Eelnev hirmuõpe võimaldab uute hirmumälestuste kiiret assimilatsiooni otse kortikaalsetesse võrkudesse, 3. osa

Eksperimentaalne disain

Andmete reprodutseeritavust hinnati erinevate kordustega (S1 tabel). Esimesed CNQX inaktiveerimiskatsed Te2-s (joonis 1A–1C) viidi läbi suurema arvu kordustega, kuna need olid esimesed katsed, mille me läbi viisime ja mida kasutasime meie uuringu peamise hüpoteesi testimiseks. Loomad määrati a priori erinevatesse käitumisrühmadesse kaaluga tasakaalustatud viisil. Igasse katserühma jaotati juhuslikult sama haudme isasloomad. Esmalt käsitlesime oma uuringu peamist hüpoteesi, st ajukoore inaktiveerimine võib erinevalt mõjutada uue hirmumälu kinnistamist eksperimentaalselt naiivsetel rottidel ja loomadel, kes olid teada saanud eelneva hirmusündmuse.

Isastel loomadel on äärmiselt tugev mälestus, sest neil on tugevam ellujäämisinstinkt ja soov paljuneda. Looduses ellujäävad loomad peavad keskkonnaga paremini kohanemiseks ja elu kaitsmiseks meeles pidama palju geograafilist teavet, toidutüüpe, röövloomade jälgi ja rühmaliikmete asukohti.

Näiteks peavad isaslõvid territooriumi ja nende staatuse kaitsmiseks meeles pidama kogu territooriumi staatust, liikmesuhteid ja konkurentide asukohti. Isased sebrad peavad ellujäämiseks ja paljunemiseks meeles pidama veeallikate ja toidu asukohta rohumaal. Üks soodafirma avaldas kord reklaami, mis näitas, et isane jääkaru mäletab sukeldujat ja tema ainulaadset lõhna, et ta saaks teda järgmisel korral tuvastada.

Seetõttu peavad isasloomad oma territooriumi kaitsmise, piisava toiduga varustamise ja järglaste paljunemise osas omama tugevaid mälestusi. See muudab need ka inimuuringutes olulisteks teemadeks, näiteks selliste haiguste uurimiseks nagu mäluhäired ja Alzheimeri tõbi.

Inimeste maailmas saame inspiratsiooni ammutada ka isasloomade mälust. Pidev kokkupuude uute asjadega, pidev õppimine ja mõtlemine võivad parandada meie mälu ja kohanemisvõimet ning parandada meie elatustaset ja töö tõhusust. Seetõttu õppigem isastelt loomadelt, jätkakem teadmiste ja kogemuste kogumist, omame tugevat ellujäämisinstinkti ja paljunemissoove ning loome paremat tulevikku. On näha, et me peame oma mälu parandama. Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Hakkliha tõhusus tuleneb selles sisalduvatest erinevatest toimeainetest, sealhulgas hapetest, polüsahhariididest, flavonoididest jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Klõpsake teada, kuidas ajufunktsiooni parandada

Nende rühmade statistiliste erinevuste korral viisime lõpuks läbi soolalahuse süstimise kaudu täiendavad kontrollrühmad. Sarnast lähenemist rakendati optogeneetilistes katsetes, kus AAV-kontrollrühm viidi läbi alles pärast statistiliste erinevuste tuvastamist naiivsete ja varem treenitud rottide vahel. Need katseplaanid võimaldasid meil vältida tarbetuid kontrollrühmi ja mittevajalike loomade kasutamist, mis on Euroopa ja Itaalia loomkatseid käsitlevate õigusaktide põhiprobleem (3 R põhimõte).

Käitumisprotseduurid

Kõik katsed viidi läbi päeva valgusfaasis (8.00–16.00). Loomi transporditi üksikult rajatisest katseruumidesse erinevatesse väikestesse läbipaistvatesse ämbritesse, sõltuvalt katsevajadustest.

Kuulmisõpe: esimene käitumisseanss. Kuulmishirmuga loomad (CS1-CS2). Selles rühmas võeti rotid õrnalt nende kodupuurist ja viidi pidamisruumist helikindlasse ruumi. Kohale jõudes pandi loomad konditsioneerimisseadmesse, mis koosnes ristkülikukujulisest mustast puurist (35 × 40 cm), mis oli varustatud roostevabast terasest varraste võrega (läbimõõt 1 cm, vahekaugus üksteisest 1,5 cm), mis oli ühendatud šoki kohaletoimetamise seadistusega.

Rotte jäeti 1 minutiks segamata. Selle aja möödudes manustati 7 konditsioneeritud stiimulit (CS), mis koosnesid 15 kHz sagedusega puhtast toonist (iga 15 s kestus, 80 dB, 36 s katseintervall). Iga tooni viimane 1 s oli seotud valuliku US-ga (0,5 mA, 1 s). Konditsioneerimisseansi lõpus toodi rotid tagasi oma kodupuuri.

Ainult šokiga loomad (šokk-CS2). Selles rühmas paigutati rotid sarnaselt samasse konditsioneerimisseadmesse. Vahetult pärast seda tehti igale rotile üksteise järel 7-jalgalöögid (1 s, 0,5 mA). Stimuleerimise lõppedes toodi loomad oma kodupuuri tagasi. Ajapüsivus konditsioneerimispuuris oli alla 9 sekundi. Varasemad uuringud näitasid, et see protseduur võimaldab vältida assotsiatiivseid protsesse valulike stiimulite ja sensoorsete stiimulite vahel [29,30].

Lõhnahirmuga loomad (odor-CS2). Selles rühmas paigutati rotid samasse ristkülikukujulisse musta puuri, mida kasutati ülaltoodud katserühmades, ja ühendati šoki kohaletoimetamise seadistusega. Rotte jäeti 2 minutiks segamata. Pärast seda aega manustati 7 vaniljelõhnadest koosnevat CS-d (igaüks 10 s, katseintervall 24 s). Iga lõhna viimane 1 s oli seotud valuliku US-ga (0,5 mA, 1 s). Konditsioneerimismoodul paigutati ventilatsiooniallika lähedusse, et vältida edastatud stiimulite püsimist pärast nende nihkumist. Puur oli tagatud ülemise võrega. Lõhnad esitati voolulahjenduse olfaktomeetri abil. Puhas õhk (1,5 L/min) suunati solenoidventiilile, mille käitamisel suunati õhk 15 ml pudelisse, mis sisaldas 10 ml vanillilõhna.

Ainult tooniga loomad (Tone-CS2). Selle rühma rotid paigutati samasse musta puuri ja neile esitati USA puudumisel 15- kHz toon (7 stiimulit, kestus 15 s, ITI 36 s).

Eelsäritatud loomad (Tone-CS1-CS2). Rotid paigutati konditsioneerimispuuri ja 1 minut hiljem esitati neile 20 korda ainult 15- kHz toon ning 24 tundi hiljem ühendati sama toon sellega, et USA sai CS1-ks.

Valge müra hirmuga loomad (WN-CS2). Selles rühmas paigutati rotid ristkülikukujulisse musta puuri ja jäeti 1 minutiks segamata. Pärast seda aega manustati 7 CS-d, mis koosnesid WN-st (iga 15 s kestus, 75 dB, 36 s katsetevaheline intervall). Iga tooni viimane 1 s oli seotud valuliku USA-ga (0,5 mA, 1 s). Konditsioneerimisseansi lõpus toodi rotid tagasi oma kodupuuri.

Kuulmishirmu õppimine: teine ​​käitumistreening. Kaks nädalat pärast ülaltoodud lõigus kirjeldatud protseduure koolitati loomi teise erineva kuulmishirmu kujundamise ülesande täitmiseks. Rotid pandi standardsesse nülgimiskasti, nagu meie eelmises töös [10], ja jäeti segamata 2 minutiks. Pärast seda aega edastati 7 CS-d, mis koosnesid 3 kHz sagedusega puhastest toonidest (iga 8 s kestus, 80 dB, 22 s katsetevaheline intervall). Iga tooni viimane 1 s oli seotud valuliku US-ga (0,5 mA, 1 s). Konditsioneerimisseansi lõpus toodi rotid tagasi oma kodupuuri.

Hirm mälu säilitamise pärast. Hiljuti CS2-le (3 kHz) omandatud kuulmishirmu mälu säilimist testiti 4 päeva hiljem. Optogeneetika katsete jaoks viidi hiljutise mälu test läbi laseriga 24 tundi pärast CS2-USA õppimist analoogselt ajaintervalliga, mille jooksul teostasime ajukoore inaktiveerimise CNQX-i manustamise kaudu (st 24 tundi pärast koolitus). Rotte harjutati konditsioneerimiseks kasutatavast erineva seadmega ja paigutati teise ruumi, et vältida kontekstuaalsete näpunäidete tõttu tingitud hirmukäitumist [10,62].

Uus aparaat koosnes läbipaistvast plastikust puurist, mille mustaks värvitud külg oli suletud väljatõmbeventilaatoriga varustatud helisummutavasse karpi, mis eemaldas korpusest lõhnava õhu ja tekitas 60 dB taustamüra. Loomadel lasti harjumuse ajal puuri uurida 5 minutit päevas. Hirmumälu säilitamise testi päeval edastasime pärast 2-minutilist tasuta uurimist 4 CS2 sagedusega 3 kHz (8 s–22 ITI), millele ei järgnenud ükski USA.

Kui eksperimentaalne nõudlus seda nõudis, testiti rotte kaughirmumälu säilimise suhtes, mis saadi 2 nädalat enne teist kuulmishirmu konditsioneerimise katset. Sel eesmärgil pandi loomad 7 päeva pärast hirmumälu säilitamise testi 3-kHz toonile uudsesse keskkonda (must-valgetriibuline puur) ja esitati seejärel 15-kHz toon. 36s intervalliga esitati neli tooni.

Kontekstuaalne koolitus: esimene käitumisseanss. Kontekstuaalne hirmu konditsioneerimisrühm (CtxA-CtxB). Selles rühmas võeti rotid õrnalt kodupuurist, pandi ämbrisse ja viidi pidamisruumist helikindlasse ruumi. Kohale jõudes paigutati loomad konditsioneerimisseadmesse, mis koosnes ülalmainitud ristkülikukujulisest mustast puurist, mis oli varustatud roostevabast terasest varraste võrega, mis oli ühendatud šoki kohaletoimetamise seadistusega. Rotte jäeti 1 minutiks segamata. Pärast seda aega manustati 5 USA-d (0,5 mA, 1 s) 51-sekundiliste intervallidega. Seansi lõpus toodi loomad oma kodupuuri tagasi.

Ainult šokirühm (šokk-CtxB). Kui rotid paigutati konditsioneerimisseadmesse, said nad kohe üksteise järel 5-jalašokke (1 s, 0,5 mA). Ajapüsivus konditsioneerimispuuris oli alla 7 sekundi. Varasemad uuringud näitasid, et see protseduur võimaldab vältida assotsiatiivseid protsesse valulike stiimulite ja sensoorsete stiimulite vahel [29,30].

Ainult šokirühm (šokk-CtxB). Kui rotid paigutati konditsioneerimisseadmesse, said nad kohe üksteise järel 5-jalašokke (1 s, 0,5 mA). Ajapüsivus konditsioneerimispuuris oli alla 7 sekundi. Varasemad uuringud näitasid, et see protseduur võimaldab vältida assotsiatiivseid protsesse valulike stiimulite ja sensoorsete stiimulite vahel [29,30].

Uus kontekstuaalne hirmu konditsioneerimine ja hiljutine hirmumälu säilitamine. Kaks nädalat pärast ülaltoodud lõigus kirjeldatud protseduure koolitati kõiki rühmi seostama uut kontekstuaalset keskkonda (skinner boxi moodul, mis asetati teise ruumi) valuliku US-ga (0,5 mA, 1 s) . Iga loom pandi uude kambrisse ja jäeti segamata 2 minutiks. Seejärel eksponeeriti seda 5 USA-s, eraldades vahedega 30 sekundit.

Kontekstuaalse hirmumälu säilimist testiti 4 päeva pärast hirmu konditsioneerimise protseduuri, pannes rotid uuesti 3 minutiks Skinneri kastikambrisse. Optogeneetika katsete jaoks viidi hiljutise mälu test läbi laseriga 24 tundi pärast CtxB-US õppimist analoogselt ajaintervalliga, mille jooksul CNQX-i manustamise kaudu teostasime kortikaalset inaktiveerimist (st 24 tundi pärast treeningut). Kui eksperimentaalne nõudlus seda nõudis, testiti rotte kaughirmumälu säilimise suhtes, pannes loomad 2 nädalat enne uut assotsiatsiooni USA-ga seotud konteksti.

Loomad viidi 2 erinevas ämbris konditsioneerimiskambritesse vastavalt erinevatele kontekstuaalsetele protseduuridele.

Külmutamismeede. Kõigis eksperimentaalsetes protseduurides määrati hirmumälu säilimise hindamine külmumisreaktsioonina [10], mida analüüsiti kui somaatilise liikuvuse täielikku puudumist, välja arvatud hingamisliigutused. Iga looma puhul mõõtsid külmutamisel veedetud aega (sekundites) võrguühenduseta 2 sõltumatut vaatlejat, kes olid loomarühmade suhtes pimedad.

Kirurgilised protseduurid

Valitud ainete manustamiseks sihtkohtadesse anesteseeriti rotid isofluraaniga: induktsioon viidi läbi 4% [maht/maht] 2 l/min meditsiinilises õhus ja pikendati pideva kokkupuuteni 2% [maht/maht]) kui rotid paigaldati stereotaksilisse aparaati.

Koljusse tehti sisselõige ja puuriti väikesed augud, et võimaldada 28-mõõturiga infusiooninõela läbistamist. Ainete manustamiseks kasutati 10-ul Hamiltoni süstalt, mis oli paigaldatud infusioonipumbale. Pärast infusioone jäeti nõel paigale veel 3 minutiks. Seejärel suleti sisselõige roostevabast terasest haavaklambritega ja loomale süstiti naha alla valuvaigistit/põletikuvastast ketoprofeeni (2 mg/kg kehakaalu kohta) ning looma hoiti soojas ja jälgiti kuni anesteesiast taastumiseni.

Nagu varasemates uuringutes [10, 32–34], ei olnud loomade kanüülimine vajalik, kuna aktiivseid ühendeid manustati otse stereotaksiliselt. See protseduur on kasulik, kuna välditakse püsiva kanüüli paigaldamisega kaasnevat kirurgilist traumat, mis piirab traumat ühe nõela läbistamisega [10,32–34]. Tõepoolest, üldanesteesia ei mõjuta oluliselt mälu konsolideerimist [10, 32–34]. Tagamaks, et õppekatsega seotud ühendite manustamise ajastus oli täpne, nii et rotid said valitud ühendeid umbes 1 tund ja umbes 1 päev pärast treeningut, indutseeriti isofluraanesteesia 5 minutit enne kavandatud süstimise ajastust, nt kell 55. min rottidel, keda raviti 60 minutit pärast treeningut ja 23 tundi ja 55 minutit loomadel, kellele süstiti 24 tundi pärast treeningut. Iga rotti konditsioneeriti ja seejärel opereeriti eraldi. Erinevatesse käitumisrühmadesse kuuluvate loomadega manipuleeriti põimitud viisil.

AMPA/kainaatglutamaadi retseptorite selektiivne inhibiitor CNQX ({{0}}tsüano-7-nitrokinoksaliin-2, 3-dioon) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] lahustati steriilses soolalahuses (NaCl, 0,9%) ja pH reguleeriti HCl-ga 7,4-ni. Valgusünteesi inhibiitor anisomütsiin (Merck, 125 ug/ul) lahustati ekvimolaarses HCl-s, lahjendati steriilse soolalahusega ja reguleeriti pH väärtuseni 7,4 NaOH-ga. Vehiikli kontrollina kasutati steriilset soolalahust (0,9% NaCl). Neid aineid süstiti kahepoolselt kiirusega 0,1 ul/min ja ruumalaga 0,5 ul ühe koha kohta järgmiste Paxinose ja Watsoni atlase [26] stereotaksiliste koordinaatidega, kusjuures Te2 kortikaalne väli on viidatud Zilles'i atlasele [25]:

Sekundaarne kuulmiskoor (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Eesmine tsingulaarne ajukoor (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Süstimismaht (0,5 ul ühe koha kohta) valiti varasemate uuringute põhjal, kus aktiivseid ühendeid süstiti täiskasvanud rottidele Te2 [10,34] ja ACC-sse [55,63].

Dorsaalse hipokampuse inaktiveerimiseks süstiti aktiivseid ühendeid mahus 0,6 ul saidi kohta järgmiste stereotaksiliste koordinaatidega:

Dorsaalne hipokampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Selja hipokampuse pöördumatud kahjustused kutsuti esile NMDA (Tocris, 18 ug/ul, lahustatud steriilses soolalahuses, 0,4 ul koha kohta) manustamise teel kiirusega 0,1 ul/ min eelnimetatud koordinaatide punktides. Samu koordinaate kasutati soolalahusega süstitud kontrollide ja võltsoperatsiooniga loomade puhul.

Red Retrobeads (Lumafluor, 1:2 lahjendus soolalahuses, 0,6 ul) süstiti BLA-sse vastavalt järgmistele koordinaatidele: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

Katsete lõpus kontrolliti histoloogiliselt nõelajälgi CNQX, anisomütsiini või soolalahuse süstimise korral või kahjustuste laienemist NMDA süstide korral. Rotid anesteseeriti sügavalt ja perfuseeriti intrakardiaalselt 4% formaldehüüdiga. Nende aju lõigati krüostaadil 30 μm. Nissl-värvitud seerialõigud valmistati tavapärase protseduuri abil ja lõigud kontrolliti histoloogiliselt mikroskoobi all, mida suurendati 2, 5 ×.

Optogeneetilised katsed

Viiruse süstimine. Adeno-seotud viirus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-kirss ja kontrollvektor AAV5:CaMKII -cherry saadi Põhja-Carolina Ülikoolist Vector Core (Chapel Hill, Põhja-Carolina, Ameerika Ühendriigid). See viiruse tiiter oli 5:8 mõlema viiruse puhul 5,8 × 10^12 vg/ml. CaMKII promootori kasutamine võimaldab transgeeni ekspressiooni, soodustades püramiidseid neuroneid. Viirusi hoiti –80˚C sügavkülmas. Te2-le või ACC-le suunatud viirusinfusioonid viidi läbi ülaltoodud stereotaksilistel koordinaatidel 0, 5 ul iga augu kohta. Viirust süstiti kiirusega 0,1 ul/min ja nõel jäeti paigale veel 5 minutiks. Viiruse süstid viidi läbi 4 nädalat enne optogeneetilisi katseid.

Valgustus.

Optilised kiud (Plexon, südamik 200/230 μm; pikkus 10 mm) implanteeriti kahepoolselt BLA-sse (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm bregmast). Te2 projektsioonide BLA või ACC projektsioonide optogeneetiline inhibeerimine BLA-le saadi, kasutades laserdioodiga ühendatud PlexBright optogeneetilist stimulatsioonisüsteemi (Laserglow Technologies). Tekib kollane valgus (589 nm), mis lastakse läbi optilise kiu. Optilise kiu tipu hinnanguline võimsustihedus oli projektsioonikohtade valgustamiseks 10–15 mW. Hirmumälu säilitamise ajal käivitati valguse emissioon 4 s enne tooni algust, püsis kogu tooni vältel ja peatati 4 s pärast tooni nihet. Kontekstuaalse hirmu konditsioneerimise rühma kuuluvad loomad said valgust stimulatsiooni kogu konteksti uurimise ajal (3 minutit). Enne mälu säilitamise katset tutvustati rotte plaastri juhtmega 2 päeva.

Immunohistokeemia. Pärast optogeneetika katsete lõpetamist anesteseeriti rotid sügavalt ja perfuseeriti intrakardiaalselt 4% PAF-iga, et uurida viiruse difusiooni. Ajud lõigati lahti, hoiti üleöö temperatuuril 4 °C ja viidi lõpuks üle 30% sahharoosile. Koronaalsed lõigud (30 μm) lõigati krüostaadil ja koguti PBS-i. Vabalt ujuvaid sektsioone inkubeeriti blokeerivas lahuses 1 tund toatemperatuuril. Seejärel inkubeeriti neid mCherry-vastases hiire primaarses monoklonaalses antikehas (lahjendus 1:500, Abcam) blokeerivas lahuses öö läbi toatemperatuuril. Seejärel pesti sektsioone PBS-ga ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril sekundaarse fluorestseeruva AlexaFluor-568 hiirevastase antikehaga (1:600, Invitrogen), mis oli lahjendatud PBS-is. Sektsioone pesti PBS-s, paigaldati DAPI-d (Vector) sisaldava paigalduskandjaga ja katteklaas kaeti.

Sarnaselt koguti ka nende rottide ajud, kellele tehti NMDA süsti. Vabalt ujuvaid sektsioone inkubeeriti pärast mitut loputamist primaarse monoklonaalse hiire anti-Neuni (1:1, 000 lahjendus, Merck) antikehaga blokeerivas lahuses üleöö toatemperatuuril. Seejärel pesti sektsioone PBS-ga ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril biotinüülitud hobuse hiirevastase antikehaga (lahjendus 1:200, Vector). Avidiini-biotiini kompleks (ABC kompleks 1:100, Vector, 2 tundi ja pool inkubatsioonist) ühendati Neuni värvimiseks diaminobensidiiniga (0, 03%, Merck). Seejärel loputati sektsioone PBS-is ja kanti üle želatiiniga kaetud alusklaasidele, dehüdreeriti ja kaeti katteklaasiga.

Retrohelmestega süstitud rottide Te2 sektsioone inkubeeriti toatemperatuuril üleöö primaarse polüklonaalse küüliku Fos-vastase antikehaga (1:2, 000, raku signaalimine) blokeerivas lahuses. Seejärel pesti viilud PBS-ga ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril küülikuvastase Alexa 488-ga (1:1, 000, Invitrogen, PBS-is). Lõpuks pesti immunomärgistatud sektsioone PBS-is, paigaldati želatiiniga kaetud alusklaasidele ja kaeti DAPI-ga täiendatud kinnitusmeediumiga.

Mikroskoopia

mCherry märgistust uuriti Zeiss Airyscan konfokaalse mikroskoobiga: kasutati kahte laserit (405 ja 561 nm), kumbki vastas DAPI (Nissl plekk rakutuumade jaoks) ja Alexa 568 (mCherry) maksimaalsele emissioonispektrile. ), vastavalt. Viiruse difusiooni analüüsimiseks süstekohtades saadi Te2 ja ACC mikropildid mosaiikpiltidena (igaüks saadi 10-kordse objektiivi abil). Axoni terminale BLA-sse analüüsiti, kasutades 40-kordset objektiivi 10 sektsioonist koosneva z-virnana, mis paiknesid üksteisest 1 μm kaugusel (159 μm ruut; suumifraktsioon, 1,0).

Retrohelmestega süstitud loomade puhul, kellele tehti cFos immunomärgistamine, saadi kujutised 40-kordse suurendusega (159 μm ruut; suumifraktsioon, 1.0) kolme erineva laseriga, mis vastavad maksimaalsele emissioonispektrile. DAPI (Nissl plekk raku tuumade jaoks), AlexaFluor 488 (cFos) ja Texas Red (Retrobeads) jaoks. 0,7 μm suurused lõigud saadi mööda 10- μm z-virna. CFos, helmestega märgistatud ja topeltpositiivseid (märgistatud cFos+ beads) ekspresseerivate tuumade arv kvantifitseeriti iga looma kohta Te2 piirkonnas anteroposteriorsete koordinaatide juures 6,7–7,3 mm kaugusel bregmast [10]. Seejärel keskmistati andmed, et saada iga looma keskmine ja tulemusi võrreldi statistiliselt. Neuni DAB-värvimisega sektsioonide pilte analüüsiti Neurolucida tarkvara abil, mis oli ühendatud mikroskoobiga värvilise CCD-kaamera kaudu [10].

Andmete analüüs ja välistamiskriteeriumid

Iga rühma n määrati a priori vastavalt meie varasematele uuringutele [10, 16, 17], varem avaldatud töödele selles valdkonnas (vt viiteid ACC [6, 22, 55] ja Te2 [10, 59] kohta), ja G-võimsuse hinnangute kaudu vastavalt järgmisele tabelile (tabel 1):

Iga analüüsi jaoks hindasime iga rühma lõplikuks keskmiseks arvuks 8–10 looma. Rühmad viidi läbi sisekontrollidega samas katseseansis (S1 tabel). Arvestades kirurgiliste ja käitumuslike protseduuride varieeruvust, kaasasime a priori suurema arvu katsealuseid (kuni 15% rohkem), kes mõnel juhul vastasid katsekriteeriumidele ja kaasati, vältides seega meelevaldset väljajätmist. Hippokampuse uuringute puhul tasakaalustasime NMDA ja CNQX süstide mõju erinevate ajavahemike järel kontrollloomade koguarvu kandja ja võltsoperatsiooniga rottide vahel erinevates rühmades.

Käitumisanalüüs, histoloogiline kontroll ja rakkude loendus viidi läbi pimesi. Loomad, kellel oli nõelaraja või kahjustuse ebapiisav lokaliseerimine NMDA-pöördumatute kahjustuste korral, jäeti andmete analüüsist välja (S1 tabel). Farmakoloogilistes uuringutes jätsime nõela vale asetuse tõttu välja 57 looma kokku 465 loomast (22/255 Te2 puhul, 31/179 ACC puhul ja 4/31 hipokampuse puhul). Jälgimisuuringutes 21 loomaga elimineerisime 3 katsealust, kelle puhul retrobeadide süstimisel BLA-d ei saavutatud. Te2 optogeneetika uuringutes, milles osales kokku 30 looma, jätsime välja 1 roti, kuna optiliste kiudude paigutus ei olnud sihtpiirkonnast kõrgemal, 1 rott. Lõppude lõpuks puudus viirus Te2 ja 2 rotil, kuna viiruse difusioon oli vastavalt alla 4,7% ja 5,3% Te2 pindalast süstekohtades. Statistilisse analüüsi kaasatud rottidel oli minimaalne viiruse difusioon 39,6% eesmise stereotaksilise koordinaadi ja 50,2% tagumise stereotaksilise koordinaadi korral.

Samamoodi elimineeriti ACC optogeneetika katsetes kokku 32 loomaga 2 rotti, kuna optiliste kiudude paigutus ei olnud sihtpiirkonnast kõrgemal. Kaks rotti jäeti välja, kuna viirus ACC-s puudus, 1 loom, kuna viirus oli külgnevas sekundaarses motoorses ajukoores, ja 1 rott, kuna viiruse difusioon moodustas süstekohtades alla 2,3% ACC pindalast. Ülejäänud rottidel oli minimaalne viiruse difusioon eesmise stereotaksilise koordinaadi juures 33,3% ja tagumises koordinaadis 42,2%.

NMDA kahjustuste uuringutes olid kahjustused enamasti suunatud dorsaalse hipokampuse CA1 piirkonnale. Hipokampuse kahjustuste minimaalne (punane) ja maksimaalne pikenemine (roosa) kogu dorsaalse hipokampuse piirkonnas olid vastavalt 23,2% ja 53,5% eesmises stereotaksilises koordinaadis ning 28,3% ja 62,3% tagumises koordinaadis. Kokku 73 loomast elimineeriti 4 rotti kahjustuse puudumise tõttu, samas kui veel 3 looma jäeti kõrvale, kuna kahjustuste laienemine oli alla 5.{13}}% (nimelt 4,8%, 4,3%, 3,1). %), mis puudutab hipokampuse piirkonda kahel koordinaadil.

Piirkonna kontuuride analüüs viidi läbi visuaalse kontrolli ja käsitsi kvantifitseerimise teel, kasutades tarkvara ZEN 3.{2}} piirkonnakontuuri tööriista. Seejärel normaliseeriti pindala väärtused piirkonna kogupindalaga. Te2, ACC ja hipokampuse stereotaksilised koordinaadid põhinesid Paxinose atlasel [26] ja Te2 puhul ajukoore väljal, mis viidati Zilles'i atlasele [25].

Statistiline analüüs

Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Kõik andmed läbisid Levene dispersioonide võrdsuse testi. Seega kasutati kõigis katsetes parameetrilist statistikat. Kahe rühma andmeid võrreldi 2-sabaga paarita Student t-testide abil. Mitme rühma võrdlusi hinnati 1-viisi ANOVA testi ja Tukey post hoc testiga. Rühmadevaheliste ja -siseste erinevuste käsitlemiseks arvutasime 3 × 2 segadisainiga ANOVA mudeli, mille vaheline rühm (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) subjektide muutuja ja seisund (enne ja pärast hiljutist konditsioneerimist + süstimist) kui subjektisisese muutuja. Kui rühma × tingimuste interaktsioon oli oluline, teostasime lihtsa peamiste mõjude analüüsi ja kohandasime iga p-väärtust Bonferroni korrektsiooniga. Iga segatud ANOVA mudeli puhul hindasime sfäärilisuse eeldust Mauchly sfäärilisuse testi abil.

Statistilised parameetrid (st iga rühma n täpne väärtus, SEM, statistiline test, efekti suurus ja täpne p-väärtus) on esitatud legendides. Võrdsete valimisuuruste korral määrati paaritute t-testide efekti suurused, arvutades Coheni d või Glassi d vastavalt SD-de sarnasusele, samas kui erinevate valimi suuruste puhul Hedges'g. Rakkude arvu ja külmumise vahelised seosed arvutati Pearsoni koefitsiendi abil. Et teha kindlaks, kas andmed vastasid statistilise lähenemise eeldustele, lükkasime nullhüpoteesi P < 0,05 tasemel tagasi. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi SPSS Statistics 22 (IBM) abil.

Toetav teave

S1 Joonis. Näitena valitud CNQX-i süstitud Te2 (A) ja ACC ajukoore (B) nõelajälgede suurendamine. (C) Kui 2 nädalat pärast protseduuri kujutati sama kontekstiga, näitasid ainult šokiga loomad madalat hirmureaktsiooni, mis näitab, et protseduur ei kutsunud esile konditsioneeritud külmutamist šoki edastamise kontekstis. (D) Sarnased tulemused nagu joonisel 1 saadi CS-na kasutatavate kahe tooni (CS1, 3 kHz ja CS2, 15 kHz) tasakaalustamisel (õpilase t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glassi d=4.14). (E) odor-CS-ga konditsioneeritud rottidel oli lõhnani külmutamine 2 nädalat pärast konditsioneerimist kõrge isegi siis, kui neid testiti konditsioneerimise kontekstis erinevas keskkonnas, näidates sellega, et hirm oli konkreetselt seotud selle märguande edastamisega. Skaalavardad, 300 μm. ��P < 0,01. Kõik andmed on keskmised ja SEM-id. S1 joonise Fig kokkuvõtlikud andmed leiate tugiteabest failis nimega S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Joon. CNQX süstimine kahjustas hiljutiste kuulmishirmu mälestuste säilimist rottidel, kus hirmu üldistamist vähendas ainult toon, mis oli eelnevalt kokku puutunud, või valge müra tooni kasutamine CS1-na. 3 × 2 segakujundusega ANOVA (rühma põhiefekt: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, tingimuse põhimõju: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, rühm × tingimuste interaktsioon F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) näitas, et külmutamine 3 kHz toonile enne selle seostamist USA-ga oli madalam loomadel, kes said 15 kHz tooni eelsärituse enne 15 kHz-USA sidumist (n=10, p=0.001) või valge müraga konditsioneeritud rottidel (n=13 , p=0,008) võrreldes CS1-CS2 loomadega (n=22), kes näitasid muutuvat hirmu üldistamise vastust. Kuid pärast CS-US õppimist ja cnqx süstimist Te2 ajukoores oli hiljutine hirmumälu kõigis rühmades halvenenud (p > 0,05). Lihtne põhiefekt rühmades (enne ja pärast CS-USA õppimist, millele järgneb cnqx süstimine): CS1-CS2, p=0.025; Toon-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Kõik andmed on keskmised ja SEM-id. S2 joonise kokkuvõtlikud andmed leiate failist S1 Supporting Figure Data tugiteabest. (TIF)

S3 Joon. (A) Juhuslik näide retrobeadide süstimisest, mis on suunatud BLA-le. (B ja C) Näited optiliste kiudude paigutustest BLA kohal loomadel, kellele on süstitud AAV vektoreid Te2 (B) ja ACC ajukoores (C). Skaalavardad, 500 μm.

Tänuavaldused

Täname dr E. Manasserot pideva toetuse ja nõuannete eest.

Autori kaastööd

Kontseptualiseerimine: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Andmete kureerimine: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formaalne analüüs: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Rahastamise omandamine: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Uurimine: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metoodika: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Juhendaja: Benedetto Sacchetti.

Kinnitamine: Benedetto Sacchetti.

Kirjutamine – originaalkavand: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Kirjutamine – arvustus ja toimetamine: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Viited
1. Frankland PW, Bontempi B. Hiljutiste ja kaugete mälestuste korraldus. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Konsolidatsioonide neurobioloogia ehk kui stabiilne on engramm? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Mälu konsolideerimine. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Mälu konsolideerimine ja mediaalne temporaalsagara: lihtne võrgumudel. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Miks on hipokampuses ja neokorteksis täiendavad õppesüsteemid: ülevaated konneksionistlike õppimis- ja mälumudelite õnnestumistest ja ebaõnnestumistest. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com