Võimalikud pisarate biomarkerid Parkinsoni tõve diagnoosimiseks – pilootuuring Ⅰ

Kokkuvõte: Parkinsoni tõbi (PD) on Alzheimeri tõve järel teine ​​kõige levinum neurodegeneratiivne haigus. Selles uuringus uuriti idiopaatilise PD (iPD, n=24), E46K-SNCA mutatsiooni kandjate (n=3) ja terve kontrolli (CT, n {{4) patsientide pisaraproteoomi profiili. }}) katsealuseid analüüsiti, et tuvastada PD diagnoosimiseks vajalikke biomarkereid. Viidi läbi vaatlus-, prospektiivne ja juhtumikontrolli pilootuuring, milles uuriti osaleja pisaraproove nano-vedelikkromatograafia-massispektromeetria (nLC-MS/MS) abil ja hinnati nende neuroloogilisi kahjustusi. Saadud proteoomilised andmed on saadaval ProteomeXchange'is identifikaatoriga 10.6019/PXD028811.

Klõpsake Amway Parkinsoni tõve vastuvõtmiseks

Need analüüsid viisid 560 pisaravalgu tuvastamiseni, millest mõned olid PD patsientidel dereguleeritud ja mis on seotud immuunvastuste, põletiku, apoptoosi, kollageeni lagunemise, valgusünteesi, kaitse, lipiidide transpordi ja lüsosomaalse funktsiooni muutustega. Nendest valkudest kuus olid seotud neurodegeneratiivsete protsessidega ja näitasid suurepärast võimet klassifitseerida patsiente ja kontrolle. Need leiud näitasid, et PD patsientide pisarates olid teatud valgud ülesreguleeritud, peamiselt lüsosomaalse funktsiooniga seotud valgud. Seega tuvastati selles uuringus, et pisaravalgud on seotud neurodegeneratsiooniga, mis võib olla seotud PD patsientide agressiivse haiguse fenotüübiga.

Märksõnad: biomarkerid; Parkinsoni tõbi; pisarakile; lüsosoom

1. Sissejuhatus

Parkinsoni tõbi (PD) on Alzheimeri tõve (AD) järel teine ​​kõige levinum neurodegeneratiivne haigus ja seda iseloomustab liikumiste aeglus (bradükineesia), suurenenud lihastoonus (jäikus), värisemine (treemor) ja kehaasendi kontrolli halvenemine. Patoloogiliselt kinnitatud PD korral esineb erinev kogus ja ladestumine valesti volditud alfa-sünukleiini (-syn) Lewy kehade (LB) ja Lewy neuriitide kujul kesknärvisüsteemis (KNS). See varieeruvus nende struktuuride akumulatsioonis peegeldab tõenäoliselt selle haiguse kliinilist heterogeensust [1–3]. Tõepoolest, Lewy kehahaiguste (LBD) spektris on mitu kliinilist häiret, sealhulgas idiopaatilise (IPD) ja geneetilise PD-ga patsiendid ning LB-dega dementsuse all kannatavad patsiendid. Üks peamisi väljakutseid neurodegeneratiivsete haigustega tegelemisel on leida kliinilisi markereid, mis võimaldavad varakult klassifitseerida patsiente ja aidata jälgida haiguse progresseerumist.

Selliseid tegureid nagu oksüdatiivne stress, proteolüüs ja muutunud rasvhapete või fosfolipiidide kontsentratsioonid on seostatud -syn struktuurimuutustega ning translatsioonijärgsed modifikatsioonid võivad samuti muuta -syn suurust, struktuuri või valgukoormust [4]. Dereguleeruvad mutatsioonid ja paljunemised -syn geenis (SNCA) põhjustavad PD autosomaalselt domineerivaid perekondlikke vorme [5]. Võib-olla on kõige patogeensem PD-d esile kutsuv mutatsioon E46K mutatsioon in -syn (E46K-SNCA), mis on agressiivsete geneetiliste LBD-de rühma aluseks, millel on kliinilised ja patoloogilised tunnused, mis meenutavad dementsust LB-dega [6, 7]. Kuigi mutatsioonid -syn-is on haruldased, pakuvad need ainulaadset võimalust PD-ga patsientide tuvastamiseks ja nende patoloogiate progresseerumise paremaks mõistmiseks.

On teada, et PD patsientidel tekivad väiksemates kogustes hallutsinatsioonid, muutused silmade ja silmalaugude liikumises ning pisarate koostis [8,9]. Lisaks silmapinna kahjustustele võivad need patsiendid kogeda muutusi akommodatsioonis, nägemisteravuse langust, skotoomide moodustumist (piirkonnad, kus nende vaateväli on osaliselt vähenenud või täielikult degenereerunud) ja võrkkesta kihtide hõrenemist, eelkõige vähenemise tõttu. närvikiudude arvus [10,11]. Puudused neurotransmissioonis ja monoamiinide metabolismis mõjutavad ka patoloogilisi muutusi PD patsientide nägemissüsteemis [12].

Need muutused on üsna tüüpilised, kuna monoamiinid on seotud visuaalse teabe edastamisega võrkkestas [13]. Lisaks võivad PD patsientidel tekkida muutused silma eesmise osa innervatsioonis, mis võib lõpuks muuta pisarate koostist. Paljud neurotransmitterid ja troofilised ained erituvad pisarates, mis pärinevad vesivedelikust või sarvkesta läbivatest närvidest [14].

Nende seoste aluseks olevad rakulised ja molekulaarsed mehhanismid on aga veel täielikult välja selgitamata. Kuna PD mõjutab mitmeid mittemotoorseid süsteeme ja perifeerseid närve, võib nendel patsientidel pisarate sekretsioon muutuda ja pisaravalgu koostisel võib olla nendel patsientidel iseloomulik profiil, mis võib toimida diagnostilise biomarkerina. Selles mõttes võib E46K-SNCA ja iPD-ga patsientide pisaravalkude analüüs aidata tuvastada kasulikke kandidaatbiomarkereid PD diagnoosimiseks ja progresseerumiseks.

Seetõttu oli käesoleva uuringu eesmärk analüüsida pisarate proteoomi profiili iPD-ga patsientidel ja E46K-SNCA mutatsiooni kandjatel, et leida biomarker, mis võiks aidata PD tulevikus diagnoosida, kasutades mitteinvasiivseid proove.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Uuringu kohort

Kavandasime vaatlusliku, prospektiivse juhtumikontrolli pilootuuringu, milles osales 24 iPD-ga patsienti, 3 E46K-SNCA mutatsiooni kandjat ja 27 tervet isikut (CT). Selle uuringu viisid läbi meditsiinilise kvalifikatsiooniga töötajad pärast OSI Ezkerralde-Enkaterri-Crucesi eetikakomitee CEIC E18/47 heakskiidu saamist. Uuring viidi läbi rangelt kooskõlas Helsingi deklaratsiooni inimsubjektidega seotud biomeditsiiniliste uuringute põhimõtetega. Enne proovide võtmist saadi kõigilt katsealustelt allkirjastatud teadlik nõusolek pärast uuringu olemuse ja võimalike tagajärgede selgitamist. Patsiendid värvati Cruces'i ülikooli haigla (Barakaldo, Bizkaia, Hispaania) neuroloogia- ja oftalmoloogiateenistuse üksustesse ambulatoorsete konsultatsioonide käigus kokkulepitud kaasamis- ja välistamiskriteeriumide alusel. IPD-ga patsiendid vastasid Parkinsoni tõve Ühendkuningriigi ajupanga kriteeriumidele PD diagnoosimiseks ja neil ei olnud teadaolevaid mutatsioone.

CT-de kaasamise kriteeriumid pidid olema üle 40-aastased, mõlemast soost ja ilma ühegi neuroloogilise häireta kliinilise ajaloota. Uuringusse kaasati isikud, kellel oli (või kellel on anamneesis) mis tahes süsteemne või silmahaigus/seisund. Välistamiskriteeriumid hõlmasid silmaoperatsiooni eelneva kolme kuu jooksul, kroonilisi silmaravimeid (nt glaukoomi korral), allergiat, mis tahes paikselt manustatavat ravimit (välja arvatud kunstpisarad) või kortikosteroide sisaldavaid suukaudseid ravimeid, atoopiat ja Sjögreni tõvega patsiente. sündroom.

Samuti jäeti välja kontaktläätsede kasutajad, et vältida võimalikku sekkumist tulemuste tõlgendamisse. Samal päeval tehti esialgsed silmauuringud ja proovide kogumine, samal ajal kui Parkinsoni skaalade hindamiseks võtsid PD-ga patsiente eraldi päeval vastu uurimisrühma liikmed, kes on liikumishäirete eksperdid.

2.2. Oftalmoloogiline läbivaatus

Kliiniline oftalmoloogiline uuring hõlmas Schirmeri testi I (SCH), mis määrab, kas silm toodab piisavalt pisaraid, et hoida seda niiskena. Test võimaldab pisarate veel liikuda mööda paberist testriba pikkust ja normaalväärtused on suuremad kui 10 mm paberi niisutamine 5 minuti pärast või sellega võrdsed. Pisarakile ebastabiilsust hinnati fluorestseiiniga pisara purunemise aja (TBUT) abil. TBUT on aeg, mis kulub pärast täielikku vilkumist sarvkestale esimese kuiva laigu ilmumiseks. Väärtus alla 10 s peegeldab tavaliselt pisarakile ebastabiilsust. Välistamiskriteeriumiks peeti mis tahes süsteemset haigust või mis tahes muud seisundit/ravimite kasutamist, mis võis segada tulemuste tõlgendamist.

2.3. Neuroloogiline läbivaatus

Liikumishäirete valdkonna neuroloog registreeris PD patsientide vanuse pisarate kogumisel, nende haiguse kestuse ja skoori Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) ja Hoehn Yahri skaalal. Need testid on kihistuskriteeriumid haiguse progresseerumise jälgimiseks. Patsiendiandmete konfidentsiaalsus tagati Basque Biobanki kasutamisega.

2.4. Tear-Sample Collection

Kõik pisaraproovid koguti kalibreeritud 10 µl klaasist mikrokapillaartorude abil (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Saksamaa). Pisaraproovid saadi alumisest ajalisest pisarameniskist, minimeerides silmapinna või kaane serva ärritust ja ilma anesteesia paigaldamiseta. Pisaraproovid koguti iga osaleja mõlemast silmast ja pandi kohe eeljahutatud Eppendorfi tuubidesse. Pärast pisarate kogumist hoiti proove kuni nende analüüsideni temperatuuril –80 ◦C.

2.5. Proteoomika analüüsid

Proteoomilised analüüsid viidi läbi CIC bioGUNE Proteomics Service'is (Derio, Bizkaia, Hispaania), kasutades proovi töötlemiseks ja seedimiseks FASP (Filter Aided Sample Preparation) protokolli [15]. Trüpsiini (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) lisati trüpsiini:valgu suhtega 1:50 ja segu inkubeeriti üle öö temperatuuril 37 ◦C, kuivatati RVC-s{{4} } Speedvac kontsentraator (Christ, Viin, Austria). Saadud peptiidid sooladest vabastati ja resuspendeeriti 0,1% sipelghappes (FA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), kasutades C18 etapi otsikuid (Millipore, St. Louis, MO, USA).

Proove analüüsiti uudses hübriidse püütud ioonide liikuvusspektromeetria kvadrupoolilises lennuaja massispektromeetris (timsTOF Pro koos PASEF-iga, Bruker Daltonics, Bremen, Saksamaa), mis oli võrgus ühendatud nanoElute vedelikkromatograafiga (Bruker, Coventry, UK). See massispektromeeter kasutab ära uudset skaneerimisrežiimi, mida nimetatakse paralleelseks akumulatsiooniks jadafragmentimiseks (PASEF), mis mitmekordistab sekveneerimiskiirust ilma tundlikkuse vähenemiseta ning on tõestatud, et see tagab proteoomika analüüside jaoks silmapaistva analüütilise kiiruse ja tundlikkuse [16].

Proovid (200 ng) laaditi otse 15 cm Brukeri nanoeluaadi FIFTEEN C18 analüütilisse kolonni (Bruker, Coventry, UK) ja lahustati kiirusel 400 nl/min. Kolonni kuumutati ahjus temperatuurini 50 °C. Valkude identifitseerimine ja kvantifitseerimine viidi läbi tarkvara PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, USA) abil. Otsingud viidi läbi kanooniliste inimese Uniprot/Swissprot kirjete andmebaasi põhjal (isovormid ei arvestatud), prekursorite ja fragmentide tolerantsidega 20 ppm ja 0,05 Da.

Pindalapõhine märgisevaba valgu kvantifitseerimine viidi läbi PEAKS Q mooduli abil, mis on saadaval PEAKS tarkvaras. Edasiseks analüüsiks võeti arvesse ainult neid valke, mis olid identifitseeritud vähemalt kahe peptiidiga valetuvastussagedusega (FDR) < 1% ja mis esinesid vähemalt 70 protsendis ühe analüüsitava katserühma proovidest. Andmed laaditi Perseuse platvormile [17] ja neid töödeldi edasi (log2 teisendus, imputatsioon) enne Studenti t-testi rakendamist valgu ekspressiooni diferentsiaalanalüüsiks. Proteoomika andmed on kokku võetud lisamaterjalide failis S1 ja massispektromeetria proteoomika andmed deponeeriti ProteomeXchange konsortsiumi PRIDE [18] partnerhoidla kaudu koos andmestiku identifikaatoritega PXD028811 ja 10.6019/PXD0288811.

2.6. Statistilised analüüsid

Statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades paketti IBM SPSS Statistics for Windows, 23.{1}}v (IBM-SPSS, Armonk, New York, NY, USA). Pidevate andmete normaalsust hinnati Shapiro-Wilki testiga. Arvutatud p-väärtused määravad kindlaks tõenäosuse, et andmestikus sisalduvate valkude ja antud kanoonilise raja, funktsionaalse võrgu või ülesvoolu regulaatori vahelist seost seletatakse Fisheri täpse testi põhjal ainuüksi juhusega, p-väärtusega < {{5 }}.05 peetakse oluliseks.

PD-patsiendi diskrimineerimisega seotud statistiliselt oluliste tunnuste tuvastamiseks kasutati ühemõõtmelisi logistilisi regressioone. Pärast muutujate valikut kasutati mitme muutujaga logistilisi regressioone, et konstrueerida PD diskrimineerimise mudel ning tuvastada PD tuvastamiseks olulised kliinilised ja proteoomilised muutujad. Logistilised mudelid võimaldavad hinnata seost diskreetse sõltuva muutuja ja pidevate või diskreetsete sõltumatute muutujate hulga vahel. Mudelid võimaldavad klassifitseerida PD-ga või ilma haigeid, arvutades igasse rühma kuulumise tõenäosuse. Iga ühismuutuja p-väärtus kirjeldab vastuse ja iga mudelis sisalduva termini vahelise seose statistilist olulisust.

lisateabe saamiseks: Ali.ma@wecistanche.com