PRAT 1 Cistanches Deserticola PhG-RE inhibeerides ERS apoptoosi mehhanismi, et kaitsta müokardi rakkude apoptoosi H2O2- indutseeritud endoplasmaatilise retiikulumi stressi eest

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Farmaatsia osakond, Jilini ülikooli Hiina-Jaapani liiduhaigla, Changchun 130033, Hiina

Kirjavahetus tuleks adresseerida Qian Yu-le; yuqian@jlu.edu.cn

Saabunud 9. juunil 2020; Muudetud 15. juulil 2020; Vastu võetud 24. juulil 2020; Avaldatud 25. septembril 2020

Akadeemiline toimetaja: Michel Mansur Machado

Autoriõigus © 2020 Tianwei Lan ja Qian Yu. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamislitsentsi alusel, mis lubab piiramatut kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes kandjatel, eeldusel, et originaalteosele viidatakse õigesti.

RohiCistanchedeserticolaomab mõningaid müokardi kaitsvaid toimeid. Selles uuringus üritati selgitada mehhanismi, mille abil PhG-RE kaitseb müokardirakke, ja kontrollida, kas see kaitse toimub endoplasmaatilise retikulumi stressiga (ERS) seotud apoptoosimehhanismi reguleerimise kaudu. Roti müokardi rakke eksponeeriti 150 ug ml-1 PhG-RE-ga 24 tunniks ja seejärel 18 tunniks 100 μmol ml-1 H2O2-ga, et indutseerida ERS ja luua rakukahjustuse mudel. Katse täpsuse kinnitamiseks kasutati spetsiifilist ERS-i aktivaatorit Thapsigargin (TG) ja ERS-i inhibiitorit 4- fenüülvõihapet (4-PBA). Meie tulemused näitasid, et PhG-RE parandas märkimisväärselt rakkude elujõulisust, kaitses rakke ning vähendas rakukahjustusi ja apoptoosi. PhG-RE mängis ERS-i inhibiitori 4-PBA-ga sarnast rolli müokardirakkude kaitsmisel apoptoosi ja ER-stressist põhjustatud kahjustuste eest. Lisaks nõrgendas PhG-RE märkimisväärselt ERS-iga seotud apoptootiliste faktorite GRP78, CHOP ja kaspaas-12 mRNA ekspressiooni ning ERS-iga seotud apoptootiliste faktorite GRP78, CHOP, kaspaas-12 valgu ekspressiooni, ja p-JNK. Kokkuvõttes näitavad need leiud, et PhG-RE võib tõhusalt kaitsta müokardi rakke ja vähendada rakkude apoptoosi ja kahjustusi, mis võivad olla seotud ERS-iga seotud apoptoosi reguleerimisega.

1. Sissejuhatus

Cistanche deserticola(C. deserticola) on üks traditsioonilises Hiina meditsiinis kasutatavatest taimsetest taimedest, mis kasvab kõrbekeskkonnas. Thefenüületanoidglükosiid-rikas ekstrakt (PhG-RE) on selle peamine aktiivne komponentC. deserticola. Uuringud on leidnud, et PhG-RE võib kaitsta müokardi isheemia-reperfusiooni (I/R) kahjustuse eest [1].

Kui ERS hakkab esinema müokardi rakkudes, suureneb glükoosiga reguleeritud valgu 78 (GRP78) tase, et antagoniseerida ERS-indutseeritud vigastust. ERS-i edenedes algab apoptoos ja CCAAT-i/võimendajat siduva valgu homoloogse valgu (CHOP), c-Jun N-terminaalse kinaasi (JNK) ja tsüsteinüülaspartaadi spetsiifilise proteinaasi-12 (kaspaas{{8) ekspressioon. }}) suureneb. Näiteks suureneb oluliselt GRP78, CHOP ja lõhustatud ATF6 (c-ATF6) ekspressioon HF-ga rottide müokardirakkudes ning PERK (p-PERK), IRE1 (p-IRE1) ja p-JNK aktiveeruvad. [2]. Lisaks suurendab I/R vigastusest indutseeritud ERS GRP78 ja CHOP ekspressiooni [3]. PERK ja eIF2 fosforüülimise tasemed on suurenenud [4]. Pro-apoptootiliste valkude Bax ja Caspase-3 ekspressioon suureneb, põhjustades rakkude rebenemist ja müokardi ümberkujunemist [5] ning müokardiinfarkti pindala ja müokardi ensümaatiline aktiivsus suureneb [3]. Meie varasemate uuringute käigus leiti, et PhG-RE võib kaitsta müokardi isheemia-reperfusioonikahjustuse eest ja võib märkimisväärselt vähendada I/R-i indutseeritud müokardiinfarkti piirkonda [1]. Siiski on ebaselge, kas PhG-RE võib inhibeerida ERS-iga seotud apoptoosi ja seeläbi vähendada müokardi rakkude kadu ja apoptoosi. Selles uuringus töödeldi rakke eelnevalt PhG-RE-ga, et jälgida, kas PhG-RE võib inhibeerida H2O2-indutseeritud ERS-i ja seega vähendada müokardi rakkude kadu ja apoptoosi. Tapsigargiini (TG), spetsiifilist ERS-i aktivaatorit ja 4-fenüülvõihapet (4-PBA), ERS-i inhibiitorit, kasutati täiendavaks kontrollimiseks, kas ERS-i vahendamine võib tõhusalt vähendada raku apoptoosi ja kas see protsess. on seotud GRP78, CHOP, JNK ja Caspase{40}} ekspressioonitasemetega, mis vahendavad ERS-iapoptoos.

Cistanche võib takistada raku apoptoosi

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Reaktiivid.

Materjalide ja meetodite jaotis peaks olema ammendav, et kõiki protseduure saaks korrata. Kui kirjeldatakse mitut meetodit, võib selle jagada pealkirjaga alajaotisteks. H9c2 roti müokardi rakud saadi Hiina Teaduste Akadeemia rakupangast (Shanghai, Hiina).C. deserticolaCistanchedeserticolaPhG-RE saadi firmast Changchun Medicinal Material Co. (Changchun, Hiina), identifitseeris dr Zhong-ying Liu (Jilini ülikooli farmaatsiateaduste kool) ja hoiustati Jilini ülikooli farmaatsiaosakonna herbaariumis (vautšeri näidis number: YQCD2014). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) saadi ettevõttest GIBCO (Grand Island, NY). Thapsigargin ja 4-PBA saadi firmalt Sigma (St. Louis, MO). Laktaatdehüdrogenaasi (LDH) aktiivsuse analüüsi komplekt ja CCK-8 komplekt osteti ettevõttelt Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Jaapan). Veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttest HyClone (Utah, USA). Anneksiin V-FITC raku apoptoosi testi komplekt osteti ettevõttelt Beyotime Biotechnology (Shanghai, Hiina). Trüpsiin osteti ettevõttelt Beijing Solarbio Life Sciences (Peking, Hiina). ReverTra Ace qPCR RT komplekt osteti ettevõttelt TOYOBO (Tokyo, Jaapan). FastStart Universal SYBR Green master mix (Rox) osteti firmalt Roche (Basel, Šveits).

2.2. Antikehad.

Küüliku polüklonaalsed GADD153/CHOP ja küüliku polüklonaalsed GRP78/HSPA5 Abs osteti ettevõttest Novus (Colorado, USA). Hiire/roti kaspaas-12 afiinsusega puhastatud polüklonaalne Ab osteti ettevõttelt R&D Systems (Minnesota, USA). Fospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) küüliku ja -aktiini (13E5) küüliku mAb osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Massachusetts, USA). Fluorestseeruvad sekundaarsed Abs osteti ettevõttelt LI-COR Biosciences (Nebraska, USA).

2.3. Rühmitused ja ravi.

H9c2 rakud logaritmilises kasvufaasis valiti välja ja neid töödeldi järgmistes rühmades: (1) kontrollrühm: H9c2 müokardirakke kasvatati täissöötmes; (2) PhG-RE rühm: rakke töödeldi 24 tundi söötmes, mis sisaldas 150 ug mL-1 PhG-RE; (3) ERS-indutseeritud vigastuste mudelrühm (H2O2 rühm): rakke töödeldi 18 tundi söötmes, mis sisaldas 100 μmol ml-1 H2O2; (4) (PhG-RE) -H2O2 rühm: rakke töödeldi 24 tundi söötmes, mis sisaldas 150 ug ml-1 PhG-RE ja seejärel 18 tundi 100 μmol ml-1 H2O2; (5) (4-PBA)

–H2O2 rühm: rakke töödeldi 24 tundi söötmes, mis sisaldas 5 mmol·mL-1 4-PBA-d, ja seejärel 18 tundi 100 μmol·mL-1 H2O2-s; (6) TG rühm: rakke töödeldi

18 tundi söötmes, mis sisaldab 50 nmol·mL-1 TG; ja (7) (PhG-RE)-TG: rakke töödeldi 24 tundi söötmes, mis sisaldas 150 ug·mL-1 PhG-RE, ja seejärel 18 tundi 50 nmol·mL-1 TG-s.

2.4. Rakukultuur.

H9c2 müokardirakke kultiveeriti DMEM-is, mis sisaldas 10% FBS-i ja 1% penitsilliini-streptomütsiini, temperatuuril 37 kraadi inkubaatoris 5% CO2-ga. Täielik sööde vahetati iga 2 päeva järel. Rakke vaadeldi mikroskoobi all ja need kasvasid hästi fusiformis. Kui kasvutihedus jõudis 70–85 protsendini, subkultuuriti rakke vahekorras 1:4.

2.5. CCK-8 Rakkude elujõulisuse hindamine.

H9c2 rakke uuriti mikroskoopiliselt ja valiti logaritmilises kasvufaasis olevad rakud. Rakususpensioon saadi trüpsiiniga lõhustamise teel ja tsentrifuugiti 5 minutit 5 ml tsentrifuugituubis kiirusel 1000 p/min-1. Pärast jääkvedeliku äraviskamist kasutati rakupelletite resuspendeerimiseks 100 μl süvendi kohta 3 ml täielikku DMEM söödet ja

Mikroskoobi all loendati 5.0 103 rakku. Rakud viidi 96-süvendiga plaadile ja kultiveeriti inkubaatoris (37 kraadi, 5 protsenti CO2) 24 tundi, et saada täielikult kleepuvad rakud. Optilist tihedust (OD) mõõdeti lainepikkusel 450 nm.

Rakkude elujõulisus (protsent) (OD katserühm – OD tühi rühm)/(OD kontrollrühm – OD tühi rühm) × 100 protsenti .

2.6. Rakukahjustuse spektrofotomeetriline mõõtmine.

Laktaatdehüdrogenaas (LDH) on tsütoplasmas olev ensüüm, mis vabaneb rakukahjustuse korral ja mis seejärel eksisteerib stabiilselt söötmes. Rakukahjustuse astet saab määrata LDH aktiivsuse mõõtmisega söötmes. See katse viidi läbi vastavalt komplekti juhistele. OD mõõdeti lainepikkusel 490 nm. Igas rühmas oli kolm kaevu.

2.7. Apoptoosi tuvastamine anneksiin V-FITC/PI värvimisega.

Supernatant eemaldati ja viidi voolutsütomeetria katsutisse. Rakususpensioon valmistati kleepunud rakkudega trüpsiini lagundamise anuma põhjas. Pärast suspensiooni tsentrifuugimist 6 minutit temperatuuril 1.2 103 r min-1, supernatant visati ära ja rakusademeid pesti kolm korda PBS-ga. See katse viidi läbi vastavalt anneksiin V-FITC raku apoptoosi komplekti juhistele. Pärast rakkude kultiveerimist 15 minutit toatemperatuuril pimedas analüüsiti rakke voolutsütomeetriga.

2.8. GRP78, CHOP, JNK ja kaspaasi suhtelise mRNA ekspressiooni RT-qPCR mõõtmine-12.

Kogu raku RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga. Kaks mikroliitrit kogu RNA-d eraldati geelelektroforeesiga, et hinnata ekstraheerimise terviklikkust. OD (260)/OD (280) väärtuse mõõtmiseks ja arvutamiseks kasutati spektrofotomeetrit. Kogu RNA pöördtranskribeeriti cDNA saamiseks vastavalt TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT komplekti juhistele. Tabelis 1 on toodud praimerite loend. Roche FastStart Universal SYBR Green põhisegu (Rox) juhiste kohaselt olid reaktsioonitingimused järgmised: esialgne denatureerimine 95 kraadi juures 10 minutit, 95 kraadi juures 10 sekundit, 58 kraadi juures 30 sekundit ja 72 kraadi juures 30 sekundit. s kokku 45 tsüklit.

2.9. GRP78, CHOP, JNK, p-JNK ja kaspaasi valgu ekspressiooni Western blot analüüs-12.

Valgulüsaat (50 ug) eraldati elektroforeesiga 10% eraldusgeelil, millele järgnes ülekandmine PVDF membraanile. PVDF membraan blokeeriti toatemperatuuril 90 minutiks TBS-resolutsioonis, mis sisaldas 5 protsenti lõssi. Blokeeritud PVDF membraani inkubeeriti üleöö antikehadega 1, 2, 3 ja 4 4 kraadi juures ning seejärel 90 minutit toatemperatuuril kitse küülikuvastase IgG-ga (1:1000). Lõpuks töötati membraan välja kahevärvilise infrapuna laserpildisüsteemiga.

2.10. Statistilised ja analüütilised meetodid.

Selle uuringu andmeid töödeldi SPSS 24.0 tarkvaraga ja tulemused on esitatud keskmistena ± SD. Mitme rühma andmeid võrreldi ANOVA-ga, samas kui kahe rühma andmeid võrreldi t-testidega. Väärtust P < 0,05="" peeti="" statistiliseks="" olulisuseks.="" valguribade="" halltoonide="" väärtuste="" kvantitatiivseks="" analüüsimiseks="" kasutati="" tarkvara="">

FenüületanoidGlükosiididsissecistanche

3. Tulemused

3.1. PhG-RE mõju rakkude elujõulisusele.

Nagu on näidatud joonisel 1, ei muutunud võrreldes kontrollrühma omaga H9c2 rakkude elujõulisus PhG-RE rühmas oluliselt (P > 0.05), kuid rakkude elujõulisus rakkude arv nii H2O2 kui ka TG rühmas vähenes märkimisväärselt. Võrreldes H2O2 rühmaga, suurenes rakkude elujõulisus nii (PhG-RE)-H2O2 kui ka (4-PBA)-H2O2 rühmas oluliselt. Võrreldes TG rühmaga, suurenes rakkude elujõulisus (PhG-RE)-TG rühmas märkimisväärselt. Kõik tulemused olid statistiliselt olulised (P <>

3.2. PhG-REoni rakukahjustuse mõju.

Nagu on näidatud joonisel 2, olid PhG-RE rühma rakud võrreldes kontrollrühma omadega kahjustatud, kuid see kahjustus ei saavutanud statistilist tähtsust (P > 0.{16}}5). Rakukahjustused H2O2 ja TG rühmas suurenesid märkimisväärselt. Võrreldes H2O2 rühmaga vähenes rakkude vigastus (PhG-RE)-H2O2 ja (4-PBA)-H2O2 rühmades oluliselt (P < 0.01).="" võrreldes="" tg="" rühmaga,="" vähenes="" rakukahjustus="" (phg-re)-tg="" rühmas="" märkimisväärselt="" (p=""><>

3.3. PhG-RE mõju raku apoptoosile.

Nagu on näidatud joonisel 3, ei muutunud rakkude apoptoos kontrollrühmaga võrreldes PhG-RE rühmas oluliselt (P > 0.05), samas kui H2O2 ja TG rakkude apoptoos rühmade arv suurenes oluliselt (P < 0,01).="" võrreldes="" h2o2="" rühma="" omaga="" on="" (phg-re)-h2o2="" ja="" (4-pba)-h2o2="" raku="">

rühmade arv vähenes oluliselt (P < {{0}},01).="" võrreldes="" tg="" rühmaga,="" vähenes="" (phg-re)-tg="" rühma="" rakkude="" apoptoos="" märkimisväärselt="" (p=""><>

3.4. PhG-RE mõju GRP78, CHOP, JNK ja kaspaas-12 mRNA ekspressioonile.

Suhtelist mRNA ekspressiooni igas katserühmas mõõdeti kvantitatiivselt RT-qPCR abil. Nagu on näidatud joonisel 4, suurenes GRP78, CHOP ja kaspaasi-12 suhteline mRNA ekspressioon kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärselt (P < 0.01)="" h2o2="" rühm="" ja="" jnk="" suhteline="" mrna="" ekspressioon="" suurenes="" samuti="" (p="">< 0.05).="" tg="" rühmas="" suurenes="" grp78,="" chop,="" jnk="" ja="" kaspaasi{11}}="" suhteline="" mrna="" ekspressioon="" märkimisväärselt="" (p="">< 0.01).="" võrreldes="" h2o2="" rühmaga="" vähenes="" grp78,="" chop="" ja="" kaspaasi-12="" suhteline="" mrna="" ekspressioon="" (phg-re)-h2o2="" ja="" (4-="" pba)-h2o2="" rühmades="" oluliselt="" (p="">< 0,01),="" samas="" kui="" jnk="" suhteline="" mrna="" ekspressioon="" ei="" muutunud="" oluliselt="" (p=""> 0,05). Võrreldes TG rühma omaga vähenes GRP78, JNK ja kaspaasi-12 suhteline mRNA ekspressioon (PhG-RE)-TG rühmas (P < 0,01)="" ja="" chop="" suhteline="" mrna="" ekspressioon="" ei="" vähenenud.="" oluliselt="" muutuda="" (p=""> 0,05).

3.5. PhG-RE mõju GRP78, CHOP ja kaspaasi valgu ekspressioonile-12.

Joonisel 5 on näidatud GRP78, CHOP ja kaspaasi-12 valgu ekspressioonitasemed. Võrreldes kontrollrühma omaga suurenes nende kolme valgu ekspressioon H2O2 ja TG rühmades pärast rakkude töötlemist märkimisväärselt (P < 0.01).="" võrreldes="" h2o2="" rühmaga,="" vähenes="" grp78,="" chop="" ja="" kaspaas{11}}="" ekspressioon="" (phg-re)-h2o2="" ja="" (4-pba)-h2o2="" rühmades="" oluliselt="" (p="">< 0,01)="" .="" võrreldes="" tg="" rühmaga,="" vähenes="" grp78,="" chop="" ja="" kaspaasi="" -12="" ekspressioon="" (phg-re)-tg="" rühmas="">

3.6. PhG-RE mõju JNK-le ja p-JNK-le.

Nagu on näidatud joonisel 6, suurenes p-JNK ekspressioon kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärselt H2O2 ja TG rühmades (P < 0.01).="" võrreldes="" h2o2="" rühmaga="" vähenes="" p-jnk="" ekspressioon="" (phg-re)-h2o2="" ja="" (4-="" pba)-h2o2="" rühmades="" oluliselt="" (p="">< 0.{{24}="" }1).="" võrreldes="" tg="" rühmaga,="" vähenes="" p-jnk="" ekspressioon="" (phg-re)-tg="" rühmas="" oluliselt="" (p="">< 0,01).="" mis="" puudutab="" jnk="" ekspressiooni,="" siis="" üheski="" katserühmas="" ei="" toimunud="" olulisi="" muutusi="" (p=""> 0,05).

Cistanchesaab ära hoidakamberapoptoos