Salp15 rekombinantse valgu omadused näitavad, et sellel on praktiline rakendus ja seda saab kasutada puugivastaste vaktsiinide loomiseks [41, 43, 44].

Metalloproteaasid (MP) on multifunktsionaalsed valgud, mis osalevad elusorganismide paljudes keerulistes füsioloogilistes ja patoloogilistes protsessides [45]. Erinevatel puugiliikidel on tuvastatud mitu MP-d ja neid peetakse puukide verejahuga seotud funktsioonide säilitamiseks otsustava tähtsusega [46–49]. Näiteks sisaldavad ixodid-puukide süljenäärmed MP-sid, mida peetakse elutähtsate füsioloogiliste funktsioonide peamisteks bioaktiivseteks komponentideks ja mida seetõttu peetakse nende ektoparasiitide vastu võitlemise tõrjestrateegiate potentsiaalseteks sihtmärkideks [49]. MP-de antigeense potentsiaali hindamiseks uurisid Ali et al. (2015) [50] amplifitseerisid R. micro plus MP-d kodeeriva järjestuse fragmenti, ekspresseerisid seda rekombinantse valguna ja kasutasid selle valgu puhastatud vormi R. microplusi vastase vaktsiini antigeenina veistel [50]. Rekombinantse R. micro plus MP valgu üldine efektiivsus oli 60 protsenti.

Lisaks vähendas see toitvate puukide arvu, toodetud munade arvu ja koorunud munade arvu, muutes [41] selle ideaalseks kandidaadiks puugivastase vaktsiini väljatöötamiseks [50]. R. microplusi sobivate antigeenikandidaatide edasiseks uurimiseks on Maruyama et al. [51] viisid läbi RNA-seq uuringu süljenäärmetega kõigis R. microplus'i toitumisetappides ja tuvastasid transkriptoomi fragmendi, mis sarnanes MP-ga (Rm239) koos kolme teise geeniga, sealhulgas Rm39, Rm76 ja Rm180. . Nende valkude kasutamine vaktsiinidena näitas, et need kõik võivad pärssida hemostaatilisi reaktsioone, pärssida peremeesorganismi antikehareaktsioone ja vähendada puugi võimet glütsiinirikka tsemendivalgu abil peremeesorganismiga seonduda.

Seetõttu töötasid autorid välja mitmekomponendilise puugivastase vaktsiini, kasutades neid nelja erinevat tüüpi valku [51]. Veiste immuniseerimine selle mitmekomponendilise vaktsiiniga vähendas R. microplus'i nakatumist 73,2 protsenti, mis näitab, et mitme antigeeniga puugivastase vaktsiini koostis võib olla tõhusam kui ühekomponendilised vaktsiinid [51].

Ribosoomid, mida nimetatakse ka valguvabrikuteks, on kõigi elusorganismide komponendid. On näidatud, et ribosomaalne valk P{{0}} mängib keskset rolli ribosoomide translatsioonilise aktiivsuse reguleerimisel ja aitab organismil kohandada oma ainevahetust erinevate keskkonnatingimustega. See kuulub happeliste valkude rühma, mis moodustavad ribosoomi suurimas ribosoomi subühikus varretaolise struktuuri [52]. On tõendeid, mis näitavad, et puugi sülg sisaldab ribosomaalseid valke, mis mängivad rolli peremeesorganismi kaitsemehhanismidest kõrvalehoidmisel [53–55]. Hiljuti teatati, et rekombinantse ribosomaalse valguga P0 vaktsineeritud küülikutel ilmnes tugev humoraalne reaktsioon, mis peamiselt vähendas nümfi sulamist ja emaste paljunemist. Valk kaitses 57,5 ​​protsenti O. erraticus'e nakatumise eest, kuid ei andnud ristkaitset Aafrika puugi Ornithodoros moubata nakatumise eest [56].

Teises uuringus sünteesisid teadlased keemiliselt 20 aminohappest koosneva peptiidi, mis saadi Rhipicephalus puukide ribosomaalsest P0 valgust, ja konjugeerisid selle edukalt KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) valguga. Megathura crenulate toimib antigeenina R. microplus'e vastu, mis näitab 96-protsendilist efektiivsust veistel [57]. Selles uuringus näitasid tulemused, et KLH-ga konjugeeritud P0 on suurepärane vaktsiin. Sellise vaktsiini valmistamine on aga kallis ja seetõttu ei pruugi see olla kariloomade jaoks kulutõhus. Seetõttu on oluline viia läbi täiendavaid uuringuid antigeense vaktsiini rekombinantse tootmise kohta, et hinnata selle tõhusust ja muuta selle tootmine majanduslikult elujõulisemaks.

Seriinproteaasi inhibiitorid: katsed eraldada antigeene puugiliikidest on tuvastanud mõned seriinproteaasi inhibiitorid (serpiinid), millel on antigeenivõime. Serpiinid osalevad loomadel, eriti veistel, mitmesugustes füsioloogilistes tegevustes, kus nad mõjutavad vere hüübimist, muutes protrombiini aega ja aktiveerides osaliselt tromboplastiini aega [58–60]. Serpiinid häirivad puukide immuunsüsteemi ja hõlbustavad seeläbi nende parasiitide esialgset toitumisprotsessi [61]. Andreotti jt. [62] eraldas ja tuvastas vastsete ekstraktidest R. micro pluss trüpsiini inhibiitorid (BmTI).

Selle antigeense aktiivsuse hindamiseks vaktsineeriti ristandveiseid BmTI-ga, mis leiti häirivat leukotsüütide migratsiooni vastsete fikseerimise kohas [63, 64]. Vasikate vaktsineerimine BmTI antigeenidega vähendas märgatavalt emaste puukide arvu ja kaalu, mille tulemuseks oli 72,8-protsendiline efektiivsus R. microplus'e vastu. Need andmed viitasid sellele, et BmTI immuniseerimine võib toimida vastsete arengu varases faasis [65]. Uurimaks, kas kärbitud BmTI võib samuti indutseerida immuniseerimist, sünteesiti BmTI N-terminaalne fragment, mis näitas veistel madalamat efektiivsust (18,4 protsenti) võrreldes täispika valguga.

Seega ei piisa N-terminaalse domeeniga immuniseerimisest BmTI-de mõju parandamiseks peremees-parasiitide interaktsioonidele [64]. Samamoodi, kui vaktsiinikatsena kasutati rekombinantseid R. microplus larvae trüpsiini inhibiitoreid (rRmLTI-sid), oli efektiivsus (32 protsenti) taas madal, mis viitab sellele, et nii kärbitud kui ka terve rekombinantne valk on vähem tõhusad, tõenäoliselt vaktsiini puudumise tõttu. valgu täpne voltimine in vitro. Üldiselt näitavad need tulemused, et trüpsiini inhibiitorid tunduvad sobivad kandidaadid tõhusa vaktsiini tootmiseks; nende suuremahulise tootmise meetodit tuleb aga täiustada, et suurendada nende tõhusust [66]. Erinevate puugiliikide, sealhulgas Amblyomma americanum (AAS19), Haemaphysalis longicornis (HLS2), Rhipicephalus (Boophilus) microplus, jne võimalike puugivastase vaktsiini kandidaatidena on hinnatud mitmesuguseid teisi serpiine. Kõik need serpiinid näitasid peremehele osalist kaitset; kaitsetase võib aga erineda olenevalt puugiliigist ja siku tüübist [67–69].

Ühe või mitme puugi valkude ühendamine üheks polüpeptiidahelaks on atraktiivne puugivastane vaktsineerimisstrateegia. Seetõttu saab trüpsiini inhibiitoreid/või serpiine kombineerituna teiste puugivalkude immunogeensete fragmentidega kasutada mitme antigeeni konstruktidena. Näiteks sünteesiti kimäärne valk, mis sisaldas molekulaarse adjuvandina rekombinantset Bm86-Campo Grande antigeeni (BmCG), rRmLTI ja Escherichia coli (LTB) kuumuslabiilset enterotoksiin B subühikut. Selle kimäärse RmLTI-BmCG-LTB antigeeni efektiivsus veistel R. microplus'i vastu oli 55,6%.

2.3. Kesksoolega seotud antigeeni kandidaadid

Ferritiini valgud on olulised raua füsioloogiliseks säilitamiseks mittetoksilisel, kuid bioloogiliselt kättesaadaval kujul. Need on puukide toitmise ajal allaneelatud verest pärineva raua metabolismis üliolulised [70,71]. Siiani on tuvastatud ja iseloomustatud kaks ferritiini molekuli (ferritiin 1 ja ferritiin 2). Ferritiin 1 (FER1) asub rakkudes, kus see osaleb raua füsioloogilises säilitamises.

Ferritiin 2 (FER2) jaoks ei ole selgroogsetel funktsionaalseid ortolooge. Seda ekspresseeritakse peamiselt soolestikus ja sellel on oluline bioloogiline roll raua transportimisel süljenäärmetesse ja munasarjadesse [71]. FER2 valku on kirjeldatud mitmesugustel puugiliikidel, sealhulgas D. variabilis, R. microplus, I. ricinus, Haemaphysalis longicornis ja I. scapularis [71,72]. FER2 funktsioonikaotuse uuringute põhjal on see paljutõotav vaktsiinikandidaat, kuna selle geeni pärssimine halvendab puukide toitmisvõimet, vähendab munemist ja vähendab vastsete koorumist [71].

Lisaks FER2-le on FER1 näidatud sobiva antigeenikandidaadina mitmesuguste puugiliikide tõrjeks. Hajdusek jt. testis veiste immuniseerimiseks R. microplus'i (RmFER2) rekombinantset FER2 valku ja leidis, et FER{4}}põhise vaktsiini üldine efektiivsus oli 64 protsenti [73]. Samamoodi on küülikute immuniseerimiseks kasutatud H. longicornis'e rekombinantseid valke FER1 ja FER2. Mõlemad valgud on väga immunogeensed ja indutseerivad peremeesantikehade tootmist. Peremeesorganismi immuniseerimine vähendas oluliselt nakatunud puukide massi ning munade arvu ja täielikult koorunud munadega puukide arvu. Kuid rekombinantne FER2 põhjustas suurema vähenemise ja suurema efektiivsusega (49 protsenti) kui rekombinantne FER1 (34 protsenti) [72].

Hiljuti teatasid Manjunathachar ja kaastöötajad [74], et Krimmi-Kongo hemorraagilise palaviku vektori H. anatolicum FER2-ga vaktsineeritud vasikas oli tugevalt kaitstud vastsete (51,7 protsenti) ja täiskasvanud (51,2 protsenti) puukide nakatumise eest. samuti RNAi poolt maha löödud FER2-ga puukide vastu. Paljud teised hiljutised uuringud on samuti kinnitanud, et FER2 kaitseb peremeesorganismi oluliselt puukide nakatumise eest, kasutades FER2 rekombinantset valku [75–77]. Molekulaarne kaitsemehhanism hõlmab peamiselt FER2-vastaste antikehade tootmist peremeesorganismis, mis kanduvad toitmisprotsessi käigus puugiliikidesse ning FER2-vastased antikehad seonduvad FER2-ga puugi soolestiku rakkudes või hemolümfis, takistades seeläbi FER2 teket. kokkupanek ja/või funktsioon.

Hiljuti avastati, et FER2 valgu ennustatud antigeensed piirkonnad on erinevates puugiliikides konserveerunud. Seetõttu saab seda valku kasutada vaktsiini tootmiseks liikidevahelise kaitse tagamiseks [77]. Hiljutises uuringus iseloomustati O. moubata (OMFER2) ja O. erraticuse (OEFer2) FER2 ortolooge ning teadlased leidsid, et neil on suur järjestuste sarnasus (85,3 protsenti). O. moubata Fer2 (tOMFER2) rekombinantne vorm võib küülikutel esile kutsuda tugevaid humoraalseid reaktsioone. Siiski ei avalda see valk O. erraticus'e puhul mingit kaitsvat toimet, hoolimata järjestuste suurest sarnasusest, mis viitab sellele, et nende järjestuste väike erinevus võib määrata, kas neil on kaitsev toime või mitte. Sellele vaatamata kinnitavad selle uuringu tulemused, et OMFER2-l on potentsiaal olla vaktsiinide antigeenikandidaat [78].

TROSPA on puugiretseptor, mis on vajalik I. scapularis'e spiroheedi koloniseerimiseks. B. burgdorferi välispinna valku A (OspA) toodetakse nendel spiroheetidel ohtralt ja see on kriitilise tähtsusega adhesiooniks vektoriga spetsiifilise TROSPA-ga seondumise kaudu [79, 80]. Erinevatel puugiliikidel, sealhulgas R. microplus, I. scapulars ja R. annulatus, võib TROSPA mängida rolli nakkusmehhanismides ja Babesia patogeenide paljunemises. Lisaks ekspresseeritakse välispinna valgud OspA ja OspB, kui spiroheedid sisenevad puukidesse ja asuvad nendes [81]. Kuid nende ekspressioon on peremeesorganismile edastamise ajal alla surutud, samas kui OspC ja bba52 ekspressioonid on ülesreguleeritud. BBA52-l koos borreeli OspC valguga on ülekandeprotsessis täiendav, kuid mitteoluline roll, kuna need antigeenid paiknevad kõik välismembraanis ja ekspresseeritakse koos puukide toitmises [82–84].

Retseptori bioloogiline funktsioon on teadmata, kuid OspA seondumine TROSPA-ga on vajalik selleks, et puugid saaksid bakteri B. burgdorferi koloniseerida puugisoolestikku, mis toetab vektoris bakteriaalset nakatumist [79]. B. burgdorferi nakatumine indutseerib teatud puugigeenide (TROSPA ja salp15) tootmist, mis võivad olla suunatud Borrelia spirochetes ja teiste puukide kaudu levivate mikroobide edasikandumise pärssimisele [80,85]. TROSPA blokeerimine TROSPA antiseerumiga või RNAi kaudu vähendab B. burgdorferi kleepumist I. abaluude soolestikku ja vähendab seega vektori bakteriaalset kolonisatsiooni ja potentsiaalset patogeeni ülekandumist peremeesorganismile [79]. Selle koostoime tulemusena analüüsiti veistel rekombinantset TROSPA-d kui antigeenvaktsiini, et kontrollida puukide nakatumist ja patogeenide ülekandumist, kuid see ei mõjutanud puukide toitumist ega viljakust [14].

Akvaporiinid (AQP) või transmembraansed veekanalid mängivad olulist rolli vee homöostaasis ja krüokaitses [86,87]. Nad on evolutsiooniliselt väga konserveerunud suuremate peamiste sisemiste valkude perekonna liikmed. Nad moodustavad rakumembraanis poorid, mis transpordivad vett või muid lahustunud aineid [86,88,89]. Lisaks vee ja väikeste neutraalsete lahustunud ainete transportimisele osalevad AQP-d paljudes füsioloogilistes protsessides [90].

Puukide puhul on AQP-sid täheldatud seedetraktis, Malpighi tuubulites ja ka süljenäärmetes [91]. AQP-d vähendavad peremehe vere mahtu puugisooltes, mis on oluline füsioloogiline funktsioon, kuna puugid neelavad oma suuruse ja kaaluga võrreldes suures koguses verd [62]. R. micro pluss ummistunud emasloomade akvaporiini fragment on eraldatud ja seejärel rekombinantselt toodetud ning nimetatud RmAQP1 vaktsiiniks [62]. Selle vaktsiini efektiivsust R. microplus'e vastu testiti kahes karjaaediku katses, mis näitasid 68-protsendilist ja 75-protsendilist efektiivsust. See viitab sellele, et RmAQP1 võib olla potentsiaalne vaktsiini antigeen [62] ja et akvaporiine saab kasutada puugivastastes vaktsiinides [62]. Hiljutises uuringus sama liigi RmAQP2 kohta on näidatud, et RmAQP2 rakuväliste domeenide sünteetilise peptiidiga vaktsineeritud veised suutsid täidiseni toituvate puukide arvu üldiselt 25% võrra vähendada, mis viitab sellele, et see sihtmärk. (RmAQP2) võib olla puugihammustuste vastase vaktsiinikokteili kasulik komponent [92].

Teine uuring I. ricinuse kohta kinnitas puukide AQP antigeenide efektiivsust puukide nakatumise tõrjeks, näidates IrAQP ja CoAQP vaktsineerimise mõju I. ricinuse puugivastsetele küülikutel. CoAQP antigeenis sisalduvat AQP konserveerunud piirkonda sisaldava vaktsiini efektiivsus oli kõrgem kui IrAQP vaktsiinil [93]. Lisaks andis vaktsineerimine Ornithodoros erraticus AQP-dest (OeAQP ja OeAQP1) saadud sünteetiliste immunogeensete peptiididega veistele olulise kaitse homoloogse liigi O. erraticus vastu, kuid liikidevaheline kaitse Ornithodoros moubata vastu oli madalam [94]. Lisaks on mõned teised uuringud tuvastanud ka erinevate liikide, sealhulgas O. moubata ja Ixodid puukide AQP-sid, kusjuures bioinformaatikaanalüüsid viitavad sellele, et neil AQP-del on hea potentsiaal vaktsiinina kasutamiseks. Seetõttu on nende AQP-de antigeenipotentsiaali kinnitamiseks vaja täiendavaid eksperimentaalseid tõendeid [95, 96].

I. ricinus on üks puugiliike, mis vastutab puukidega levivate haiguste kasvava levimuse eest lemmikloomade seas Euroopas [4]. AQP-põhiste vaktsiinide mõju I. ricinus'e vastsete nakatumisele ja sulamisele võib vähendada puukide nakatumist vaktsineeritud loomadel ja kinnitab, et CoAQP võib olla kaitsva antigeeni kandidaat erinevate puugiliikide tõrjeks, kes toituvad samast peremeesorganismist.

Uuring, milles kasutati ekspressiooniraamatukogu immuniseerimist puukide nakatumise hiiremudeli vastu, näitas, et 4D8 valk, mida hiljem nimetati allrendimiseks (SUB), on potentsiaalne antigeen, mida saab kasutada I. scapularise vastase vaktsiinina [97]. Leiti, et SUB geeni ja valgu järjestused on selgrootute ja selgroogsete puhul konserveerunud. Lisaks on see geen identifitseeritud ja iseloomustatud erinevatel puugiliikidel ning leiti, et see ekspresseerub täiskasvanud puukide erinevates arengufaasides ja erinevates kudedes [98]. SUBi laia leviku tõttu pakuti, et see on hea antigeeni vaktsiinikandidaat. SUB-i antigeenipotentsiaali on varem uuritud veistel, kasutades rekombinantseid valke ja leiti, et SUB suudab kaitsta (51-protsendiline efektiivsus) puukide eest.

Lisaks saavutas R. microplus'i tõrjeks SUB-vaktsineerimise ja puukide autotsiidse tõrje kombinatsioon pärast SUB-geeni tõrjumist veistel toituvate puukide puhul pärast ravi 75-protsendilist efektiivsust [99 100]. Lisaks valmistasid Shakya ja kaastöötajad R. microplusi rekombinantset SUB-i ja kasutasid seda rekombinantset valku veiste immuniseerimiseks. Neid mäletsejalisi nakatati seejärel R. microplus larvae'ga. Lisaks hinnati selle valgu efektiivsust teise geograafiliselt erineva puugitüve vastu. Rekombinantse SUB efektiivsus jäi vahemikku 32,7 protsenti kuni 44,1 protsenti ja viitas kõrgele järjestuse homoloogiale Mehhiko ja India puugitüvede vahel [101]. Teises uuringus sünteesiti rekombinantne SUB kimäärse valguna MSP1a-ga ja seejärel rakendati veistele R. microplus'i tõrjeks.

Üllataval kombel näitas see kimäärne valk 81-protsendilist efektiivsust [102]. SUB-i kasutamise edukate ja paljutõotavate tulemuste tulemusena testiti selle antigeeni kombinatsiooni Bm86-ga ja eeldati, et see annab paremaid tulemusi, kuid üldine tõhusus ei toetanud selle kombinatsiooni kasutamist vaktsiinina. Kuigi on näidatud, et kahe antigeeni samaaegsel manustamisel aktiveeritakse iga antigeeni puhul kõrge spetsiifiliste antikehade tase, jagatakse need erinevatesse preparaatidesse ja kasutatakse looma erinevates inokuleerimiskohtades [103,104].

Varem tuntud kui ligandiinid, moodustavad glutatioon-S-transferaasid (GST-d) loomariigis laialt levinud multifunktsionaalsete valkude perekonna. Need ensümaatilised valgud mängivad rolli rakusiseses transpordis, seedimises, prostaglandiinide tootmises, nii endogeensete kui ka eksogeensete ainete detoksikatsioonis ja kaitses oksüdatiivse stressi vastu. GST ekspressioonitasemed suurenevad organismides, kui nad puutuvad kokku insektitsiidide ja akaritsiididega [105]. Küüliku seerum, mis sisaldas R. microplus'e GST vastaseid polüklonaalseid antikehi, reageeris H. longicornis'e ja R. appendiculatus'e rekombinantse GST-ga, mis viitab sellele, et puugi GST-d võivad olla universaalse vaktsiini koostisosaks, mis kaitseb rohkem kui ühe puugiliigi eest [106]. .

Sellele eeluuringule tuginedes eraldasid Parizi ja kaastöötajad (2011) GST-d H. longicornis'est ja tootsid rekombinantset GST-d ning kasutasid seda veiste R. microplus'e vastu vaktsineerimiseks [107]. See kaitses veiseid R. micro plusi eest 57-protsendilise efektiivsusega. Rekombinantne GST valk andis peremeesorganismis osalise ristkaitsevaimsuse, mis viitab sellele, et GST valkude kaitsevõime ei ole piisav ja seega ei tundu selle valgu kasutamine ühe antigeeniga vaktsiinis olevat tõhus puukide nakatumise ärahoidmisel. 107].

For more information:1950477648nn@gmail.com