Cistanche tubulosa kaitsev toime H2O2/UVB-indutseeritud naha fibroblastide kollageeni lagunemise vastu Hsa-mikroRNA-4535-vahendatud TGF/Smad signaalimise kaudu

ABSTRAKTNE

Selle uuringu eesmärk oli uurida mehhanismi, mis on aluseks cistanche kaitsvale toimele H2O2/UVB-indutseeritud kahjustuste vastu, kasutades fotokahjustuste in vitro ja in vivo mudeleid. Lisaks tuvastasime miRNA regulatsiooni kaasamise selles protsessis. In vitro ja in vivo fotokahjustuste mudelitena kasutati H2O2/UVB-ga töödeldud inimese dermaalseid fibroblaste HS68 ja UVB-indutseeritud C57BL/6J karvutuid hiiri. Tulemused näitasid sedatsitanche ravileevendas H2O2/UVB-indutseeritud rakkude elujõulisuse vähenemist, TGF/Smad signaali kahjustusi ja naha vananemist. MikroRNA massiivi analüüside ja andmebaasiotsingu tulemuste põhjal tuvastati has-miR-4535 potentsiaalse miRNA-kandidaadina, mis sihib Smad4. In vitro,tsitanche raviaktiveeris Smad2/3/4 kompleksi ja inhibeeris hsa-miR-4535 ekspressiooni H2O2/UVB-ga eksponeeritud rakkudes. In vivo väikeste (12 mg/kg) ja suurte annuste (24 mg/kg) tsüstanche paikne manustamine C57BL/6J karvutute hiirte seljanahale leevendas oluliselt UVB-indutseeritud naha fotokahjustusi, soodustades TGF/Smad kollageeni sünteesi signaaliülekannet, vähendadesepidermise hüperplaasia, kortsude teke janaha vananemine, sama hästi kuihsa-miR-4535 ekspressiooni pärssimine. Kokkuvõttes näitavad meie leiud seost hsa-miR-4535 ja TGF / Smad kollageeni sünteesi signaalimise vahelja soovitada neid tegureid sellesse kaasatafotokaitse mehhanismcistanchenaha fibroblastidesH vastu2O2/UVB-indutseeritud vananemine. Tõendid näitasid, etcistanchekoosvananemisvastased omadusedvõib ollapeetakse nahahooldustoodete lisandiks.

Cistanche vananemisvastaste toodete hankimiseks klõpsake siin

SISSEJUHATUS

Inimese naha vananemise kliinilisteks tunnusteks on suurenenud kortsude teke, lõtvus ja ebaregulaarne pigmentatsioon [1]. Naha vananemisprotsess on keeruline ja selle võib jagada kahte tüüpi: sisemine vananemine ja välimine vananemine. Sisemine vananemine on tingitud aja möödumisest ja geneetilistest teguritest, samas kui väline vananemine, mida nimetatakse ka fotovananemiseks, tuleneb peamiselt kokkupuutest ultraviolettkiirgusega [2, 3]. Varasemad uuringud on näidanud, et nii sisemise kui ka välise vananemise ajal tekivad rikkalikud reaktiivsed hapniku liigid (ROS). ROS-i akumuleerumine võib indutseerida mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaaliülekannet ja aktiveerida selle allavoolu transkriptsioonifaktori, aktivaatorvalgu -1 (AP-1). Aktiveeritud AP-1 võib translokeeruda tuuma ja seonduda maatriksi metalloproteinaaside (MMP) promootorpiirkondadega [4]. MMP-d on suur tsingist sõltuv endopeptidaasi rühm, mis aitab kaasa naha dermise ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) lagunemisele. Eelkõige osaleb kollagenaas MMP-1 I ja III tüüpi kollageeni lõhustamises [5]. I ja III tüüpi kollageen, ECM-i peamised komponendid, on võimelised andma naha dermisele tuge ja tugevust ning nende lagunemine põhjustab vananevale nahale iseloomulikku kortsude teket ja lõtvust [6]. Transformeeriv kasvufaktor-beeta (TGF) on kõikjal levinud ja tugev tsütokiin, millel on kolm erinevat isovormi, TGF 1, TGF 2 ja TGF 3, mis võivad positiivselt reguleerida kollageeni sünteesi inimese naha pärisnahas [2]. TGF-id käivitavad signaali, interakteerudes rakupinna spetsiifiliste seriini/treoniini kinaasi retseptori kompleksidega, sealhulgas I (TRI) ja II (TRII) tüüpi TGF-retseptoritega. TRI fosforüülimine käivitab R-Smadide (Smad2 ja Smad3) fosforüülimise. Aktiveeritud R-Smad interakteeruvad Smad4-ga, et reguleerida selle tuuma translokatsiooni ja aktiveerida transkriptsiooniliselt I ja III tüüpi kollageeni, seondudes Smad-siduvate elementide (SBE) promootoritega [7, 8]. Tõendid näitavad, et sisemisest või fotovananemisest põhjustatud suurenenud ROS-i teke aitab kaasa TGF / Smad signaaliraja kahjustusele, mis omakorda põhjustab kollageeni sünteesi vähenemist inimese naha dermaalsetes fibroblastides [9, 10].

tsistanche (3,5,7-trihüdroksüflavon), mis on flavonoidide perekonna looduslik liige, on rohkesti Alpinia officinarum'is ja taruvaigus. cistanche on potentsiaalne kandidaat isheemilise insuldi, diabeedi ja erinevate vähitüüpide raviks [11–13]. Lisaks on tsistansil radikaalne eemaldav ja põletikuvastane toime [14, 15]. Varem näitasime, et cistanche vähendas H2O2-indutseeritud põletikku ja soodustas kollageeni moodustumist insuliinitaolise kasvufaktori 1 retseptori (IGFI-R)/ERK1/2 signaaliradade kaudu HS68 rakkudes [16, 17]. Lisaks näitas uuring, et tsistanche tuvastati Alpinia officinarum'i ühendina ja sellel on kollagenaasi inhibeeriv toime naha fibroblastirakkudes [18]. Siiski pole teada üksikasjalikum molekulaarne mehhanism, mis on seotud sellega, kuidas cistanche reguleerib naha vananemist.

MikroRNA-d (miRNA-d) on rühm väikeseid, üheahelalisi, mittekodeerivaid RNA molekule, mille keskmine pikkus on 22 nukleotiidi. Küpsed miRNA-d transkribeeritakse DNA järjestustest. Enamikul juhtudel seonduvad küpsed miRNA-d mRNA translatsiooni vaigistamiseks sihtmärk-mRNA 3'-mittetransleeritavate piirkondadega [19]. Inimese nahas mängivad miRNA-d olulist rolli rakkude metabolismi, vähi, vananemise ja kollageeni moodustumise reguleerimisel [20–23]. Näiteks võib miR-377 indutseerida naha fibroblastide vananemist, inhibeerides DNA metüültransferaas 1 (DNMT1) ekspressiooni, mis omakorda viib p53 promootori väiksema metüülimiseni ja naha fibroblastide vananemiseni [22]. MiRNA profiil UVB-indutseeritud kahjustuste korral inimese nahas

papillarakke (nHDP-sid) uuriti varem [24]. Kuid see, kuidas UVB-indutseeritud naha fibroblastide vananemine miRNA regulatsiooni kaudu, eriti loodusliku ühendi kaasamisel, on suuresti teadmata. Selle uuringu eesmärk oli uurida cistanche'i kaitsvat toimet H2O2/UVB-indutseeritud nahakahjustuste vastu ning mikroRNA-vahendatud kollageeni lagunemise rolli selles protsessis. Lisaks püüdsime tuvastada kollageeni sünteesi reguleerimises osalevad mikroRNA-d.

TULEMUSED

cistanche inhibeerib UVB/H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust inimese naha HS68 fibroblastides

Tistanche (joonis 1A) tsütotoksilisuse uurimiseks in vitro töödeldi HS68 rakke erinevate tsistanšide annustega (0, 10, 20, 30, 40, 50 µM) 24 tunniks. MTT testi tulemused näitasid, et cistanche ei olnud HS68 rakkude suhtes tsütotoksiline (joonis 1B). Järgmisena eksponeerisime HS68 rakke 24 tunni jooksul H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) ja UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) erinevatele annustele. H2O2- ja UVB-ravi vähendas rakkude elujõulisust annusest sõltuval viisil (joonis 1C, 1D). Tsistanche tsütoprotektiivsete omaduste hindamiseks pärast kokkupuudet H2O2 ja UVB-kiirgusega töödeldi HS68 rakku erineva kontsentratsiooniga tsistansiga (10, 20, 30 μM) pärast H2O2- (200 μM) ja UVB-indutseeritud (40 mJ/cm²) ) kahju. Ainult H2O2- või UVB-ravi

mõju HS68 rakkudele.

Et teha kindlaks, kas rakkude elujõulisuse vähenemine oli tingitud rakusurmast või kasvu pärssimisest, kontrollisime mitmete apoptoosi- ja ellujäämismarkerite ekspressiooni Western blot analüüsiga HS68 rakkudes, mis olid kokku puutunud erinevate H2O2 annustega (50, 100, 200, 300, 400 μM). 24 tunniks. Leidsime ellujäämismarkerite, nagu p-Akt, oluliselt vähenenud ekspressiooni ja suurenenud ekspressiooni

Joonis 1. Tsistanche inhibeerib UVB/H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust HS68 inimese dermaalsetes fibroblastides. (A) Tistanši keemiline struktuur. (B) HS68 rakkude elujõulisus, mida on töödeldud erineva kontsentratsiooniga tsistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) 24 tundi. (C ja D) HS68 rakkude elujõulisus, mida on eksponeeritud erinevatele H2O2 annustele (100, 150, 200, 250, 300 µM) või kiiritatud UVB-ga (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) 24 tunni jooksul. (E ja F) HS68 rakkude elujõulisus, mis on eksponeeritud H2O2-le (200 uM) või kiiritatud UVB-ga (40 J/cm2) 1 tund ja seejärel töödeldud tsistantšiga (10, 20, 30 uM) 23 tundi. Tistanche'i tsütoprotektiivne toime määrati MTT testiga. Kontrollrakkudele määrati 100 protsenti elujõulisust. Väärtused on näidatud keskmisena ± SE. Näidatud on tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. töötlemata kontrollrakud; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2 või UVB-ga töödeldud rakud.

Joonis 5. Hsa-miR-4535 sihib Smad4. (A) MikroRNA ekspressiooni tsistanchiga töödeldud HS68 rakkudes hinnati mikrokiipide abil. (B) Venni diagramm, mis kujutab potentsiaalseid mRNA kandidaate, mida hsa-miR-4535 võib reguleerida miRDB ja TargetScanHumani andmebaaside põhjal. Smad4-3′-UTR mRNA hsa-miR-4535 oletatavate miRNA-d siduvate saitide järjestuse analüüs. Vasteid tähistatakse sirgjoontega. (C) HS68 rakud kaastransfekteeriti Smad4-3′-UTR-WT-ga (metsiktüüp; 0.5 µg/mL) pluss hsa-miR-4535 miimikaga (2{ {25}} nM) või Smad4-3′-UTR MT (mutant; 0,5 µg/mL) pluss hsa-miR-4535 miimika (20 nM) 24 tunni jooksul. Lutsiferaasi aktiivsus määrati ja normaliseeriti Renilla omaga. Kuvatakse tulemuste kvantifitseerimine (n=3); ***P < 0,001, võrreldes Smad4-3′-UTR-MT pluss hsa-miR-4535 matkimisrühmaga. G1=kontroll, G2=cistanche (10 μM), G3=tsistanš (30 μM)