Cistanche'i kaitseefektid H2O2/UVB-indutseeritud naha fibroblastide kollageeni lagunemise vastu Hsa-microRNA-4535-vahendatud TGF/Smad signaalimise kaudu
May 06, 2023
ABSTRAKTNE
Selle uuringu eesmärk oli uurida selle aluseks olevat mehhanismicistanche kaitsev toimeH2O2/UVB-indutseeritud kahjustuste vastu, kasutades fotokahjustuste in vitro ja in vivo mudeleid. Lisaks tuvastasime miRNA regulatsiooni kaasamise selles protsessis. In vitro ja in vivo fotokahjustuste mudelitena kasutati H2O2/UVB-ga töödeldud inimese dermaalseid fibroblaste HS68 ja UVB-indutseeritud C57BL/6J karvutuid hiiri. Tulemused näitasid sedatsitanche ravileevendas H2O2/UVB-indutseeritud rakkude elujõulisuse vähenemist, TGF / Smad signaali kahjustusja naha vananemist. MikroRNA massiivi analüüside ja andmebaasiotsingute tulemuste põhjal tuvastati has-miR-4535 kuipotentsiaalne kandidaat miRNA, mis on suunatud Smad4-le. In vitro aktiveeris tsüstanche töötlemine Smad2/3/4 kompleksi ja inhibeeris hsa-miR-4535 ekspressiooni H2O2/UVB-ga eksponeeritud rakkudes. In vivo väikeste (12 mg/kg) ja suurte annuste (24 mg/kg) tsüstanche paikne manustamine C57BL/6J karvutute hiirte seljanahale leevendas oluliselt UVB-indutseeritud naha fotokahjustusi, soodustades TGF/Smad kollageeni sünteesi signaaliülekannet, epidermise hüperplaasia, kortsude moodustumise ja naha vananemise vähendamine, samuti hsa-miR-4535 ekspressiooni pärssimine. Kokkuvõttes näitavad meie leiud seost hsa-miR-4535 ja TGF / Smad kollageeni sünteesi signaalide vahel ning viitavad sellele, et need tegurid osalevad naha fibroblastides esineva tsistanši fotokaitsemehhanismis H2O2/UVB-indutseeritud vananemise vastu. Tõendid näitasid, etvananemisvastaste omadustega tsistanšvõib ollaaastal peetakse täienduseksnahahooldustooted.
Müüa Cistanche nahahooldustoode
SISSEJUHATUS
Inimese naha vananemise kliinilisteks tunnusteks on suurenenud kortsude teke, lõtvus ja ebaregulaarne pigmentatsioon [1]. Naha vananemisprotsess on keeruline ja selle võib jagada kahte tüüpi: sisemine vananemine ja välimine vananemine. Sisemine vananemine on tingitud aja möödumisest ja geneetilistest teguritest, samas kui väline vananemine, mida nimetatakse ka fotovananemiseks, tuleneb peamiselt kokkupuutest ultraviolettkiirgusega [2, 3]. Varasemad uuringud on näidanud, et nii sisemise kui ka välise vananemise ajal tekivad rikkalikud reaktiivsed hapniku liigid (ROS). ROS-i akumuleerumine võib indutseerida mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaaliülekannet ja aktiveerida selle allavoolu transkriptsioonifaktori, aktivaatorvalgu -1 (AP-1). Aktiveeritud AP-1 võib translokeeruda tuuma ja seonduda maatriksi metalloproteinaaside (MMP) promootorpiirkondadega [4]. MMP-d on suur tsingist sõltuv endopeptidaasi rühm, mis aitab kaasa naha dermise ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) lagunemisele. Eelkõige osaleb kollagenaas MMP-1 I ja III tüüpi kollageeni lõhustamises [5]. I ja III tüüpi kollageen, ECM-i peamised komponendid, on võimelised andma naha dermisele tuge ja tugevust ning nende lagunemine põhjustab vananevale nahale iseloomulikku kortsude teket ja lõtvust [6]. Transformeeriv kasvufaktor-beeta (TGF) on kõikjal levinud ja tugev tsütokiin, millel on kolm erinevat isovormi, TGF 1, TGF 2 ja TGF 3, mis võivad positiivselt reguleerida kollageeni sünteesi inimese naha pärisnahas [2]. TGF-id käivitavad signaali, interakteerudes rakupinna spetsiifiliste seriini/treoniini kinaasi retseptori kompleksidega, sealhulgas I (TRI) ja II (TRII) tüüpi TGF-retseptoritega. TRI fosforüülimine käivitab R-Smadide (Smad2 ja Smad3) fosforüülimise. Aktiveeritud R-Smad interakteeruvad Smad4-ga, et reguleerida selle tuuma translokatsiooni ja aktiveerida transkriptsiooniliselt I ja III tüüpi kollageeni, seondudes Smad-siduvate elementide (SBE) promootoritega [7, 8]. Tõendid näitavad, et sisemisest või fotovananemisest põhjustatud suurenenud ROS-i teke aitab kaasa TGF / Smad signaaliraja kahjustusele, mis omakorda põhjustab kollageeni sünteesi vähenemist inimese naha dermaalsetes fibroblastides [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihüdroksüflavoon), mis on flavonoidide perekonna loomulik liige, on rohkesti Alpinia officinarum'is ja taruvaigus. cistanche on potentsiaalne kandidaat isheemilise insuldi, diabeedi ja erinevate vähitüüpide raviks [11–13]. Lisaks on tsistansil radikaalne eemaldav ja põletikuvastane toime [14, 15]. Varem näitasime, et cistanche vähendas H2O2-indutseeritud põletikku ja soodustas kollageeni moodustumist insuliinitaolise kasvufaktori 1 retseptori (IGFI-R)/ERK1/2 signaaliradade kaudu HS68 rakkudes [16, 17]. Lisaks näitas uuring, et tsistanche tuvastati Alpinia officinarum'i ühendina ja sellel on kollagenaasi inhibeeriv toime naha fibroblastirakkudes [18]. Siiski ei ole teada üksikasjalikum molekulaarne mehhanism, mis on seotud sellega, kuidas cistanche reguleerib naha vananemist. MikroRNA-d (miRNA-d) on rühm väikeseid üheahelalisi mittekodeerivaid RNA molekule, mille keskmine pikkus on 22 nukleotiidi. Küpsed miRNA-d transkribeeritakse DNA järjestustest. Enamikul juhtudel seonduvad küpsed miRNA-d mRNA translatsiooni vaigistamiseks sihtmärk-mRNA 3'-mittetransleeritavate piirkondadega [19]. Inimese nahas mängivad miRNA-d olulist rolli rakkude metabolismi, vähi, vananemise ja kollageeni moodustumise reguleerimisel [20–23]. Näiteks võib miR-377 indutseerida naha fibroblastide vananemist, inhibeerides DNA metüültransferaas 1 (DNMT1) ekspressiooni, mis omakorda viib p53 promootori väiksema metüülimiseni ja naha fibroblastide vananemiseni [22]. Varem uuriti miRNA profiili UVB-indutseeritud kahjustustes inimese dermaalsetes papillarakkudes (nHDP-d) [24]. Kuid see, kuidas UVB-indutseeritud naha fibroblastide vananemine miRNA regulatsiooni kaudu, eriti loodusliku ühendi kaasamisel, on suuresti teadmata. Selle uuringu eesmärk oli uurida cistanche'i kaitsvat toimet H2O2/UVB-indutseeritud nahakahjustuste vastu ning mikroRNA-vahendatud kollageeni lagunemise rolli selles protsessis. Lisaks püüdsime tuvastada kollageeni sünteesi reguleerimises osalevad mikroRNA-d.
TULEMUSED
cistanche inhibeerib UVB/H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust inimese naha HS68 fibroblastides
Tistanche (joonis 1A) tsütotoksilisuse uurimiseks in vitro töödeldi HS68 rakke erinevate tsistanšide annustega (0, 10, 20, 30, 40, 50 µM) 24 tunniks. MTT testi tulemused näitasid, et cistanche ei olnud HS68 rakkude suhtes tsütotoksiline (joonis 1B). Järgmisena eksponeerisime HS68 rakke 24 tunni jooksul H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) ja UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) erinevatele annustele. H2O2- ja UVB-ravi vähendas rakkude elujõulisust annusest sõltuval viisil (joonis 1C, 1D). Tistanche tsütoprotektiivsete omaduste hindamiseks järgmiseltH2O2 ja UVB-kiirgusega, töötlesime HS68 rakkuerineva kontsentratsiooniga tsistanš (10, 20, 30 μM)järgides H2O2- (200 μM) ja UVB-indutseeritud (40mJ/cm²) kahju. H2O2 või ainult UVB-ravivähendas oluliselt (40 protsenti) HS68 elujõulisustrakud. Tsistanche-ravi takistas aga rakusurmakontsentratsioonist sõltuval viisil (joonis 1E, 1F).Silmapaistvalt kõrgem tsistanši kontsentratsioon (30 μM).Alleviõpetas H2O2- ja UVB-indutseeritud tsütotoksilisus.Seetõttu kasutati 30 μM tsistanši annustjärgnevin vitrouuringud selle kaitsmise hindamiseksmõju HS68 rakkudele.
Joonis 1. Tsistanche inhibeerib UVB/H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust HS68 inimese dermaalsetes fibroblastides. (A) Tistanši keemiline struktuur. (B) HS68 rakkude elujõulisus, mida on töödeldud erineva kontsentratsiooniga tsistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) 24 tundi. (C ja D) HS68 rakkude elujõulisus, mida on eksponeeritud erinevatele H2O2 annustele (100, 150, 200, 250, 300 µM) või kiiritatud UVB-ga (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) 24 tunni jooksul. (E ja F) HS68 rakkude elujõulisus, mis on eksponeeritud H2O2-le (200 uM) või kiiritatud UVB-ga (40 J/cm2) 1 tund ja seejärel töödeldud tsistantšiga (10, 20, 30 uM) 23 tundi. Tistanche'i tsütoprotektiivne toime määrati MTT testiga. Kontrollrakkudele määrati 100 protsenti elujõulisust. Väärtused on näidatud keskmisena ± SE. Näidatud on tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. töötlemata kontrollrakud; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2 või UVB-ga töödeldud rakud.
Cistanche nõrgendab H2O2-indutseeritud HS68 rakkupigem vananemine kui apoptoos
Cistanche nõrgendab UVB/H2O2-indutseeritud intratsellulaarset/mitokondriaalset ROS-i tootmist ja MMP tasakaalustamatust HS68 rakkudes
cistanche nõrgendab H2O2-indutseeritud TGF-i /Smadkollageeni sünteesi raja kahjustus HS68 rakkudes
Tsistanche-ravi vähendab H2O2-indutseeritud hsa-miR-4535 ülesreguleeritud ekspressiooni, mis on eeldatavasti suunatud Smad4-le
Joonis 4. Tsistanche nõrgendab H2O2--indutseeritud TGF/Smad kollageeni sünteesiraja kahjustusi HS68 rakkudes. (A) HS68 rakke eksponeeriti H2O2-ga (200 µM) 1 tund ja seejärel töödeldi tsüstanšiga (30 µM) 23 tundi. Kollageeni sünteesiga seotud raja komponentide (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) valgu ekspressioon ja kollageeni lagunemisega seotud valk (MMP-1) tuvastati Western blot meetodil. (B) p-smad2/3 ja Smad4 valgu ekspressioon tuuma- ja tsütosoolsetes fraktsioonides tuvastati Western blot analüüsiga. Laadimiskontrollina kasutati GAPDH-d. Väärtused on näidatud keskmisena ± SE. Kuvatakse tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. töötlemata kontrollrakud; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2-töödeldud rakud. (C) Anti-p-Smad2/3, Smad4 antikeha ja FITC/PE-konjugeeritud sekundaarset antikeha kasutati p-Smad2/3 (roheline) ja Smad4 (punane) ekspressiooni tuvastamiseks. DAPI näitas tuuma asukohta (sinine). Pildid jäädvustati fluorestsentsmikroskoobiga (200×).
Smad4 moduleerimine has-miR-4535 poolt osaleb kollageeni sünteesis H2O2--eksponeeritud inimese naha dermaalsetes fibroblastides
ja COL3A1 tasemed (joonis 7F). Hsa-miR-4535 üleekspressioon (joonis 8A–8C) või Smad4 inhibeerimine siRNA poolt (joonis 8D, 8E) põhjustas H2O2 kokkupuute järgselt kollageeni sünteesi vähenemise tsistanche töötlemisel. Üllatuslikult avastasime, et nii otsene Smad4 vaigistamine kui ka hsa-miR-4535-ga töötlemine jäljendavad Tsistanche-indutseeritud kollageeni sünteesi H2O2--ga töödeldud HS68 rakkudes. Kokkuvõttes jõudsime järeldusele, et cistanche reguleeris kollageeni sünteesi, potentsiaalselt hsa-miR-4535 taseme langetamise kaudu, et tõhustada Smad4 signaaliülekannet H2O2-ga kokkupuutunud HS68 rakkudes.
cistanche suurendab TGF / Smad kollageeni sünteesi rada ja nõrgendab naha vananemist, samuti has-miR-4535 ekspressiooni pärssimist UVB-kiirgusega eksponeeritud HS68 rakkudes
Tistanche paikne kasutamine nõrgendab UVB-indutseeritud naha hüperplaasiat ja kollageeni lagunemist, samuti suurendab TGF/Smad signaaliülekannet C57BL6/J karvutute hiirte seljanahas.
Joonis 6. cistanche reguleerib üles Smad4 ekspressiooni, vähendades hsa-miR-4535 taset. (A, B) HS68 rakke töödeldi erinevate H2O2 kontsentratsioonidega (0, 100, 20{{30}} µM ) 24 tundi. (C, D) HS68 rakke eksponeeriti H2O2-ga (200 uM) 1 tund ja seejärel töödeldi tsistanchega (30 uM) 23 tundi. hsa-miR-4535 ja Smad4 ekspressioon tuvastati qRT-PCR abil. Väärtused on näidatud keskmisena ± SE. Näidatud on tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. töötlemata kontrollrakud; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2-töödeldud rakud.
Joonis 7. Hsa-miR-4535 üleekspressioon või inhibeerimine reguleerib kollageeni sünteesi HS68 rakkudes. (A–C) HS68 rakke transfekteeriti hsa-miR-4535 inhibiitoriga (40 nM) või inhibiitoriga NC (40 nM) 1 tund ja seejärel töödeldi H2O2-ga (2 00 μM) 23 tunni jooksul. (D–F) HS68 rakke transfekteeriti hsa-miR-4535 mimic (10 nM) või mimic NC-ga (10 nM) 1 tund ja seejärel töödeldi koos tsistanchega. (30 µM) 23 tundi. hsa-miR-4535 tasemed tuvastati qPCR abil, et tagada edukas transfektsioon. Smad4, COL1A1 ja COL3A1 valgu taset analüüsiti Western blot analüüsiga. Laadimiskontrollina kasutati GAPDH-d. Väärtused on näidatud keskmisena ± SE. Näidatud on tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. töötlemata kontrollrakud; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2 või tsistantšiga töödeldud rakud.
Joonis 8. Smad4 inhibeerimine siRNA või hsa-miR-4535 jäljendiga muudab naha fibroblastides kollageeni sünteesi tsüstanche-vahendatud võimenduse. (A–C) HS68 rakke transfekteeriti hsa-miR-4535 miimikaga (10 nM) või miimika NC-ga (10 nM) 1 tund, millele järgnes kaastöötlemine tsistanchega (3 {{40}} μM) ja H2O2 (200 μM) 23 tunni jooksul. Eduka transfektsiooni tagamiseks tuvastati qPCR abil Hsa-miR-4535 (A) ja Smad4 (B) tasemed. (D–E) HS68 rakke transfekteeriti siRNA Smad4-ga (2{50}} nM) või siRNA NC-ga (20 nM) 1 tund, millele järgnes kaastöötlemine tsistanche (30 µM) ja H2O2-ga (200 µM) 23 tundi. Eduka transfektsiooni tagamiseks tuvastati qPCR abil Smad4 tasemed (D). Smad4, COL1A1 ja COL3A1 valgu taset analüüsiti Western blot analüüsiga (C, E). Laadimiskontrollina kasutati GAPDH-d. Näidatud väärtused on keskmised ± SE. Näidatud on tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. töötlemata kontrollrakud; #P < 0,05, ##P < 0,01, vs. H2O2-töödeldud rakud; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 vs. H2O2 pluss tsistanšiga töödeldud rakud
Lisaks päästis cistanche rakendus TGF, p smad2/3 ja Smad4 valgu ekspressiooni UVB-kahjustusega nahakoes (joonis 12C). Meie leiud näitasid, et cistanche võib potentsiaalselt kaitsta nahka UVB-indutseeritud kahjustuste eest, inhibeerides hsa miR-4535, et tugevdada Smad4 ekspressiooni P-smad2/3 aktiveerimiseks, et lõpuks soodustada kollageeni sünteesi (joonis 13).
Joonis 9. Tsistanche suurendab TGF/Smad kollageeni sünteesi rada ja nõrgendab naha vananemist, samuti hsa-miR-4535 ekspressiooni pärssimist UVB-kiirgusega eksponeeritud HS68 rakkudes. HS68 rakke eksponeeriti UVB-kiirgusele (40 mJ/cm2) ja seejärel töödeldi tsüstanšiga (30 µM) 23 tundi. (A) Kollageeni sünteesiga seotud raja komponentide (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), kollageeni lagunemisega seotud valgu (MMP{{20}}) ja vananemisprotsessiga seotud valgu ekspressioon. seotud markerid (p16 ja p21) tuvastati Western blot meetodil. Laadimiskontrollina kasutati GAPDH-d. (B ja C) hsa-miR-4535 ja Smad4 RNA ekspressioon tuvastati qRT-PCR abil. Väärtused on näidatud keskmisena ± SE. Näidatud on tulemuste kvantifitseerimine (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, vs töötlemata kontrollrakud; #P < 0,05, ##P < 0,01 vs UVB-kiirgusega eksponeeritud rakud.
Küsi lisa:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950
