Resveratrooli kaitsev toime akrüülamiidist põhjustatud neerukahjustusele
Feb 23, 2022
Taust: Akrüülamiidil (ACR) on lai kasutusala. Sellel on aneerukahjustusmõju. Töö eesmärk oli uurida resveratrooli (RVS) võimalikku kaitsvat rolli ACR-vahendatud vastu.neerukahjustusrottidel. Uuriti sellises kaitses osalevaid soovitatud alusmehhanisme.Materjalid ja meetodid:Kolmkümmend Sprague-Dawley täiskasvanud albiinorotti jagati kolme rühma: kontroll, ACR ja RVS. 4 nädala pärast,neerudeemaldati ja valmistati ette histoloogilisteks, immunohistokeemilisteks ja biokeemilisteks uuringuteks. Hinnati kudede oksüdatiivsete (malondialdehüüdi [MDA]) ja antioksüdatiivsete (glutatioon [GSH]) markerite aktiivsust.Tulemused:Akrüülamiidi poolt indutseeritud glomerulaarneneeru-kiindumus glomerulite kokkutõmbumise ja moonutamise kujul koos nende basaalmembraanide kortsumise ja kuseteede laienemisega. Degeneratiivsed torukujulised muutused esinesid märkimisväärselt proksimaalsetes keerdunud tuubulites. Nekrootilistel torukujulistel rakkudel ilmnes tsütoplasmaatiline vakuolatsioon torukujulises luumenis olevate epiteelirakkudega. ACR suurendab kollageenikiudude ladestumist glomerulaarkapillaaride basaalmembraanis ja indutseerib glomerulaarkapillaaride basaalmembraanide paksenemist.neeru-veresooned janeeru-torukesed. RVS-i administreerimine pakub kõrget kaitsetneerud. Glomerulid janeeru-tuubulid olid peaaegu normaalsed. Kollageenikiudude sisaldus ja perioodiline happe Schiff reaktsioon basaalmembraanineeru-tuubulid olid 70 protsenti ja 19 protsenti madalamad ACR-rühmaga seotud. Kreatiniini ja uurea tase langes 51 protsenti ja 47 protsenti. RVS kutsus esile sellise kaitsva rolli oma antioksüdantse toime kaudu, kuna MDA tase langes 45 protsenti, samas kui GSH tase tõusis 83 protsenti võrreldes ACR rühmaga. Järeldused: Akrüülamiid põhjustab struktuurilisi ja funktsionaalseid häireidneerud.See kutsub esileneerudoksüdatiivse stressi ja apoptoosi põhjustatud kahjustused. RVS-i kasutamisel normaalneneerudarhitektuur säilis väikeste struktuurimuudatustega. Lisamine, funktsionaalneneerudtest muutus normaalseks. RVS avaldab oma kaitsvat toimet oma apoptootiliste ja antioksüdantsete omaduste kaudu. (Folia Morphol 2021; 80, 4: 985–993).
SISSEJUHATUSAkrüülamiid (ACR) on hästi tuntud keskkonnasaasteaine, mis avaldab inimestele mitmesuguseid süsteemseid toksilisi mõjusid nii töö- kui ka toiduga kokkupuutel [2, 22]. Sellel on mitmesuguseid kahjulikke omadusi: kantserogeensus, genotoksilisus, neurotoksilisus ja reproduktiivtoksilisus [5, 7]. ACR-i ja selle analooge kasutatakse laialdaselt erinevates keemia- ja keskkonnarakendustes ning neid toodetakse taimekoest pärineva bioloogilise materjali kuumutamisel [25]. ACR moodustumine toimub toidu töötlemisel süsivesikute kokkupuutel üle 200 kraadise temperatuuriga [12]. ACR-i kõrge sisaldus on leitud eelkõige tavaliselt tarbitavates toiduainetes; kartulikrõpsud ja leib [31].
Akrüülamiid imendub seedetraktist ja dispergeerub laialdaselt kehavedelikes ning säilitatakse maksas janeerud[28]. On teada, et ACR põhjustab paljudes elundites struktuurseid ja funktsionaalseid muutusi. Theneeru-torukujulised rakud läbivad degeneratiivseid vakuolaarseid muutusi, põletikuliste rakkude infiltratsiooni ja periglomerulaarset turset [28]. Lisaks tõstab ACR-i manustamine rottidele seerumi uurea, kreatiniini, kusihappe janeeru-põletikueelne tsütokiin [1]. ACR-i metabolism käivitab vabade radikaalide (ROS) vabanemise, mis käivitab oksüdatiivse stressi, mis põhjustab ROS-i arengu ja lagunemise tasakaalustamatust [19]. Samuti kutsub see esile lipiidide peroksüdatsiooni ja DNA kahjustamise [1].
Paljude antioksüdantide ja põletikuvastaste ühendite, nagu oliiviõli, E-vitamiin ja 5-aminosalitsüülhape, toimet uuriti ACR-i indutseeritud ennetamiseks ja raviks.neerukahjustus[9, 19]. Resveratrool (RVS) on fütoaleksiin, mida leidub vähemalt72 taimeliiki, millest paljusid söövad inimesed, sealhulgas mooruspuumarjad, maapähklid ja viinamarjad [8]. RVS-il on põletikuvastane, trombotsüütide agregatsioonivastane, antioksüdantne ja kantserogeenne toime, samuti võime vähendadaneerukahjustuspõhjustatud keemilistest ühenditest [8, 10]. Siiski on ebaselge, kas RVS suudab kaitsta ACR-i indutseeritud vastuneerukahjustusvõi mitte. Seetõttu uurisime ACR-i oksüdatiivset ja apoptootilist kahjustavat toimetneerudja uuris RVS-i kaitsvat rolli selliste üleneerukahjustusrottidel.
Märksõnad:resveratrool, akrüülamiid, neerud, neerud, neerukahjustus
MATERJALID JA MEETODID
LoomadMeie uuringusse kaasati kolmkümmend Sprague-Dawley täiskasvanud albiinorotti, kes kaalusid 170–200 g. Loomi peeti avarates traatvõrkpuurides spetsiaalses otsese päevavalguse ja loomuliku ventilatsiooniga ruumis. Rottidel oli vaba juurdepääs tavalisele roti toidule ja veele. Kõiki loomi raviti vastavalt laboriloomade hooldamise ja kasutamise standardjuhistele. Uuringut lubas Egiptuse Kairo ülikooli arstiteaduskonna eetikakomitee.Järgiti vastutava organisatsiooni eetilisi standardeid ja 1975. aasta Helsingi deklaratsiooni, mida muudeti 1983. aastal.
Eksperimentaalne disainRotid jaotati kolme rühma (igas rühmas 10): kontrollrühm (antud destilleeritud vett annuses 1 ml), ACR-rühm ja RVS-rühm (kaasaegne ACR pluss RVS).
KemikaalidAkrüülamiid saadi pulbriga mahutis, mille ostis firma Biostain Company (Ühendkuningriik), mis kaalus 500 g. See lahustati destilleeritud vees kontsentratsioonis 10 g/l. Seda manustati suu kaudu maosondiga annuses 1 ml destilleeritud vett, mis sisaldas 40 mg/kg/päevas [9]. Resveratrool (puhtus > 99 protsenti) osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). See lahustati dimetüülsulfoksiidis ja lahjendati 0,9% füsioloogilises soolalahuses. Seda manustati päevases annuses 20 mg/kg/päevas suu kaudu maosondiga [18]. Katse lõpuks (pärast 4 nädalat) kaaluti iga loom ja peene hepariniseeritud kapillaartoru abil võeti sabaveenist vereproov. Theneerudekstraheeriti, pesti soolalahusega ja jäeti proovipaberile kuivama.
Valgusmikroskoopiline uuringNeerproovid fikseeriti 10% formaliinis, dehüdreeriti etüülalkoholis, puhastati ksüloolis ja sisestati parafiinvahasse. Lõigati 5 µm paksused lõigud ja paigaldati slaididele. Teised sektsioonid paigaldati immunohistokeemia jaoks positiivselt laetud slaididele. Sektsioone töödeldi järgmiselt: — hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) ning Massoni trikroomiga värvitud lõigud valmistati vastavalt Suvarna et al. [24]; — histokeemiline hindamine: perioodiline happega Schiff (PAS) värvimine: PAS-värvitud lõigud valmistati vastavalt Suvarna et al. [24]; Bcl{4}-seotud X-valgu (BAX) immunohistokeemiline analüüs [20]. Valmistati parafiini sektsioonid. Seejärel lisati sektsioonidele 30 minutiks sobiv kogus seerumit. Endogeenne peroksidaas inaktiveeriti H2O2 sisaldava metanoolilahusega (1:50) 10 minutit ja pesti fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Kudelõigud blokeeriti 1,5-protsendilise seerumiga 30 minutiks. Sektsioone inkubeeriti primaarse antikehaga Bax (inimese BAX-i vastane valk, DakoCytomation, Taani), millele järgnes sekundaarne antikeha (universaalne biotinüülitud link kaubanduslikust komplektist LSAB: DakoCytomation, Taani). Seejärel inkubeeriti proove AB ensüümidega 30 minutit ja loputati PBS-s. Positiivsed signaalid tuvastati peroksidaasi kromogeensete substraatide abil. Negatiivne kontroll sisaldas sekundaarse antikeha asemel PBS-i.
Pildianalüüs ja morfomeetrilised mõõtmisedLeica LAS V3.8 pildianalüsaatori arvutisüsteemi (Šveits) abil hinnati järgmisi parameetreid:neeru-glomerulid ja proksimaalsed keerdunud tuubulid, laiusneeru-ruumi ja voodri proksimaalse torukujulise epiteeli kõrgus. Lisades hinnati struktuurselt muutunud glomerulite arvu protsendina glomerulite koguarvust. Samuti hinnati kollageenikiudude sisaldust. PAS-värvitud histoloogilistes lõikudes määrati täiendavalt Bowmani kapslite proksimaalsete keerdunud tuubulite basaalmembraani ja parietaalsete kihtide optiline tihedus. BCL2 immunohistokeemilises värvimispiirkonnas mõõdeti ka immuunreaktsiooni protsent.
Biokeemiline uuringRottidelt enne surmamist võetud vereproove kasutati Egiptuse Kairo ülikooli arstiteaduskonna biokeemia ja molekulaarbioloogia osakonnas biokeemiliseks hindamiseks.
Seerumi uurea ja kreatiniini tasehinnati tavapärase kolorimeetrilise meetodiga, kasutades Quanti Chrom TM analüüsikomplekte (DIUR-500 ja DICT-500), mis põhinevad vastavalt täiustatud Jungi ja Jaffe meetoditel [32]. Arvutati nende biokeemiliste parameetrite keskmised väärtused ja viidi läbi statistiline analüüs.
Malondialdehüüdi (MDA) ja redutseeritud glutatiooni (GSH) tase kudedes.Theneeru-kude homogeniseeriti 5–10 ml külmas puhvris (50 mM kaaliumfosfaat, pH 7,5, 1 mM EDTA) grammi koe kohta, seejärel tsentrifuugiti 100, 000 g juures 15 minutit 4 kraadi juures. Supernatant eemaldati analüüsiks ja säilitati jääl. Malondialdehüüdi test viidi läbi tiobarbituurhappe (TBA) testiga supernatandis vastavalt Buege ja Austi [4] soovitatud meetodile.MDA reageerib TBA-ga, andes punase ühendi, mis neelab lainepikkusel 535 nm. GSH mõõtmine põhines 5,5-ditiobis (2-nitrobensoehappe) (DTNB) redutseerimisel redutseeritud GSH-ga kollase ühendi saamiseks [6].
Statistiline analüüsSuhteliste keskmised väärtusedneerudkaalu, histomorfomeetrilisi mõõtmisi ja biokeemilisi tasemeid analüüsiti, kasutades SPSS versiooni 22. Statistiline hinnang viidi läbi ANOVA abil, millele järgnes Bonferroni paaride võrdlus.
TULEMUSED
Valgusmikroskoopiline hindamineKontrollrühma uurimine näitas, et selle arhitektuur oli puutumatuneeru-ajukoor. Theneeru-ajukoor moodustubneeru-veresooned ning proksimaalsed ja distaalsed keerdunud tuubulid (joonis 1A). Uurimineneeru-ACR rühma ajukoores ilmnesid märkimisväärsed struktuurimuutused. Theneeru-glomerulites ilmnes mõõdukas kuni märkimisväärne kokkutõmbumine, moonutus, segmentatsioon ja vakuolatsioon koos laienenud kuseteedega. Theneeru-tuubulid laienesid nende epiteeli kõrguse märgatava vähenemisega ja nende valendiku laienemisega. Nende vooderdavad rakud näitasid tsütoplasmaatilist vakuolatsiooni, rakkude killustumist ja intraluminaalset kipsi moodustumist paljudes keerdunud tuubulites. Interstitium näitas ülekoormatud veresooni koos sisekesta paksenemisega ja võis näha ka massilist rakulist infiltratsiooni (joonis 1B–D). RVS-rühma uurimine näitas enamiku glomerulite ja tuubulite peaaegu normaalset välimust. Täheldati minimaalset interstitsiaalset põletikulist rakulist infiltratsiooni (joonis 1E).
Kollageenikiudude sisaldusKiudude sisaldus oli kontrollrühmas minimaalne. Sisu suurenes Bowmani kapslite parietaalsete kihtide ja basaalmembraanide ümberneeru-tuubulid ACR (9-fold) ja RVS (2-fold) rühmades, kui need on seotud kontrollrühmaga. RVS-rühma sisaldus oli ACR-rühmaga võrreldes 70 protsenti madalam (joonis 2A–C, tabel 1).
Neerude histokeemiaKontrollrühmas basaalmembraanidneeru-tuubulid ja Bowmani kapslite parietaalsed kihid näitasid nõrka PAS-reaktsiooni. Lisades kõverdusid proksimaalse harja apikaalsed piirid
tuubulid (PCT) olid terved ja ummistasid osaliselt torukujulise valgusti (joonis 3A). Basaalmembraanidneeru-ACR-rühma tuubulites ja Bowmani kapslite parietaalsetes kihtides ilmnes intensiivne PAS-reaktsioon (42 protsenti kõrgem kui kontrollrühmal). Lisades nõrgenesid PCT apikaalsed harjapiirid (joonis 3B). RVS-i kasutamisel muutus PAS-i reaktsioon võrreldavaks kontrollrühmaga ja oli 19 protsenti madalam kui ACR-rühmas (joonis 3C, tabel 1).
Immunohistokeemiline värvimine BAXBAX näitas kontrollrühmas nõrka reaktsiooni (joonis 4A). BAX-i immunopositiivsete rakkude pindala protsent suurenes 45- korda ACR-rühmas, mis sobis kontrollrühmaga (joonis 4B, C, tabel 1). RVS-i kasutamisel vähenes immunopositiivsete rakkude pindala protsent ACR-rühmaga võrreldes 56 protsenti; pindala protsent RVS-rühmas oli aga 14-kord suurem kui kontrollrühmas (joonis 4D, tabel 1).
Biokeemilised ja oksüdatiivsed/antioksüdatiivsed markeridSeerumi kreatiniini ja uurea tase tõusis ACR-rühmas 275- korda, 19- korda, mis on seotud kontrollrühmaga. RVS-i samaaegsel kasutamisel vähenes kreatiniini ja uurea tase 51 protsenti, mis on 47 protsenti seotud ACR-iga. Sellegipoolest oli kreatiniini ja uurea tase RVS-i rühmas 83 protsenti, mis on 55 protsenti kõrgem kui kontrollrühmas (tabel 1).
Oksüdatiivse markeri (MDA) väärtused ACR-rühmas kasvasid 14- korda, samas kui antioksüdatiivse markeri (GSH) väärtused vähenesid kontrollrühmaga võrreldes 13- korda. RVS-i kasutamisel vähenes MDA tase 45 protsenti, samas kui GSH tase tõusis 83 protsenti võrreldes ACR rühmaga. Siiski oli mõlema markeri tase kontrollrühmast eemal (tabel 1).
Morfomeetrilised glomerulaar- ja PCT muutusedMõjutatud glomerulite protsent ACR-rühmas suurenes 8.{1}}korda, mis vastab kontrollrühmale. RVS-i kasutamisel vähenes mõjutatud glomerulite protsent 71 protsenti, mis võrdubACR rühm; RVS-i rühmas oli protsent aga 1.{1}}kord suurem kui kontrollrühmas (tabel 2).
ACR-rühmas vähenes glomerulaardiameeter 58 protsenti koos uriiniruumi laiuse suurenemisega 2.4-korda vastavuses kontrollrühmaga. RVS-i kasutamisel suurenes glomerulaardiameeter 126- korda, kus uriiniruumi laius vähenes 57 protsenti, mis võrdub ACR-rühmaga. Glomerulaardiameeter ja uriiniruumi laius olid RVS-is ja kontrollrühmades sarnased (tabel 2). ACR-rühmas suurenes PCT läbimõõt 31 protsenti, samas kui nende voodri epi kõrgusteelium langes kontrollrühmaga võrreldes 62 protsenti. RVS-i kasutamisel vähenes PCT läbimõõt 18 protsenti, samas kui nende vooderepiteeli kõrgus suurenes 14- korda, mis võrdub ACR-rühmaga. Mõlemad parameetrid olid RVS-i ja kontrollrühmades võrreldavad (tabel 2).
ARUTELUAkrüülamiidi poolt indutseeritud glomerulaarneneeru-kiindumus glomerulite kokkutõmbumise ja moonutamise kujul koos nende basaalmembraanide kortsumise ja kuseteede laienemisega. Lisades esines PCT-s märkimisväärselt degeneratiivseid torukujulisi muutusi. Nekrootilistel torukujulistel rakkudel ilmnes tsütoplasmaatiline vakuolatsioon torukujulises luumenis olevate epiteelirakkudega. Lisades kutsus ACR esile massilise põletikulise rakulise infiltratsiooni koos glomerulaarsete veresoonte ummikutega. Akrüülamiidist põhjustatud fibroos, mis tekkis kollageenikiudude 9-kordse sadestumise tõttu glomerulaarkapillaaride alusmembraanis. Sellised kollageenikiud võivad olla fibroblastide proliferatsiooni ja kollageeni sünteesi stimuleeriva epidermaalse kasvufaktori tulemus [14].Basaalmembraanidneeru-veresooned janeeru-ACR-rühma tuubulites ilmnes intensiivne PAS-reaktsioon (42 protsenti kõrgem kui kontrollrühmal). Torukujulise basaalmembraani paksenemine on atroofia tavaline tunnus ja seda võib seostada hüalinoosiga [14]. Paksenemine on ka PCT aktiivse transpordi vähenemise võimalik põhjus, mis põhjustab mikroalbuminuuriat [14].
ACR-rühma PCT harja piir katkes. Harja piiri kaotamine on proksimaalse torukujulise funktsiooni kahjustuse varaseim morfoloogiline märk [17, 27]. Lisaks mõjutab harja piiri kaotamine PCT reabsorptsioonivõimet, millega kaasneb glükoosi, soolade ja suures koguses vee kadu uriinis [17, 27]. See seletab enamasti täheldatud seroloogilisi muutusi (kõrgenenud uurea ja kreatiniini sisaldus seerumis). PCT läbimõõt suurenes ACR rühmas 31 protsenti, mis on enamasti kompenseeriv mehhanism, et säilitadaneerufunktsioon [15].
Oksüdatiivne stress on peamine patogeenne mehhanism, mille kaudu ACR indutseeribneerukahjustus. Oksüdatiivne stress on oksüdeerijate ja antioksüdantide vahelise tasakaalu nihe oksüdeerijate kasuks [3]. Paljud teadlased tõestasid ACR-i oksüdatiivse stressi rollineerud[23]. Oksüdatiivse markeri (MDA) väärtused ACR rühmas kasvasid 14- korda, samas kui antioksüdatiivse markeri (GSH) väärtused vähenesid 13- korda. Oksüdatiivne stress tekitab hapniku vaba radikaali (ROS), mis reageerib paljude biomolekulidega rakus, mis viib lõpuks oksüdatiivse kahjustuseni [16]. ROS-i hävitavad mitmed rakulised kaitsemehhanismid, mis hõlmavad mitteensümaatilist (GSH). GSH peroksidaasi valgud muudavad vesinikperoksiidi veeks ja lipiidiksperoksiidid vastavateks alkoholideks [30]. ACR-i pikaajaline kasutamine vähendas GSH aktiivsust. See tagajärg O2– ja H2O2 suurenenud tootmisele, mille tulemuseks on OH– tootmine [11]. Paljud teadlased uskusid, et MDA tase on piisav tõend oksüdatiivse stressi kohta [13] ja kõrgem MDA väärtus näitas lipiidide peroksüdatsiooni suurenemist.
Apoptoos on ka teine patogeenne mehhanism, mille kaudu ACR indutseeritakseneeru-kiindumus [23]. BAX-i reaktsioon suurenes ACR-rühmas 45- korda. BAX avaldab proapoptootilist aktiivsust [29]. Resveratool kui üks flavonoididest pakub kõrget kaitsetneerudnagu glomerulid janeeru-tuubulid olid peaaegu normaalsed. Võrreldes ACR rühmaga, on kollageenikiudude sisaldus ja PAS reaktsioonneeru-torukesed vähenesid 70, 19 protsenti. Lisaks vähenes kreatiniini ja uurea tase 51, 47 protsenti. Paljud teadlased registreerisid RVS-i eksogeense antioksüdantse kaitsva toimeneerud[21]. RVS kutsus esile sellise kaitsva rolli oma antioksüdantse toime kaudu, kuna MDA tase langes 45 protsenti, samas kui GSH tase tõusis 83 protsenti võrreldes ACR rühmaga. RVS takistab superoksiidi tootmist lahtiühendatud endoteeli lämmastikoksiidi süntaasist ja suurendab erinevate antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni [30]. Paljude flavonoidide antioksüdantne aktiivsus on tingitud hapnikuvabade radikaalide või ergastatud hapnikuliikide otsesest eemaldamisest, samuti ROS-i tootvate oksüdatiivsete ensüümide pärssimisest [26]. Teine RVS-i kaitsemehhanism on selle anti-apoptootiline toime. RVS-i kasutamisel vähenes immunopositiivsete BAX-rakkude pindala protsent ACR-rühmaga võrreldes 56 protsenti.
JÄRELDUSEDKokkuvõtteks võib öelda, et ACR põhjustab struktuurilisi ja funktsionaalseid häireidneerud. See kutsub esileneerukahjustusoksüdatiivse stressi ja apoptoosi kaudu. RVS-i kasutamisel on normaalneneerudarhitektuur säilis väikeste struktuurimuudatustega. RVS kaitseb oma apoptootiliste ja antioksüdantsete omaduste kaudu.
