Polü- ja oligosahhariid Ulva Sp. Ensüümi abil ekstraheerimisest saadud fraktsioonid moduleerivad ainevahetust 2

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

3. Arutelu

Meie peamine eesmärk on hinnata Ulon sp. polü- ja oligosahhariidide fraktsioonide potentsiaalset bioloogilist aktiivsust. mis saadakse pärast uuenduslikku ensüümi abil ekstraheerimise (EAE) protsessi, mis teadaolevalt parandab ekstraheerimise saagikust [5] ja võimaldab ulvanites oluliselt rikastada fraktsioone, võrreldes leotusega [36], mis mõjutab inimese naha naha fibroblastide metabolismi kultuur.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Tähelepanu pöörati naha rakuvälise maatriksi komponentide (ECM) ekspressioonile, mis osalevad anaboolses rajas (eriti I ja Ⅲ tüüpi kollageenid, GAG-id ja TIMP{0}}) ning kataboolses rajas (MMP-1). proteoomilisel ja transkriptoomilisel tasemel. Selles töös eeldasime, et fraktsioonide kõrge süsivesikute ja uroonhapete koostise tõttu on aktiivsus seotud ulvaani (polü- ja oligosahhariidi) koostisega. Sellegipoolest ei tohiks autorid tähelepanuta jätta, et Uloa sp. rakusein on tihedalt seotud valkudega, mis samuti soodustavad in vitro kollageeni ja hüaluroonhappe kogutootmist inimese dermaalsetes fibroblastides [39]. Seega viitavad autorid, et need tegevused võivad olla seotud ulvanide ja valkude vahelise sünergiaga, kuigi selles käsikirjas keskendutakse ulvanidele. 3.1. EAE polü- ja oligosahhariidide Uloa fraktsioonide toime ECM-i fibroblastide ainevahetusele

Varasemad uuringud on näidanud, et Uloa sp.Cistanche ekstrakti kiirgusvastane toime(toor-ulvanid ja madala molekulmassiga ulvanid) on võimelised moduleerima normaalset inimese naha fibroblastide proliferatsiooni [36-38]. Meie tulemused näitasid, et nii EAE polü- kui ka oligosahhariidide fraktsioonid kutsusid esile fibroblastide metaboolse aktiivsuse olulise suurenemise (kuni pluss 68 protsenti). Need tulemused kinnitasid autorite varasemaid esialgseid avaldatud andmeid [36] ja varasemat tööd hüdrolüüsitud Uloa pertusa ekstrakti kohta 250 ug/ml, mis kutsus esile olulise pre- ja vananeva fibroblastide proliferatsiooni [38]. Metaboolse aktiivsuse suurenemisega ei kaasnenud fraktsioonide tsütotoksilist toimet (hinnatud LDH testiga), mis tähendab, et EAE polü- ja oligosahhariidi Uloa fraktsioonide bioaktiivsuse tulemusi ei moonuta tsütotoksiline toime testitud kontsentratsioonide vahemikus. Meie tulemus on kooskõlas varasemate uuringutega, milles tõstetakse esile ulvanid kui mittetsütotoksilised ühendid erinevatel rakutüüpidel (makrofaagide rakuliinid, soolestiku rakud, fibroblastid, hiire rakud ja Vero rakud)[13,14,4].

cistanche võib vananemisvastane

Nagu sissejuhatuses mainitud, interakteeruvad I ja III tüüpi kollageenid ja GAG-id omavahel, et luua molekulaarne võrgustik ECM-i kokkupanekuks pärisnahas. Seega on selles uuringus uuritud dermise ECM-i peamiste komponentide (tüüp I ja Ⅲ kollageenid ning sulfaaditud ja sulfaadimata GAG-d) valgusünteesi ja mRNA tasemel ekspressiooni polü- ja oligosahhariidi Ullon sp. fraktsioonid EAE-st. Lisaks hinnati valgu ja mRNA tasemel ka MMP-1, I tüüpi kollageeni lagunemises osalevat võtmeensüümi (ECM-i katabolismi rada) ja selle regulatsioonis osalevat koeinhibiitorit TIMP-1.

Tulemused näitasid, et nii EAE polü- kui ka oligosahhariidide Ulva fraktsioonid suurendasid kollageeni kogusünteesi 1000 ug/ml juures (kuni pluss 2 protsenti, hinnates Red sirius testiga ja olulisi tulemusi, välja arvatud DEP-AD PP-UE). Need tulemused erinevad varasemast uuringust, kus töötlemata kaubikud ja madala molekulmassiga ulvanid ei avalda olulist mõju kogu kollageeni sünteesile [37]. Kuid meie tulemused on kooskõlas varasema tööga, mis näitas, et Klebsiella kopsupõletiku tüvede L-ramnoosirikkad polüsahhariidipreparaadid (ROP-d) stimuleerivad kollageeni sünteesi [45]. Inimese naha fibroblastid sisaldavad tõepoolest lektiini saiti, mis suudab ära tunda -L-ramnoosi [46]. Sel viisil saab inimese dermaalne fibroblast ära tunda ulvani fraktsiooni ramnoosiosa ja seejärel soodustada kollageeni sünteesi. Eelkõige suurenes I tüüpi kollageeni süntees kõigi ELISA (oluline UE ja DS-UE jaoks) ja Western blot analüüside (NS) fraktsioonide puhul. See tulemus on kooskõlas varasema kirjandusega hüdrolüüsitud Ulva pertusa ekstraktide [38] ja depolümeeritud galaktofukaanide kohta.<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbaTõepoolest, meie uuringus ei mõjutanud madala molekulmassiga ulvanid GAG-ide tootmist (sealhulgas sulfaadimata GAG-de hüaluroonhapet).

Kuna naha vananemist iseloomustab ECM-i komponentide tasakaalustamatus (I ja II tüüpi kollageeni ning GAG-de vähenemine), siis Uloa sp. pärast EAE ravi pakuvad huvi vananemisvastastes strateegiates, kuna need stimuleerivad I ja III tüüpi kollageene ning GAG-de sünteesi.

Kuid meie tulemused tõid esile ka MP{0}} sünteesi, aktiivsuse ja geeniekspressiooni suurenemise polü- ja oligosahhariidi Uloa EAE-st pärinevate fraktsioonide juuresolekul. MMP-1 mRNA taseme tõus oli korrelatsioonis MMP-1 sünteesi suurenemisega Ulonist pärinevate EAE fraktsioonide juuresolekul ja oluliselt polüsahhariidifraktsioonide (UE ja DS-UE) juuresolekul. MMP tõus -1 ensüümi süntees on samuti seotud MMP-1 aktiivsuse mitteolulise suurenemisega fraktsioonide juuresolekul. Meie tulemus erineb varasemast kirjandusest, kuna hüdrolüüsitud Uloa pertusa ekstraktid inhibeerisid MMP{10}} ekspressiooni ja sekretsiooni vananevates fibroblastides[38] või fukoosi sisaldavad polüsahhariidid (nn fukoidaanid) pärsivad UVB-indutseeritud MMP{14}} ekspressiooni. inimese naha fibroblastides [50]. Kuid meie tulemus on kooskõlas FRioux jt uuringuga. (2013), kuna toorgalaktofukaanid (638-1529 kDa) suurendasid 6 päeva jooksul töödeldud fibroblastide MMP-de (sh MMP-1) kogukatalüütilist aktiivsust[47]. Meie andmed MMP taseme tõusu kohta on samuti kooskõlas Andrese jt tööga. (2006), kuna RROP-id (ramnoosirikkad oligo- ja polüsahhariidipreparaadid Klebsiella kopsupõletikust ja K. planticola tüvedest) reguleerivad üles MMP-9 ekspressiooni [45]Tõhustatud MMP-1 süntees põhjustab tavaliselt ECM-i vähenemise MMP{27}} lagundava aktiivsuse tõttu komponentide, nagu I tüüpi kollageen, hulk, kuid meie uuringus sellele tähelepanu ei pööratud, kuna toimus I tüüpi kollageeni suurenemine. Lisaks ei avaldanud Uloa EAE-st pärinevad fraktsioonid mingit mõju (NS suurenemine või vähenemine) MP-1, MP-1 koeinhibiitori (välja arvatud DEP-HD PP-) mRNA ekspressioonitasemele ja valgu tootmisele. UE märkimisväärse valgu suurenemisega, lk<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2. Ulvani arvukuse, sulfaadi koostise ja molekulmassi roll ECM-i fibroblastide modulatsioonis

On teada, et ulvanide struktuursed omadused, mis hõlmavad nende sulfatsiooniastet, sulfatsioonimustrit, monosahhariidide koostist, glükosiidsidemeid, hargnemisastet ja molekulmassi, mõjutavad nende bioloogilist aktiivsust [10,1,37,40,44,51 ].

Varasemad uuringud on näidanud, et bioaktiivsete ühendite, nagu polüsahhariidid või valk, molekulmass näib olevat võtmetegur selle mõjus fibroblastide proliferatsioonile ja ECM-i modulatsioonile [37, 39, 47]. Meie uuringus suurendasid suure molekulmassiga (Mw > 670 kDa) polüsahhariidifraktsioonid UE ja DS-UE fibroblastide proliferatsiooni. Kuigi oligosahhariidi fraktsioonid (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Autorid märkisid, et parem bioaktiivsus GAG-de sünteesil oli tingitud sulfaaditud polüsahhariidide suure molekulmassiga fraktsioonidest, mis on rikastatud toores ulvanides. See võib olla seotud ulvani sisemise koostisega sulfaatides ja selle molekulmassiga, kuna oligosahhariid Ulva sp. fraktsioonid, mis on osaliselt täiesti sulfaatidevabad, ei suuda stimuleerida GAG-de sünteesi.cistanche peenise kasvVeel üks uuring Ulku sp. näitas ulvaani sulfatsiooniastme tähtsust bioloogilisele aktiivsusele, kuna keemiliselt sulfaaditud Alvani fraktsioon, looduslikust polüsahhariidist pärit sulfaadi sisaldus kahekordistunud, tugevalt suurenenud antikoagulantne aktiivsus [10] Lisaks suurendas DS-UE rohkem ECM-i modulatsiooni seoses GAG-idega, üld- ja I tüüpi ja Ⅲ kollageeniga. süntees võrreldes UE-ga. Seda paremat bioaktiivsust võib seostada ulvanide suurema arvukuse ja suurema sulfaadirühmade sisaldusega dialüüsitud fraktsioonis võrreldes teiste fraktsioonidega.

Meie andmed näitasid, et polü- ja oligosahhariid Uloa sp. fraktsioonidel oli erinev metaboolne aktiivsus, mis võib olla tingitud ulvaani rohkusest, selle sulfatsiooniastmest ja keemilisest struktuurist. See töö tõi esile ka parema aktiivsuse suure molekulmassiga kaubikute jaoks, millel on sulfaatrühmad. Asjaolu, et töötlemata ulvanide (st mittedepolümeriseerunud) polüsahhariidide fraktsioonidel oli suurim mõju ECM-i fibroblastide metabolismile, on ideaalne tulevaste uuringute jaoks ja selle tulevaste potentsiaalsete rakenduste jaoks dermokosmeetilises hoolduses, kuna minimaalne töötlemine vähendab tootmiskulusid ja aega.

4. Materjalid ja meetodid

4.1.Makrovetika materjal

Rohelised merevetikad, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), saadi 28. mail 2018 pärastlõunal mõõna ajal Sarzeau's (Bretagne'is, Prantsusmaal) loodetevahelisest rannast Landrezac (47 kraadi 30 kraadi 17,9" N aste 2 kraadi 42 kraadi 37,1" O). Materjal pesti kraaniveega, jahvatati 3 mm läbimõõduga, külmutati -25 kraadi juures, külmkuivatati (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Saksamaa) ja hoiti toas. temperatuur pimedas.

4.2. Polü- ja oligosahhariidide fraktsioonide tootmine ja iseloomustamine

Fourniere jt eelmises töös. (2019) kirjeldati üksikasjalikult polü- ja oligosahhariidifraktsioonide tootmist ensüümi abil ekstraheerimisest (EAE) (vt joonis 9 ja tabel 3)[36].

Lühidalt kokkuvõtlikult võib öelda, et endoproteaasi Protamex [(Novozymes, Bagsverd, Taani) kasutati kuivatatud Uloa sp. merevetikad. Ensümaatiline hüdrolüüs viidi läbi 3 tundi 50 kraadi juures. Seejärel sadestati vesiekstrakt etanoolis (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa) temperatuuril 4 kraadi 244 tundi, et saada toor-ulvanide (UE) rikas fraktsioon.

Seejärel valmistati fraktsioon DS-UE pärast toor-Evansi (10 mg/ml) rikka fraktsiooni dialüüsi 7 päeva jooksul 4 kraadi juures (lävi 12-14 kDa, Spectra/Por94 dialüüsi membraan, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific Illkirch, Prantsusmaa).

Kaks depolümerisatsiooniprotseduuri (radikaaldepolümerisatsioon H-OZ-ga ja ioonivahetusvaigu depolümerisatsioon) viidi läbi toor-ulvanirikka fraktsiooni (25 mg/ml) etanoolisademe lahusega. Radikaalseks depolümerisatsiooniks kasutati vesinikperoksiidi (8, v/v). , Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa) segati lahusega 24 tundi temperatuuril 50 ja toodet dialüüsiti 48 tundi temperatuuril 4 kraadi (500-1000 Da, Biotech CE Tubing). , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, Prantsusmaa). Happelise depolümerisatsiooni jaoks segati lahusega 24 tundi 80 kraadi juures vaiku Amberlite" FPC23H (10 ml ekvivalent, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa) ja saadus neutraliseeriti NaOH-ga (0,1 ja 1 M) enne 48 tundi. dialüüs 4 kraadi juures (500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa).cistanche salsa eelisedNeed kaks protseduuri viisid oligosahhariidide fraktsioonideni, mida nimetatakse vastavalt DEP-HD PP-UE ja DEP-AD PP-UE H2OZ jaoks ja happelise vaigu protseduuriks.

Kõik fraktsioonid külmkuivatati (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Saksamaa) ja säilitati enne analüüsi 4 kraadi juures. Nende fraktsioonide iseloomustus: polüsahhariidi molekulmassi jaotus kõrgsurve suuruseralduskromatograafia abil (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), biokeemiline koostis, monosahhariidide koostis kõrgsurve anioonvahetuskromatograafia ja impulssamperomeetrilise meetodiga tuvastamine (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa) ja maatriksi abil laserdesorptsiooniga ionisatsioon-lennu massispektromeetria (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , USA) viidi läbi ka eelmises uuringus [36].

4.3.Rakukultuur

Inimese naha fibroblastide proovid saadi firmast "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Prantsusmaa. Inimese nahaproovid saadi kõhuplastika operatsiooni läbinud tervete doonorite nahabiopsiatest. Uuring viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsioonile ja kõik patsiendid allkirjastasid teadliku nõusoleku lepingu vormi. Näidiskogud järgisid kohalikku kokkulepet ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) ja viidati DC 2016-2833 all.

Tavalisi inimese dermaalseid fibroblaste (NHDF) kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM, Lonza, Basel, Šveits), mis sisaldas 10% (maht/maht) veise loote seerumit (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa). ), 1-protsendiline antibiootikumilahus (maht/maht) (penitsilliin, streptomütsiin 10, 000 U/ml, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa) ja 1% seenevastane (maht/maht) (Fungizone, amfoteritsiin B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa), kontrollitud temperatuuriga inkubaatoris 5% CO2-ga 37 kraadi juures (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Saksamaa). Pärast liitumist rakud subkultuuriti trüpsiniseerimise (0,05 protsenti) ja EDTA (etüleendiamiintetraäädikhape) lahusega ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa). Kõik katsed viidi läbi 3. ja 8. passaaži vahel.

Rakud külvati 96-süvendi mikroplaatidele tihedusega 400 rakku süvendi kohta WST-1 ja LDH (laktaatdehüdrogenaasi) testide jaoks 12-süvendi plaatidele tihedusega 5{{8 }} rakku/süvend Red Siriuse ja Blue Alcian värvimise ja RT-qPCR testi jaoks ning 6-süvendiplaatidele tihedusega 200 000 rakku süvendi kohta ELISA ja Western blot analüüside jaoks.

Kõigis katsetes inkubeeriti rakke pärast 80-protsendilise konfluentsuse saavutamist DMEM-is 2-protsendilise FBS-iga polü- ja oligosahhariidide fraktsioonide puudumisel või juuresolekul 48 tundi 50 ja 1000 ug/ml juures.

4.4.WST-1 Rakkude proliferatsiooni test

WST-1, in vitro, analüüs põhineb tetrasooliumisoola WST-1 (4-[3-(4-lodofenüül){{5}) muundamisel }}(4-nitrofenüül)-2H-5-tetrasool]-1,3-benseendisulfonaat) raku mitokondri dehüdrogenaaside toimel formasaaniks (oranžiks värvaineks). Värvuse muutus on otseselt võrdeline rakkude elujõulisuse ja proliferatsiooniga kultuuris.

Pärast 48-tunnist inkubeerimist sööde eemaldati ja lisati 100 uL WST-1 reaktiivi (WST-1 rakuproliferatsiooni komplekt, Roche Diagnostics, Meylan, Prantsusmaa; lahjendus 1:40 DMEM-is 2% FBS-iga). lisatakse igasse süvendisse. Pärast 45-minutilist inkubeerimist 37 kraadi juures 5% CO2-ga mõõdeti neeldumist lainepikkusel 450 ja 630 nm mikroplaadilugejaga (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome). 4.5. LDH tsütotoksilisuse test

LDH tsütotoksilisuse test põhineb laktaatdehüdrogenaasi (LDH) mõõtmisel, mis on stabiilne tsütosoolne ensüüm, mis vabaneb raku lüüsil. Kultuuri supernatantides vabanenud LDH-d mõõdetakse tetrasooliumisoola (jodonitrotetrasoolviolet) muundamisel punaseks formazaani produktiks.cistanche tubulosa dosage redditMõõdetud punase formatsaani kogus on võrdeline lüüsitud rakkude arvuga.

LDH test (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) viidi läbi vastavalt tarnija juhistele. Positiivne kontroll (LDH maksimaalne vabanemine) viidi läbi, lisades enne reaktiivi CytoTox969 lisamist 45 minutiks 10 uL lüüsilahust 10x (Triton X-100 0,8% juures). Pärast inkubeerimist kanti 50 μl rakukultuuri supernatanti uuele 96-süvendiga mikroplaadile (mittesteriilne). Seejärel lisati 50 µl reaktiivi CytoTox96 kraadi. Mikroplaati inkubeeriti 30 minutit toatemperatuuril pimedas. Seejärel reaktsioon peatati, lisades 50 µl "Stop-lahust". LDH vabanemist mõõdeti neeldumise kvantifitseerimisega mikroplaadilugejaga 490 nm juures (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome).

4.6. Alcian Blue värvimine glükoosaminoglükaanide määramiseks

Alcian blue värvimine on värvimismeetod, mis võimaldab kvantifitseerida kahte tüüpi glükoosaminoglükaane (GAG): sulfaaditud (heparaansulfaat, kerataansulfaat, kondroitiinsulfaat ja dermataansulfaat) ja mittesulfaaditud (hüaluroonhape). Alcian sinine lahus pH-ga 1 värvib sulfaaditud GAG-sid, lahus pH-ga 2,5 aga sulfaadimata GAG-sid.

Inkubeerimise lõpus sööde eemaldati ja rakke loputati kaks korda PBS 1X-ga (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Seejärel loputati rakke 5 minutit 0,1 N HCl-ga (pH1, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa) või 3M äädikhappega (pH 2,5, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa), et alandada pH-d ja paljastavad vastavalt sulfaaditud ja sulfaadimata glükoosaminoglükaanid. Seejärel värviti rakke 1% Alcian Blue (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa) HC10,1 N lahuses (pH1) või 3% äädikhappe lahuses (pH 2,5) 30 minutit. Rakke loputati kaks korda kraaniveega 5 minutit, kuivatati kapoti all ja loputati destilleeritud veega 5 minutit. Seejärel lahustati seotud värvaine guanidiinvesinikkloriidi 6 M lahusega (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa) 5 minutit, segades toatemperatuuril. Värviline lahus kanti üle uuele 96-süvendiga mikroplaadile ja neeldumise lugemine viidi läbi 600 nm juures (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome).

4.7. Punase Siriuse värvimine kollageeni koguhulga määramiseks

Red Sirius värvimisprotseduur võimaldab kvantifitseerida kogu kollageeni. Picrosirius red, tugev lineaarne anioonne värvaine, mis koosneb kuuest sulfonaatrühmast, assotsieerub piki katioonseid kollageenkiude.

Pärast inkubeerimist sööde eemaldati ja rakke loputati kaks korda PBS 1X-ga (Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa). Seejärel lisati igasse süvendisse 1 ml Bouini lahust Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa) ja rakke värviti 1 tund toatemperatuuril. Seejärel loputati rakke kaks korda destilleeritud veega ja kuivatati kapoti all. Rakke värviti 1 tund 1 ml Red Siriuse lahusega (Sirius Red 80 küllastunud pikriinhappe vesilahuses, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa). Pärast värvimist lahus eemaldati ja rakke loputati järjestikku destilleeritud vee ja HC10.01N lahusega, et eemaldada seondumata värvaine. Seotud värvaine lahustati 0,1 N NaOH-ga 30 minutit. Värviline lahus kanti üle uuele 96-süvendiga mikroplaadile ja neeldumise lugemine viidi läbi 550 nm juures (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome). 4.8. I tüüpi kollageeni ja MMP{17}} ELISA

Pärast inkubeerimist pesti rakke kaks korda PBS 1X-ga (Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa). Fibroblastid lüüsiti RIPA (radioimmunosadestamise test) puhvris (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa), millele oli lisatud proteaasi inhibiitori kokteili (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa) 4 kraadi juures 1 tund. Rakud kaabiti ja proove segati keerisega 30 minutit ja tsentrifuugiti (12,00xg 30 minutit 4 kraadi juures). Intratsellulaarseid valke sisaldavad supernatandid koguti ja seejärel säilitati temperatuuril{10}} kuni valgu määramise ja Western blot analüüsini. Valgu kontsentratsioon määrati Pierce BCA Protein Assay abil (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), kasutades standardina veise seerumi albumiini (BSA).

Rakukultuuri supernatant koguti ja tsentrifuugiti rakujäätmete eemaldamiseks (200 × g 10 minutit 4 kraadi juures) ja säilitati analüüsimiseni temperatuuril -80 kraadi.

I tüüpi kollageeni ja MMP{0}} mõõtmisi hinnati kultuurisöötmes Abcam komplektidega (ab210966 Human Pro-Collagen I alfa 1 SimpleStep ELISA Kit ja ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) vastavalt tootja juhistele. . Neeldumist mõõdeti 450 nm juures mikroplaadilugejaga (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome). Tulemused normaliseeriti eelnevalt määratud rakuvalgu kontsentratsioonidega. 4.9.Western BlotValguproovide ekstraheerimist kirjeldati eelmises jaotises 4.8. Laemmli puhvriga (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) valguproove keedeti 5 minutit 95 kraadi juures ja seejärel tsentrifuugiti 16, 000 × g juures 1 minut. Võrdsed kogused valku (10 ug) laaditi süvenditesse, mis sisaldasid 7,5% või 4-15% TGX plekivaba geeli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) ja Precision Plus Protein "Unstained Protein" standard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). Geeli töödeldi 200 V juures 30 minutit (PowerPac"Basic koos Mini-PROTEAN Tetra Systemiga, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). Valgu ülekandmine geelist mini-PVDF (polüvinülideenfluoriid) membraanile (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) viidi läbi Trans-Blot Turbo Transfer Systemiga (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). ). Membraan blokeeriti 3% BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa) või 5% rasvata kuiva piimaga TBST-s (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) 1 tund toatemperatuuril ja pestud TBST-ga. Membraani sondeeriti I tüüpi kollageeniga (Novotec, Reuver, Holland), III tüüpi kollageeniga (Novotec, Reuver, Holland), MMP-1 (EnoGene, New York, NY, USA) või TIMP-ga{{43 }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) antikehad; seejärel pesti seda mitu korda TBST-ga ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril sekundaarsete peroksidaasiga konjugeeritud antikehadega (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK). Seejärel tehti selgeks Lääne ECL substraat (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). kanti 5 minutiks membraanidele ja ilmutus viidi läbi kasutades ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). Valgu tase määrati tarkvara ImageLab v6.01.1 abil.

4.10.Sümograafia

Inanci jt järgi viidi läbi sümograafia, et analüüsida kollagenaasi MMP{0}} aktiivset vormi. (2017) kohandatud meetod [52].

SDS-PAGE geelid (10 protsenti polüakrüülamiid, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) kopolümeriseeriti 1 mg/ml I tüüpi kollageeniga roti saba Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa). proovid (5 ug) segati mitteredutseeriva proovipuhvriga (62,5 mM Tris HCl pH 6,8,2{34}} protsenti glütserooli, 4 protsenti SDS, 0,01 protsenti bromofenoolsinist), tsentrifuugiti 1 minut 4 kraadi juures, laaditi süvenditesse. geelist koos Precision Plus Protein'iga All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) ja seejärel elektroforeesiga 110 V juures 4 kraadi juures 2 tundi Geeli pesti kaks korda 2,5% Triton X-s{26 }} (maht/maht) iga kord 15 minutit, et eemaldada SDS. Seejärel inkubeeriti geeli Zymogram Development Bufferis (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) 48 tundi temperatuuril 37 kraadi. Pärast inkubeerimist , värviti geeli 1 tund 0,5% Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) lahusega (mass/maht) ning seejärel värviti 40% metanoolis ja 10% jää-äädikhappes. lahendus (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Prantsusmaa). MMP-1 aktiivsus tuvastati selge ribana Coomassie Blue värvitud geeli taustal. Kvantifitseerimine viidi läbi ChemiDoc XRS pluss Molecular Imageril (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) Image Labi versiooni 6.01.1 tarkvaraga (Bio-Rad). 4.11.RNA eraldamine ja reaalajas RT-PCR

Pärast 48-tunnist inkubeerimist ekstraheeriti kogu RNA TRIzoliga (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja kloroformiga (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa), sadestati isopropanooliga (Fisher Scientific, Illkirch, Prantsusmaa), pesti etanooliga 75 protsenti, kuivatati kapoti all enne resuspendeerimist DEPC (dietüülpürokarbonaadiga) töödeldud vees (Fisher Scientific, IIlkirch, Prantsusmaa). RNA kogust ja puhtuse taset (vahemikus 1,8–2.{6}}) hinnati neeldumise mõõtmisega mikroplaadilugejaga (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome) 260–280 nm juures, kasutades drop TM Plate (Thermo Fisher) Scientific, Waltham, MA, USA).

DNA saasteainete eemaldamiseks töödeldi ühte mikrogrammi kogu RNA-d DNaseI-ga (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) 5 minutit temperatuuril 25 kraadi. Ensüüm inaktiveeriti 5 minutit 75 kraadi juures.

Pöördtranskriptsioon viidi läbi 1 ug kogu RNA-ga, mida oli eelnevalt töödeldud DNaas I-ga, kasutades iScript Reverse Transcription (RT) Supermixi (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). 20 min 46 kraadi juures ja 1 min 95 kraadi juures.

PCR-katsetesse kaasati mittematriitsi kontrollid. qPCR viidi läbi 96-süvendiplaatidel kogumahuga 20 μL, mis sisaldas 1 uL 1–15 lahjendatud cDNA proovi RT-st, 1 μL praimerit (vt tabel 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, Prantsusmaa), 10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermixi (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) ja 8 μL nukleaasivaba vett. Võimendustingimused olid 2 minutit 95 kraadi juures, millele järgnes 40 tsüklit 5 s 95 kraadi juures ja 30 s 60 kraadi juures ning lõppes 5 s 95 kraadi juures ja 5 s 65 kraadi juures enne sulamiskõvera protokolli: tõus 0,5 kraadi võrra 65 kraadilt kraadini 95 kraadi. PCR katsed viidi läbi CFX 96 süsteemiga (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa) ja tulemused koguti Bio-Rad CFX Manager tarkvarast v3.1 (Marnes-La-Coquette, Prantsusmaa). MRNA kogused normaliseeriti RPL13A mRNA-ks ja suhtelise geeniekspressiooni analüüs arvutati 2-AACt meetodi abil.

4.12. Statistiline analüüs

Kõik väärtused väljendati n katse keskmisena ± standardviga (SE).

Statistilised analüüsid viidi läbi kasutades Addinsofti (2020). Andmete normaaljaotuse hindamist hinnati Shapiro-Wilki testi abil. Olulisi erinevusi kontroll- ja katseproovide vahel analüüsiti Studenti t-testiga (sõltumatu, kahepoolne), kui toimus normaaljaotus, ja Mann-Whitney testiga, kui normaaljaotus lükati tagasi. Olulised erinevused võrreldes kontrolliga statistilise testi järgi on tähistatud tärnidega (*lk<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Kokkuvõtted

See töö näitab, et ulvanidega rikastatud polü- ja oligosahhariidide fraktsioonid, mis saadi pärast rohelist uudset tehnoloogiat EAE rohelistest merevetikatest Uloa sp., mõjutavad fibroblastide proliferatsiooni, ECM-i valgu sünteesi, maatriksi uuenemist ja remodelleerumist. Võib tekkida potentsiaalne kasutamine kosmeetilistes vananemisvastastes strateegiates, kuna naha vananemist iseloomustab kollageeni sünteesi vähenemine. Seega on naha maatriksi uuendamine selles kontekstis kasulik. Seega on Ulva sp. Pärast EAE-d saadud fraktsioonid on bioloogiliselt aktiivsed inimese nahanaha fibroblastide metabolismis. Autorid viitavad sellele, et see aktiivsus sõltub ulvani arvukusest, sulfaadi koostisest ja fraktsioonide molekulmassist. Autorid oletavad, et need sulfaaditud ramnoosirikkad molekulid vastavad signaalmolekulidele, mille tunnevad ära membraani fibroblastide lektiini saidid ja mis seejärel stimuleerivad nende metaboolset aktiivsust nii anaboolsest kui kataboolsest vaatepunktist. Siiski on vaja täiendavaid uuringuid, et hinnata põhjalikult polü- ja oligosahhariidi Ulou sp. fraktsioonid transkriptsioonifaktorite tasemel, kõrge ja väikese molekulmassiga ulvanide läbitungimisvõime 3D-naha või ex vivo nahaeksplantaadi mudelites ning kinnitavad need ECM-i modulatsiooni tulemused Uloa EAE-st saadud fraktsioonidega nendes mudelites vananemisvastase sihtmärgi jaoks.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs