Polü- ja oligosahhariid Ulva Sp. Ensüümi abil ekstraheeritud fraktsioonid moduleerivad rakuvälise maatriksi ainevahetust

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Ulva sp. on teadaolevalt bioaktiivsete ühendite, näiteks kaubikute allikas, kuid nende bioloogilist aktiivsust inimese dermaalsete fibroblastide ekstratsellulaarsele maatriksile (ECM) on vähe kirjeldatud. Selles töös on ECM-i reguleerimist esimest korda uuritud nii proteoomilisel kui ka transkriptoomilisel tasemel normaalsetes inimese naha dermaalsetes fibroblastides pärast 48-tunnist inkubeerimist Ulva sp. polü- ja oligosahhariidi fraktsioonidega. saadud pärast ensüümi abil ekstraheerimist ja depolümerisatsiooni. Rakkude proliferatsiooni suurenemist (kuni pluss 68 protsenti) ilma tsütotoksilise toimeta fibroblastidele demonstreeriti 50 ja 1000 ug/ml mõlema fraktsiooni puhul. Proteoomilisel tasemel suurendasid polüsahhariidide fraktsioonid kontsentratsioonis 1000 ug/ml enim glükoosaminoglükaanide (GAG-d, kuni pluss 57 protsenti), kogu kollageeni, eriti tüüpide I (kuni pluss 217 protsenti) ja Ⅲ sünteesi, samuti sünteesi. ja MMP-1 (maatriksi metalloproteinaas-1, kuni pluss 309 protsenti) aktiivsus. Seevastu oligosahhariidide fraktsioonid ei mõjutanud GAG-de sünteesi, kuid neil esines sarnasusi kollageenide ja MMP{12}} regulatsiooni osas.puritaanid c-vitamiinTranskriptoomilisel tasemel kinnitas COL1A1 ja COL1A2 ekspressiooni vähenemine ning COL3A1 ja MMP{6}} ekspressiooni suurenemine ECM-i metabolismi modulatsiooni mõlema fraktsiooni poolt. Meie uuringud rõhutavad, et polü- ja oligosahhariid Ulva sp. fraktsioonidel on huvitav bioloogiline toime ja need toetavad nende potentsiaalset kasutamist naha uuendamise valdkonnas vananemisvastastes dermokosmeetikas.

lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad:kollageen; rakuväline maatriks; inimese dermaalne fibroblast; maatriksi metalloproteinaas; merevetikad; Ulva sp.

1. Sissejuhatus

Uloa sp. on Bretagne'is (Prantsusmaa) mere eutrofeerumise tõttu kordunud. Roheliste merevetikate kasvukohtadel on sügav kahjulik ökoloogiline mõju, sealhulgas ökosüsteemi struktuuri muutumine, põlisrahvaste bioloogilise mitmekesisuse vähenemine ja majanduslik kahju [1,2]. Uloa sp. väärtustamise kohta on väga vähe teada, välja arvatud kasutamine pinnase parandamiseks, loomasöödana või lihtsalt lagunemise või põlemise teel. inimeste tervises [1]. Siiski Ulloa sp. on oluline selliste ühendite allikas nagu ulvanid. Evans, vees lahustuvad sulfaaditud rakuseina polüsahhariidid, mis koosnevad peamiselt ramnoosist, uroonhapetest ja ksüloosist, võivad moodustada kuni 36 protsenti Ulloa kuivkaalust [3]. Ulvani kaks peamist korduvat disahhariidiühikut on aldobiuroonhapped (ulvanobiuroonhapped), tüüp A: -D-glükuroonhape (1,4)-seotud -L-ramnoos3-sulfaadiga ja tüüp B: -L- iduronhape (1,4)-seotud -L-ramnoos-3-sulfaadiga. Väiksemaid disahhariide aldoose, mida nimetatakse ulvanobioosideks (tüüp U), võib leida ka ulvanist[3.4]. Ulvani ekstraheerimine võib kvantitatiivse saagise ja kvaliteedi osas oluliselt erineda sõltuvalt biomassi ekstraheerimis- ja fraktsioneerimismeetoditest. Ulvaanid ekstraheeritakse tavaliselt vesilahuses kõrgel temperatuuril (80-90 kraadi), mida nimetatakse leotamise protsessiks. Evansi saab aga taastada uudse rohelise tehnoloogiaga, mille nimi on ensüüm-abiga ekstraheerimine (EAE)[5]. EAE võimaldab huvipakkuvate ühendite ekstraheerimist ilma denatureerivaid tingimusi (nt lahustid või kõrged ekstraheerimistemperatuurid) kasutamata ning sellel on mitmeid eeliseid, nagu näiteks kõrge katalüütiline efektiivsus, kõrge spetsiifilisus, kerged reaktsioonitingimused ja ühendite bioloogilise aktiivsuse säilimine. EAE parandab ka saagikust ning vähendab kulusid ja energiatarbimist võrreldes klassikalise leotamise protsessiga [6-9]. Pärast leotamise või uudse protsessi (nt EAE) veepõhist ekstraheerimist teostatakse ulvani rikastamine sageli etanoolisadestamise protseduuriga [3]. Ulvanid on näidanud in vitro ja in vivo mitmeid bioloogilisi toimeid, nagu immunomoduleeriv, antioksüdant, vähivastane, antikoagulant, antihüperlipideemiline või viirusevastane [3,5,10-14].sistancheEvansi struktuursed omadused (sulfatsiooniaste, sulfatsioonimuster, monosahhariidide koostis, glükosiidsidemed, hargnemisaste ja molekulmass) mõjutavad selle bioloogilist aktiivsust [3]

Naha vananemine on keerukas protsess, millel on kaks üksteist täiendavat protsessi: sisemine (geneetiline, rakuline ainevahetus jne) ja väline (UV kokkupuude, saaste, tubaka suitsetamine jne)[15-17]

Cistanche on vananemisvastane toime

Hiljuti hakati kasutama merevetikate bioaktiivseid aineid kõrge lisandväärtusega toodete allikana dermokosmeetikatööstuses. Nende bioaktiivsete ühendite hulgas on ulvanidel suur potentsiaal. Tõepoolest, tarbijate nõudlus looduslike toodete järele on viimastel aastatel kasvanud, mistõttu on meretooted ja eriti merevetikad huvitavad looduslike koostisosade allikad, mis on suunatud naha ilule ja tervisele [18-22]. Nahk, kosmeetikatoodete sihtmärk, koosneb kolmest peamisest erinevast kattuvast kihist: epidermis, pärisnahk ja hüpodermis.mis on cistancheDermis toetab epidermist ja sisaldab olulisi naharakke, mida nimetatakse fibroblastideks. Fibroblastid, papillaarse dermise peamised rakud, mis asuvad otse epidermise all, sünteesivad ja korraldavad põhiliselt ekstratsellulaarset maatriksit (ECM). ECM koosneb erinevatest makromolekulidest, sealhulgas kollageenidest (70 protsenti kuivkaalust), peamiselt I ja III tüüpi kollageenidest, elastiinist (2-4 protsenti), glükoproteiinidest (fibronektiin, laminiin jne), glükosaminoglükaanidest (GAG) kas sulfaaditud (heparaan) sulfaat, dermataansulfaat, kerataansulfaat, kondroitiinsulfaat) ja mittesulfaaditud (hüaluroonhape), proteoglükaanid ja lagundatavad komponendid, nagu MMP-d (maatriksi metalloproteinaasid)[23,24]. I tüüpi kollageen moodustab kuni 80 protsenti kogu kollageenist [25] ja on naha dermise ECM üks peamisi koostisosi; see on seotud naha elastsuse, painduvuse ja pingega. I tüüpi kollageen on heterotrimeer, kolmikheeliksi valk, mis koosneb kahest cl-ahelast ja ühest c2-ahelast, mida kodeerivad vastavalt geenid COL1Al ja COL1A2 [26]. I ja II tüüpi fibrillaarsed kollageenid moodustavad üle 90 protsendi kogu kollageenist ja on nahaga tihedalt seotud [27, 28]. II tüüpi kollageen on noores nahas rohkem levinud kui vananenud nahas ja on eriti seotud haavade paranemisega [29, 30]. Molekulaarse võrgustiku loomiseks ECM-i koostamiseks seostatakse GAG-id valkudega ja moodustavad proteoglükaane (nt dekoriin või versikaan), mis interakteeruvad I tüüpi kollageeniga [31]ECM-is on MMP-d, mis on ECM-i kataboolse raja ensüümid, on latentsel või aktiivsel kujul seotud nende koe inhibiitoritega metalloproteinaasidele, mida tuntakse TIMP-dena ja mis reguleerivad nende aktiivsust [32]. MMP-1(kollagenaas-1) on peamine ensüüm, mis vastutab I tüüpi kollageeni lagunemise eest, ja TIMP-1 on selle vastav inhibiitor [334]. Fibroblastid on ECM-i homöostaasi peamised regulaatorid. Anabolismis osalevate naha ECM-i komponentide (nt I ja II tüüpi kollageenid, GAG-d või TIMP-d) ning katabolismi (nt MMP-d) vaheline sünteesi tasakaal ja sidumine võimaldab selle ECM-i uuenemist ja jätkuvat ümberkujundamist[25]. Naha vananemisel. , on peamiseks tagajärjeks ECM-i regulatsiooni tasakaalustamatus koos fibroblastide proliferatsiooni vähenemisega, ECM-i komponentide tasemete moduleerimine koos I tüüpi kollageeni sünteesi, GAG-de sekretsiooni ja TIMP{24}}-sünteesi olulise vähenemisega ning MMP-1 tase [24,35].

Praeguseks on Ulva sp. fibroblastide naharakkude metabolismi fraktsioonid nii proteoomilisel kui ka transkriptoomilisel tasemel[36-39] ning siiani ei ole EAE protsessist saadud Ulua polü- ja oligosahhariidide fraktsioonide kohta proteoomilise ja transkriptoomilise taseme täielikku uuringut läbi viidud.Vananemisvastane cistancheSellest vaatenurgast uurib see uuring in vitro Ulva sp. tuletatud uudsest rohelisest tehnoloogiast EAE inimese naha fibroblastide metabolismil. Uuriti nende mõju fibroblastide proliferatsioonile ja elujõulisusele ning nii ECM-i anabolismile kui ka katabolismile proteoomilisel ja transkriptoomilisel tasemel, et tõsta esile nende potentsiaali nahahoolduses (nt vananemisvastastes).

2. Tulemused

2.1. Ulva sp. polü- ja oligosahhariidide fraktsioonid.

EAE eksponeerib erinevat biokeemilist koostist ja molekulmassi jaotust

Polü- ja oligosahhariidide fraktsioonide tootmismehhanismid on üksikasjalikult kirjeldatud jaotises Materjalid ja meetodid: "4.2 Polü- ja oligosahhariidifraktsioonide tootmine ja iseloomustamine". Eelnevad üksikasjalikud biokeemiliste iseloomustusanalüüsid (süsivesikud, uroonhapped, sulfaatrühmad ja valgud) ja molekulaarsed Ulloa sp. polü- ja oligosahhariidide fraktsioonide massijaotus. viidi läbi EAE-st tuletatud [36]. Andmed on ühendatud tabelis 1.

Lühidalt, toor-ulvanide (UE) ja dialüüsitud ulvanide (DS-UE) polüsahhariidide fraktsioonid koosnevad suure molekulmassiga ulvanidest (toorkaubikud), milles on 23.5-37.4 protsenti süsivesikuid,18.5-37. 0 protsenti uroonhappeid, 29.9-49,1 protsenti sulfaatrühmi ja 10.5-12,8 protsenti valke. Süsivesikute koostis oli peamiselt ramnoos (50 protsenti) ja glükuroonhape (11 protsenti). DS-UE fraktsioon on ulvanide poolest oluliselt rikkam kui UE fraktsioon. Oligosahhariidide fraktsioonid, depolümeriseeritud kaubikud HzO2-st (DEP-HD PP-UE) ja depolümeriseeritud kaubikud Amberlite vaigust (DEP-AD PP-UE) koosnevad madala molekulmassiga kaubikutest, mis sisaldavad 24.4-30,4 protsenti süsivesikuid ( ramnoos 44.9-55.4 protsenti ja glükuroonhape 7.5-11.0 protsenti ), 21.6-30.8 protsenti uroonhapped ja 12.8-16.8 protsenti valgud.

Kuid depolümerisatsiooniprotsess tõi kaasa sulfaatide osalise kadumise (DEP-ADPP-s ei tuvastatud ja DEP-HD PP-UE-s ainult 6,6 protsenti). Oligosahhariidifraktsioonide molekulmassi (Mw) jaotus näitas DEP-HD PP-UE puhul keskmiselt madalat Mw-d 8 kDa ja madalamat DEP-AD PP-U puhul 1,5 kDa.

2.2. Ulva sp. polü- ja oligosahhariidide fraktsioonid. Stimuleerige metaboolset aktiivsust, kuid ärge mõjutage fibroblastide elujõulisust

Inimese normaalsete dermaalsete fibroblastide (NHDF) metaboolset aktiivsust, mis olid 48 tundi eksponeeritud polü- ja oligosahhariidi Ulloa fraktsioonidele (50 ja 100 ug/ml 48 tundi), hinnati WST-1 abil (joonis 1). Nendes katsetes (n=9) ​​suurendasid EAE-st pärinevad Ullva fraktsioonid fibroblastide proliferatsiooni kuni pluss 68 protsendini võrreldes kontrolliga.cistanche benefíciosMetaboolse aktiivsuse märkimisväärne tõus (lk<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Et teha kindlaks, kas need toimed ei olnud seotud raku toksilisuse puudumisega, hinnati Ulou ekstraktiga töödeldud rakkude elujõulisust LDH (laktaatdehüdrogenaasi) vabanemise mõõtmisega, kasutades CytoTox96 kraadi testi pärast 48-tunnist inkubeerimist (n=3) (joonis) 2). Tsütotoksilisuse test näitas, et kõik fraktsioonid ei näidanud kontrolliga võrreldes olulist tsütotoksilisust.

2.3. Ulva sp. polü- ja oligosahhariidide fraktsioonid. Stimuleerib ekstratsellulaarse maatriksi ainevahetust fibroblastides

Polü- ja oligosahhariidi Ulloa fraktsioonide mõju fibroblastide sulfaaditud ja sulfaadimata glükosaminoglükaanide (GAG) sünteesile hinnati Alcian sinise värvimisega pärast 48-tunnist inkubeerimist (n=4) (joonis 3). Märkimisväärset sünteesi suurenemist täheldati ainult UE ja DS-UE puhul 100 ug/ml juures, arvestades mõlemat sulfaaditut (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Huvitav on märkida, et DS-UE, rikkaim ulvanide fraktsioon, suurendas GAG-ide sünteesi kõige rohkem. 50 ug/ml juures suurendasid UE ja DS-UE sulfaadimata GAG-de sünteesi, kuid mitte oluliselt (vastavalt 14,2 protsenti ja pluss 22,7 protsenti). Oligosahhariidide fraktsioonid DEP-AD PP-UE kontsentratsioonis 1000 ug/ml vähendasid veidi sulfaadimata GAG-ide sünteesi, kuid mitte oluliselt ({12}} protsenti), ja DEP-HD PP-UE suurendasid veidi, kuid mitte oluliselt GAG-ide sünteesi 100 ug/ml juures. ml (pluss 4,1 protsenti sulfaaditud ja pluss 10,9 protsenti mittesulfaaditud).

Kollageeni kogusünteesi (joonis 4) hinnati Red Siriuse testiga pärast fibroblastide 48-tunnist kokkupuudet polü- ja oligosahhariidi Ulloa fraktsioonidega (n=7 100 ug/ml ja n{5}} 50 ug/mL juures). .

Kõik fraktsioonid näitasid kollageeni sünteesi kontsentratsioonist sõltuvat suurenemist. Piiratud ja mitteoluline kollageeni sünteesi langus täheldati kõikide fraktsioonide puhul 50 ug/ml juures võrreldes kontrollrühmaga. Seevastu 1000 ug/ml juures suurendasid kõik fraktsioonid kollageeni kogusünteesi ja oluliselt UE puhul (pluss 22 protsenti ,p<><0.01),and dep-hd=""><>

Polü- ja oligosahhariid Tuletatud EAE fraktsiooni mõju I tüüpi kollageeni sünteesile (n=6) ja MMP-1 sünteesile (n=4) hinnati ELISA testidega (joonis 5).

Kõik fraktsioonid suurendasid I tüüpi kollageeni sünteesi ja MP{0}} sünteesi, kuid mitte alati oluliselt. I tüüpi kollageeni sünteesi suurenemine sõltus kontsentratsioonist. Polüsahhariidide fraktsioonid UE ja DS-UE kontsentratsioonis 1000 ug/ml leiti oluliselt （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Polü- ja oligosahhariidi Ulloa fraktsioonide mõju 100 ug/ml juures pärast 48-tunnist kokkupuudet fibroblastidega I (n=5) tüüpi ja Ⅲ (n=4) tüüpi kollageenide sünteesile. MMP-1(n=6) ja TIMP-1(n=5) ​​tootmist hinnati Western blot (WB) analüüsiga normaliseerimismeetodil, kasutades kogu raja valgu meetodit ( Joonis 6).

Joonisel fig 6a, e ja WB rõhutasid vastavalt küpse I tüüpi kollageeni (≈130 kDa) ja küpse III tüüpi kollageeni (≈190 kDa) sünteesi suurenemist kõigi fraktsioonide puhul. Valkude kvantifitseerimine joonisel 6c I tüüpi kollageeni ja joonisel 6g III tüüpi kollageeni puhul näitas nende sünteesi NS (statistiliselt mitteolulist) suurenemist nii polü- kui ka oligosahhariidide Ulloa sp. murrud. Samal ajal võimaldas joonisel 6b, d olev WB meil kvantifitseerida märkimisväärse （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

MMP-1 kollagenaasi aktiivsus määrati zümograafia testiga polü- ja oligosahhariidi Ulloa fraktsioonide juuresolekul 100 ug/ml juures (joonis 7a), kvantifitseeriti ja võrreldi kontrolliga (joonis 7b) pärast 48-tunnist kokkupuudet fibroblastidega (n =4).

Tulemused näitasid, et nii polü- kui ka oligosahhariid Ulva sp. fraktsioonid ei suurendanud oluliselt fibroblastide MMP{1}} aktiivsust.

2.4. Ulva sp. polü- ja oligosahhariidide fraktsioonid. Fibroblastide ECM-i geeniekspressiooni diferentseerimine

Uuriti polü- ja oligosahhariidi Ulloa EAE-st pärinevate fraktsioonide mõju mitme rakuvälise maatriksi komponendi (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 ja TIMP-1) mRNA püsiseisundi tasemetele (n =4)(Joonis 8).

Märkasime, et kõik fraktsioonid 1000 ug/ml juures vähenesid oluliselt (lk<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Tabelis 2 on toodud kombineeritud tulemused geeni mRNA püsiseisundi tasemel pärast fibroblastide kokkupuudet fraktsioonidega 1000 ug/ml.

Tabel 2 näitab, et UE vähenes oluliselt (lk<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

See artikkel Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs