Eelkonditsioneerimisega aktiveeritud AKT kontrollib neuronaalset tolerantsust isheemia suhtes MDM2-p53 raja kauduⅠ

Abstraktne

Üks olulisemaid eelkonditsioneerimise vahendatud neuroprotektsiooni mehhanisme on raku apoptoosi nõrgenemine, mis kutsub esile aju tolerantsuse pärast järgnevat kahjustavat isheemiat. Selles kontekstis mängib antiapoptootiline PI3K / AKT signaalirada võtmerolli rakkude diferentseerumise ja ellujäämise reguleerimisel.

Click to cistanche tubulosa pulberneuroprotektsioon

On teada, et aktiivne AKT suurendab hiire topeltminuti-2 (MDM2), E3-ubikvitiini ligaasi, mis destabiliseerib p53, et soodustada vähirakkude ellujäämist, ekspressiooni. Neuronites näitasime hiljuti, et MDM2–p53 interaktsiooni võimendab farmakoloogiline eelkonditsioneerimine, mis põhineb NMDA glutamaadi retseptori subtoksilisel stimulatsioonil, mis hoiab ära isheemiast põhjustatud neuronaalse apoptoosi.

Siiski pole teada, kas see mehhanism aitab kaasa neuronite tolerantsuse tekkele isheemilise eelkonditsioneerimise (IPC) ajal. Siin näitame, et IPC indutseeris AKT PI3K-vahendatud fosforüülimise Ser473 juures, mis omakorda fosforüülis MDM2 Ser166 juures. See fosforüülimine vallandas MDM2 tuuma stabiliseerumise, mis viis p53 destabiliseerumiseni, hoides seega ära neuronaalse apoptoosi isheemilise insuldi korral. PI3K / AKT raja pärssimine wortmanniiniga või AKT vaigistamisega kutsus esile tsütosoolse MDM2 akumuleerumise, tühistades IPC-indutseeritud neuroprotektsiooni.

Seega suurendab IPC PI3K / AKT signaaliraja aktiveerimist ja soodustab neuronite tolerantsust, kontrollides MDM2-p53 interaktsiooni. Meie leiud pakuvad uut mehaanilist rada, mis on seotud IPC-indutseeritud neuroprotektsiooniga AKT signaaliülekande moduleerimise kaudu, mis viitab sellele, et AKT on potentsiaalne terapeutiline sihtmärk isheemilise kahjustuse vastu. Märksõnad: AKT; MDM2; p53; PI3K; isheemiline tolerants; eelkonditsioneerimine

1. Sissejuhatus

Inimestel on ajutine isheemiline atakk (TIA) ilmnenud endogeense eelkonditsioneeritud seisundina, millel on kasu insuldihaigete funktsionaalsetest tulemustest [1–3]. Endogeenset neuroprotektsiooni, mis on indutseeritud lühikese subtoksilise isheemilise stiimuliga, mida nimetatakse isheemiliseks eelkonditsioneerimiseks (IPC), peetakse strateegiaks arenevas isheemilise kahjustuse vastase neuroprotektsiooni valdkonnas [4–6].

Tõendid näitavad, et IPC-ga soodustatud neuroprotektsioon sõltub transkriptsioonist, translatsioonist ja translatsioonijärgsetest mehhanismidest, mis muudab võtmevalkude funktsiooni pärast isheemiat [6–11]. Kuid IPC-indutseeritud isheemilise tolerantsi (IT) mehhanismi ei ole inimese ajus täielikult selgitatud [12, 13].

Uute eksperimentaalsete lähenemisviiside väljatöötamine IPC-vahendatud neuroprotektsiooni mõistmiseks on võimas vahend aju IT aluseks olevate endogeensete mehhanismide dešifreerimiseks [6], millel on potentsiaal paljastada uudseid terapeutilisi sihtmärke, mille eesmärk on minimeerida ajukahjustusi insuldihaigetel. Viimase kahe aastakümne jooksul on apoptootiline neuronite rakusurm positsioneeritud ajuisheemia kahjustusega seotud olulise mehhanismina [14–16]. Selles mõttes on proteiinkinaasi B või AKT, seriini/treoniini kinaas, mis nõuab funktsionaalse fosfoinositiidi kinaasi (PI3K) aktiveerimist, peetud isheemiajärgse neuroprotektiivse ravi oluliseks sihtmärgiks [17, 18].

Hiljuti näitasime, et PI3K / AKT signaaliraja pärssimine suurendab neuronite vastuvõtlikkust eksitotoksilisusele [19]. AKT osaleb keerulises apoptootilises signaalivõrgus [20], mille komponendid võivad olenevalt koetüübist esineda erinevates subtsellulaarsetes kohtades [21,22]. Südames on AKT osalenud eelkonditsioneerimisega soodustatud kardioprotektsioonis [23].

Tõendid näitavad ka, et fosforüülitud AKT soodustab neuronite ellujäämist ajuisheemia alguses [24]. Kuigi AKT aktiveerimine võib kaasa aidata IT indutseerimisele ajus [25], on selle IPC-vahendatud aktiveerimise täpne mehhanism endiselt raskesti mõistetav. Kasvajarakkudes viib PI3K / AKT signaaliraja aktiveerimine MDM2 fosforüülimiseni Ser166/186 juures, mis soodustab MDM2 tuuma translokatsiooni [26, 27] ja suurendab selle ubikvitinatsiooni aktiivsust [28].

Tuumas seondub MDM2 p53-ga ja soodustab selle ubikvitineerimist ja sellele järgnevat proteasoomide lagunemist, mis pärsib p53 funktsiooni [29]. Stressitingimustes võib p53 vallandada ka MDM2 üleekspressiooni, mis vastupidiselt pärsib p53 aktivatsiooni negatiivse tagasiside ahelas [30]. PI3K inhibeerimine takistab AKT aktivatsiooni [31] ja MDM2 fosforüülimist eelkonditsioneeritud südames [32].

Selles kontekstis leidsime varem, et in vivo aju eelkonditsioneerimine vähendas infarkti mahtu pärast mööduvat keskmise ajuarteri oklusiooni (tMCAO), suurendades MDM2 valgu taseme ekspressiooni. Järelikult nõrgendas MDM2–p53 kompleks isheemiast põhjustatud p53/PUMA/kaspaas-3 signaaliraja aktivatsiooni primaarsetes kortikaalsetes neuronites [33].

Siin uurime PI3K / AKT signaaliraja rolli IPC-vahendatud neuronite taluvuses järgneva isheemilise kahjustuse vastu, samuti selle aluseks olevat mehhanismi ning keskendume peamiselt võimalikule seosele AKT aktiveerimise ja MDM2-p53 kompleksi vahel. .

2. Tulemused

2.1. IPC-promoted neuroprotection

Vahendatud on AKT fosforüülimine Ser473 juures, MDM2 fosforüülimine Ser166 juures ja p53 destabiliseerimine. Varem kirjeldasime MDM2–p53 interaktsiooni mõju neuronite vastuvõtlikkusele isheemiale [34] ja IT [33]. Siin uurisime AKT potentsiaalset rolli IPC-vahendatud neuroprotektsioonis kandidaadina, kes osalevad MDM2–p53 rajas.

Esiteks kinnitasime, et isheemia soodustas AKT aktivatsiooni neuronites, mida tõendab AKT fosforüülimine Ser473 juures. Nagu on näidatud joonisel fig 1A, indutseeris lühike (20 minutit) OGD märkimisväärselt p (Ser473) AKT ja MDM2 ekspressiooni, samas kui AKT valgu tase jäi muutumatuks (joonis S1A). Siiski ei täheldatud AKT fosforüülimist, kui neuronid allutati pikaajalisele OGD-le (90 minutit). Lisaks olid MDM2 valgu tasemed madalamad, mis on kooskõlas p53 valgu kõrgema ekspressiooniga, nagu on näidatud joonisel 1A.

Mdm2 ekspressiooni ajast sõltuv ülesreguleerimine pärast OGD-d (joonis 1B) kinnitab, et alaäge isheemia võib olla oluline mehhanismide esilekutsumiseks, mis takistavad p53 stabiliseerumist pärast OGD-d, nagu eelnevalt kirjeldatud [33]. IPC mudelina kasutasime lühikest OGD-d (20 min), millele järgnes 2-tunnine reoksüdeerimine (joonis S1B) [33]; seega analüüsisime neuronite ekstrakte, mis koguti pärast OGD-d (OGD / R) või pärast OGD-d, millele eelnes IPC-protokoll (IPC pluss OGD / R), kogutud 4-tunnise reoksügeenimise järel. Paralleelselt inkubeeriti neuroneid normoksia (Nx) või eelkonditsioneerimise (IPC) seadetes (joonis S1B).

Nagu on näidatud joonistel 1C ja joonistel S1C, indutseeris IPC AKT varajase aktiveerimise, nagu näitas fosforüülimine Ser473 juures [35], millele järgnes MDM2 valgu stabiliseerumine ja fosforüülimine Ser166 juures. IPC takistas ka OGD/R poolt indutseeritud p53 stabiliseerumist (joonis 1C). Huvitaval kombel näitasid joonisel 1D näidatud immunofluorestsentskujutised, et IPC soodustas AKT fosforüülimist Ser473 juures neuronites, mis akumuleerusid valdavalt tuumas, ja vähendas p53 stabiliseerumist pärast OGD/R-i (IPC pluss OGD/R), võrreldes eelkonditsioneerimata neuronitega (OGD). /R).

Järelikult hoidis IPC ära OGD/R põhjustatud neuronaalse apoptoosi ja kaspaasi -3 aktivatsiooni, mõõdetuna vastavalt voolutsütomeetria (joonis S1D) ja fluorimeetriatestidega (joonis S1E). P53 rolli kinnitamiseks IPC-vahendatud neuroprotektsioonis kasutasime neuroneid, mis ekspresseerivad (metsikut tüüpi; wt) või mitte (knockout; ko) p53 valku. Meie tulemused näitavad, et neuronid, millel puudus p53 (joonis S1F), olid OGD-indutseeritud apoptoosi suhtes resistentsemad kui p53 wt neuronid.

Veelgi enam, apoptoositasemed p53KO neuronites olid sarnased eelkonditsioneeritud (IPC pluss OGD/R) wt neuronite puhul täheldatuga (joonis S1G), kinnitades seega p53 destabiliseerimise võtmerolli IPC-vahendatud neuroprotektsioonis [33]. Meie tulemused näitavad, et IPC indutseeris neuroprotektsiooni isheemilise insuldi vastu mehhanismi kaudu, mis hõlmab AKT fosforüülimist Ser473 juures, MDM2 stabiliseerimist ja fosforüülimist Ser166 juures ning p53 destabiliseerimist.

2.2. IPC käivitab MDM2 fosforüülimise Ser166-s PI3K / AKT raja kaudu

PI3K/AKT signaalirada on seotud neuronaalse IT-ga nii in vitro [36] kui ka in vivo [37]. Siiski on PI3K / AKT raja IPC-vahendatud aktiveerimise roll MDM2-p53 kompleksi reguleerimisel uurimata. Selle selgitamiseks inkubeeriti neuroneid PI3K/AKT raja pöördumatu ja spetsiifilise inhibiitori wortmanniiniga [19].

Nagu on näidatud joonisel fig 2A, tühistas wortmannin IPC-ga täiustatud (Ser473) AKT fosforüülimise ja p53 destabiliseerimise, nagu on näidatud joonisel fig 1D. Need tulemused viitavad otsesele seosele AKT aktivatsiooni ja pärast OGD/R-i indutseeritud p53-vahendatud neuronaalse apoptoosi (joonis S1D) ja kaspaasi-3 aktivatsiooni (joonis S1E) inhibeerimise vahel. P53 stabiliseerimise peamine regulaator MDM2 on AKT sihtmärk [26], mis fosforüülib MDM2 Ser166 ja Ser186 juures [26]. PI3K inhibeerimine wortmanniiniga takistas nii (Ser473)AKT kui ka (Ser166)MDM2 IPC poolt indutseeritud fosforüülimist (joonis 2B).

IPC poolt indutseeritud MDM2 spetsiifilist Akt-vahendatud fosforüülimist Ser166 juures kinnitati väikese segava RNA (siRNA) kasutamisega, mis on spetsiaalselt loodud AKT1 valgu (siAkt) vastu, mida ekspresseeritakse tugevalt kortikaalsetes neuronites ja mille aktiivsus on oluline neuronite ellujäämiseks pärast isheemiat. 38]. Nagu on näidatud joonisel 3, vähendas siAkt AKT ja p(Ser473)AKT valgu kogutaset 3. päeval pärast transfektsiooni nii HEK-293T-rakkudes (joonis 3A) kui ka kortikaalsetes neuronites (joonis 3B).

Lisaks takistas AKT knockdown (siAkt) (Ser166) MDM2 fosforüülimist (joonis 3B). Need tulemused näitavad, et IPC-aktiveeritud PI3K / AKT signaalirada soodustab MDM2 fosforüülimist Ser166 juures, mis võib olla vastutav MDM2 stabiliseerimise ja sellest tuleneva p53 destabiliseerimise eest pärast isheemilist vigastust.

2.3. IPC-aktiveeritud AKT käivitab tuuma MDM2 valgu stabiliseerimise pärast isheemiat

AKT aktiveerimine on olnud seotud MDM2 tuuma translokatsiooniga kasvajarakkudes [26]. Arvestades tuuma MDM2 stabiliseerimise olulisust neuronite ellujäämisel pärast isheemiat [34] ja täpsemalt selle neuroprotektiivset rolli IPC-s [33], otsustasime täiendavalt uurida PI3K / AKT signaaliraja olulisust MDM2 subtsellulaarse lokaliseerimise reguleerimisel. valk.

Seega transfekteeriti neuronid või HEK{0}}T-rakud inimese MDM2-märgistatud valguga (MDM2-GFP). Transfekteeritud HEK-293T-rakkude tüüpilised blotid ja inimese MDM2 valku ektoopiliselt ekspresseerivate neuronite kujutised pärast nelja erinevat katsetingimust (Nx, IPC, OGD/R ja IPC pluss OGD/R) on näidatud joonistel 4A ja joonistel S1H. , vastavalt.

MDM{0}} GFP ektoopiline ekspressioon kinnitas, et IPC soodustab MDM2 tuuma akumulatsiooni võrreldes eelkonditsioneerimata isheemiliste (OGD/R) või normoksiliste (Nx) neuronitega (joonis 4A, B), nagu näitas tuuma/tsütosoolse fluorestsentsi suhte kvantifitseerimine. (joonis S2B) ja MDM2-GFP tuumafluorestsentsi intensiivsus (joonis S2C).

2.4. IPC soodustab p(Ser473)AKT ja MDM2 interaktsiooni, mis suurendab MDM2 stabiliseerumist tuumas ja vähendab indutseeritud neuronaalset apoptoosi isheemia korral

Pärast PI3K / AKT raja IPC-ga täiustatud aktiveerimise rolli demonstreerimist MDM2 tuuma stabiliseerimisel uurisime täiendavalt, kas p (Ser473) AKT ja MDM2 interakteerusid tuumas (joonis 6A). MDM2 immunosadestamine tuumavalgu ekstraktidest, millele järgnes immunoblotanalüüs MDM2 ja p(Ser473)AKT vastu, näitas, et IPC soodustas pärast OGD/R-i interaktsiooni p(Ser473)AKT ja MDM2 vahel, vältides seega OGD/R-indutseeritud tuuma p53 stabiliseerumist. nagu on näidatud tuuma sisendis (joonis 6A).

Lõpuks uurisime PI3K / AKT raja katkemise kahjulikku mõju neuronaalsele apoptoosile (joonis 6B). AKT inhibeerimine neutraliseeris IPC kaitsva toime enne OGD-d, mis kinnitab AKT-MDM2 neuroprotektiivset rolli IT kontekstis. Seega näitavad meie tulemused, et IPC indutseerib AKT fosforüülimist ja aktiveerimist, mis soodustab MDM2 fosforüülimist Ser166 juures ja tuuma translokatsiooni, kus see interakteerub p (Ser473) AKT-ga. See mehhanism võib kaasa aidata MDM2 tuuma stabiliseerimisele, mis mängib olulist rolli IPC-indutseeritud isheemilises tolerantsuses.

Kuidas Cistanche neuroneid kaitseb?

Mõned tõendid viitavad sellele, et Cistanche võib kaitsta neuroneid, vähendades apoptoosi (programmeeritud rakusurma) ja soodustades neuronite ellujäämist. Apoptoos on loomulik protsess, mis toimub kehas kahjustatud või soovimatute rakkude eemaldamiseks, kuid see võib olla kahjulik, kui seda esineb liigselt või sobimatult. Laboratoorsetes uuringutes on leitud, et Cistanche pärsib apoptoosi ja see toime võib aidata kaitsta neuroneid kahjustuste eest.

Lisaks sisaldab Cistanche mitmeid bioaktiivseid ühendeid, millel on tõestatud neuroprotektiivne toime. Näiteks sisaldab see ehhinakosiidi, mis on näidanud, et see kaitseb neuroneid oksüdatiivse stressi ja põletiku eest. See sisaldab ka akteosiidi, millel on leitud olevat põletikuvastased ja antioksüdantsed omadused.

Jätkub...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 ja Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Salamanca ülikooli funktsionaalse bioloogia ja genoomika instituut, CSIC, 37007 Salamanca, Hispaania; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); ireen_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Salamanca biomeditsiiniliste uuringute instituut, Salamanca ülikooli haigla, Salamanca ülikool, CSIC, 37007 Salamanca, Hispaania

3 Biokeemia ja molekulaarbioloogia osakond, Salamanca Ülikool, 37007 Salamanca, Hispaania 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Hispaania} * Corres {{55pondence} ; Tel.: pluss 34-923-29-4908