Fütokeemiline analüüs, proliferatsioonivastane in vitro, antioksüdant, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Taust:Rumex rothschildianus on perekonna Polygonaceae perekonna Rumex ainulaadse osa ainuke liige. See liik on väga haruldane väike kahekojaline üheaastane, Palestiinas endeemiline liik, mida kasutatakse traditsiooniliselt toiduna ja erinevate haiguste raviks. Seetõttu oli käesoleva uurimise eesmärk uurida R. rothschildianuse lehtede nelja lahustifraktsiooni keemilisi koostisosi, antioksüdante, anti-a-amülaasi, anti-a-glükosidaasi, prognoosida ja tsütotoksilist toimet.

Meetodid:R. rothschildianuse lehtede kuivatatud pulber ekstraheeriti neljas erineva polaarsusega lahustis. Ekstraktide komponentide määramiseks viidi läbi mitmeid kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid fütokeemilisi katseid. Kolorimeetrilist analüüsi kasutati fenoolide, flavonoidide ja tanniinide kvantitatiivseks määramiseks. In vitro testid viidi läbi, et hinnata ekstraktide antioksüdantide, anti-a-amülaasi, anti-a-glükosidaasi ja ennetada inhibeerivat toimet, samuti tsütotoksilisust MTS-testiga emakakaela kartsinoomi rakuliini (HeLa) ja rinnavähi rakuliini suhtes. (MCF7).

immunity2

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Tulemused:R. rothschildianus'e lehtede atsetoonifraktsioon oli kõige olulisemantioksüdantkõrgeima flavonoidide ja fenoolide sisalduse tõttu ICso väärtusega 6,3±0,4 ug/ml, võrreldes Troloxi 3,1±0,9 ug/ml-ga. lipaasi inhibeerimise aktiivsus näitas atsetoonifraktsioon kõige tugevamat aktiivsust ICso väärtusega 26,3±{{10}},6 ug/ml, võrreldes orlistati positiivse kontrolli ICso 12,3 ug/ml. Sama ekstrakt oli kõige tugevam a-amülaasi ja a-glükosidaasi inhibiitor, võrrelduna ICso väärtustega vastavalt 19,1±0,7 ug/ml ja 54,9±0,3 ug/ml vastavalt 28,8, 37,1±0,3 ug/ja akarboosi. Heksaanifraktsioon inhibeeris HeLa rakke 99,9 protsenti ja MCF7 rakke 97,4 protsenti.

Järeldus:R. rothschildianus'e lehtede atsetoonifraktsioon võib olla bioaktiivsete ühendite allikas oksüdatiivse stressi raviks. Samamoodi näitab heksaani fraktsioon R. rothschildianus'e paljutõotavat kasvajavastast potentsiaali. On selge, et need esialgsed näidustused vajavad potentsiaalselt aktiivsete ühendite täiendavat puhastamist ja lõpuks nende tõhususe määramiseks in vivo uuringuid.

Märksõnad:Rumex rothschildianus, antioksüdant, lipaas, amülaas, trolox, fütokeemia, proliferatsioonivastane toime

Taust

Taimi on teraapiana kasutatud iidsetest aegadest peale. Ravi eesmärgil on kasutatud juuri, seemneid, koort, lehti ja lilli. Tänapäeval on saadaval sünteetilised ravimid, mis on tõhusad paljude haiguste ravis; mõned inimesed eelistavad siiski taimseid ravimeid, kuna neid peetakse inimkehale vähem kahjulikeks [1,2]. Ravimtaimed on definitsiooni järgi fütokeemiliste ühendite allikad, millel on ravitoime. Need omadused sõltuvad erinevate sekundaarsete metaboliitide, nagu fenoolid, terpenoidid ja alkaloidid, olemasolust [3]. Rumex rothschildianus Aarons. on perekonna Polygonaceae perekonna Rumex ainulaadse osa ainuke liige. See liik on väga haruldane väike kahekojaline aastane, endeemiline Palestiinas. Selle keskmine kõrgus on 45 cm ja seda iseloomustavad püstised varred, millel on radikaalsed petiolate lehed, mis on põhjas lühikese ja tipus lühikese teravusega. Lillede läbimõõt on 3-4 mm, samal ajal kui püstillakujuliste lillede läbimõõt on umbes 2 mm ja sellel on koorikjas kilekiht [4]. Rumex spp. on laialt levinud Türgi erinevates piirkondades ja neid esindab 22 liiki. Mõned levinumad liigid on R.patia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus ja R. caucasicus on mitmeaastased taimed, mis on levinud Kesk- ja Ida-Anatoolias kõrgusel {{10 }} m üle merepinna. Perekonda Rumex on Türgi traditsioonilises meditsiinis laialdaselt kasutatud selliste häirete raviks nagu kõhukinnisus, kõhulahtisus ja ekseem [5, 6]. Sellel perekonnal on ka lahtistav, diureetikum, palavikku alandav, haavu parandav ja põletikuvastane toime. Paljud inimesed Türgi idaosas kasutavad Rumex spp. noori lehti. juustu säilitusainena, samuti toidule aroomi andev [7].

immunity4

Rumexi liikide kohta on tehtud mitmesuguseid uuringuid, näiteks on teatatud mõne liigi antimikroobse toime kohta. Rumex vicarious L-st on varem leitud mõningaid bioaktiivseid fütokemikaale, näiteks karotenoide, tokoferoole, polüfenoole, flavonoide ja askorbiinhapet, millel on antioksüdantide ja looduslike detoksifitseerivate ainete roll. Antioksüdantsete fütokemikaalide, näiteks karotenoidide, toiduga tarbimine,fenoolidjaflavonoididvõib kaitsta inimesi mittenakkuslike haiguste eest, nagu vähk, südame-veresoonkonna häired ja muud oksüdatiivse stressiga seotud terviseprobleemid [5, 8]. Kahjulikud vabad radikaalid mängivad teadaolevalt olulist rolli paljudes suuremates terviseprobleemides, nagu vähk, südame-veresoonkonna haigused, reumatoidartriit, katarakt,Alzheimeri tõbija muud vananemisega seotud degeneratiivsed haigused. Antioksüdandid on kasulikud komponendid, mis neutraliseerivad need vabad radikaalid enne, kui nad suudavad rakke rünnata, ja seega hoiavad ära rakuvalkude, lipiidide jasüsivesikuid. Inimeste haiguste raviks on välja pakutud mitmesuguseid nii looduslikke kui ka sünteetilisi antioksüdante. Taoline huvi antioksüdantide rolli vastu inimeste tervises on ajendanud uurima toiduteaduse ja ravimtaimede valdkonda, hinnates ürtide funktsiooni antioksüdantidena. Antioksüdantne toime hõlmab vabade radikaalide eemaldamise võimet, lipiidide peroksüdatsiooni pärssimist, metalliioonide kelaatimise võimet ja ka redutseerimisvõimet [9,10].

Vähk on üks globaalsemaid tervishoiuprobleeme. Uute vähivastaste ravimite väljatöötamine ja avastamine on mitmesuguste tegurite tõttu äärmiselt oluline. Need tegurid hõlmavad ravi, mis võib põhjustada suuri kõrvaltoimeid või olla üsna kulukas. Bioloogiliselt ohutumad ja soodsamad alternatiivid on endiselt väga soovitavad [11-14].

immunity3

Mitmeid taimeliike peetakse potentsiaalseteks bioaktiivsete molekulide allikateks, nagu atropiin Belladonna lehtedest, kokaiin kokalehtedest, vinkristiin Vinca taimest ja paljud teised, mis mängivad tänapäeva meditsiinis endiselt olulist rolli [15,16].

Kasulik ravitoime võib tuleneda ravimtaimedes leiduvate sekundaarsete toodete segamisest. Need ühendid on enamasti sekundaarsed metaboliidid, nagu alkaloidid, steroidid, tanniinid, flavonoidid ja fenoolid, mis sünteesitakse ja ladestuvad nende taimede teatud osadesse [17,18]. Käesolevas uuringus uuritakse R. rothschildianuse lehtedest ekstraheeritud erinevate fraktsioonide in vitro anti-a-amülaasi, anti- -glükosidaasi, anti-lipaasi, antiproliferatiivset ja antioksüdantset toimet.

meetodid

Taimne materjal, kemikaalid ja instrumendid

R. rothschildianuse lehed koguti Palestiina läänepoolsetest piirkondadest 2018. aasta veebruarist märtsini. Need tuvastas dr Nidal Jaradat An-Najahi riikliku ülikooli farmakognoosilaboratooriumist vautšeri näidiskoodiga Pharm-PCT{{3} }. Kõik kemikaalid osteti firmalt Sigma-Aldrich. Spektrofotomeeter-UV/nähtav (Jenway kraad 7135, Stafford-shire, Ühendkuningriik), filterpaberid (Whitman No. 1, Washington, USA), loksutusseade (Memmert 531-25-1, Stockholm, Rootsi), pöördaurusti (Heidolph) -VV 2000, Schwa-bach, Saksamaa), veski (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Hiina), elektrooniline tasakaal (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Poola), külmkuivati-BT85 (Millrock Technology, Hiina) ja krüoeksikaatorit (Mill-rock Technology, BT85, Kingston, USA) kasutati.

Ekstraktide valmistamine ja fraktsioneerimine

R. rothschildianuse lehtede kuivatatud pulber ekstraheeriti, lisades lahusteid järjestikku nende polaarsuse alusel, alustades mittepolaarsest lahustist heksaanist ja seejärel atsetoonist (polaarne aprotoonne orgaaniline lahusti), metanooli (polaarne alkohol) ja lõpuks destilleeritud veest (a polaarne protoonne lahusti). Iga ekstraheerimise jaoks pandi umbes 25 g jahvatatud kuivatatud lehti 0,51 heksaanis 72 tunniks loksutisse 100 pööret minutis 25 kraadi juures. Esiteks asendati heksaan 0,5 l atsetooniga ja seejärel asendati samaväärsed kogused metanooli ja vett. Inkubeerimine lahustites toimus nagu ülalpool heksaani puhul kirjeldatud. Iga orgaaniline fraktsioon filtriti ja kontsentreeriti vaakumis rotaatoraurustil, samal ajal kui vesifraktsioon kuivatati külmkuivatis. Lõpuks säilitati kõik toorfraktsioonid 4 kraadi juures [19, 20].

Iga fraktsiooni saagis arvutati järgmise valemi abil:

Esialgne fütokeemiline hinnang

Aktiivsete sekundaarsete metaboliitide tuvastamiseks viidi läbi R. rothschildianuse lehtede fütokeemilised skriiningtestid neljas fraktsioonis. Kvalitatiivsed tulemused väljendati (pluss) bioaktiivsete fütokemikaalide olemasolu ja (-) puudumise kohta[10,21].

Üldfenoolisisalduse (TPC) määramine

TPC määramise protseduur põhines Cheungi et al. TPC väljendati gallushappe ekvivalentidena milligrammides lehtede kuivmassi grammi kohta (mg GA/g kuivmassi kohta). Värskelt valmistatud 7,5% naatriumkarbonaadi lahus valmistati, asetades 7,5 g Na2CO3 mõõtekolbi ja reguleerides destilleeritud veega mahuni 100 ml. Standardne võrdluslahus (gallushappe lahus) valmistati 100 mg gallushappe lahustamisega destilleeritud vees lõppmahuni 100 ml. Sellest tehti seerialahjendus, et saada gallushappe lahused kontsentratsioonides 100, 70, 50, 40 ja 10 ug/ml. Lehtede fraktsioonide põhilahused valmistati 100 mg taimeekstrakti lahustamisega destilleeritud vees ja viidi kogumahuni 100 ml. Reaktsioonisegud valmistati, segades 0,5 ml iga fraktsiooni lahust 2,5 ml 10% Folin-Ciocalteu reagendiga, mis lahustati vees 2,5 ml 7,5% naatriumvesinikkarbonaadiga. Proovituube inkubeeriti 45 minutit 45 kraadi juures. Seejärel mõõdeti igaühe neeldumine spektrofotomeetriga lainepikkusel 765 nm. Tööproovid valmistati igaks analüütiliseks katseks kolmes eksemplaris, millest arvutati keskmised ja standardhälbe väärtused [21].

Flavonoidide üldsisalduse (TFC) määramine

TFC-d neljas R. rothschildianus'e lehefraktsioonis hinnati rutiini (standardne võrdlusühend) kalibreerimiskõvera abil. Tulemused väljendati milligrammi rutiini ekvivalendina lehtede ekstrakti kuivmassi grammi kohta (mg RU/g kuivmassi kohta). Rutiini kalibreerimiskõver loodi, kasutades seerialahjendusi, mis saadi põhilahusest 1{{10}}0 ug/ml. Põhilahuse valmistamiseks lahustati 10 mg rutiini 10 ml destilleeritud vees ja lahjendati seejärel 100 ml-ni. Seejärel põhilahus lahjendati, et saada rutiini kontsentratsioonid 10, 30, 40, 50, 70 ja 100 ug/ml. Töölahuse valmistamiseks segati 0,5 ml iga fraktsiooni lahust 3 ml metanooli, 0,2 ml 10% AlCl3, 0,2 ml 1 M kaaliumatsetaadi ja 5 ml destilleeritud veega ning seejärel inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit. Eelmisi samme korrati iga fraktsiooni jaoks, mille järel mõõdeti neeldumist lainepikkusel 415 nm. Pimekatse jaoks lisati prooviekstrakti asemel töölahus destilleeritud veega. Iga analüütilise katse jaoks valmistati proove kolmes eksemplaris, millest arvutati välja keskmised ja standardhälbe väärtused [22].

Improve immunity

Summaarse tanniinisisalduse (TTC) määramine Sun et al. kasutati TTC määramiseks neljas R. rothschildianus'e lehefraktsioonis, mis on kõige sagedamini kasutatav protseduur. Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutati võrdlusühendina katehhiini. Valmistati metanoolis 100 ug/ml põhilahus, millest loodi lahjendusseeria, et saada katehhiini kontsentratsioonid 10, 30, 50, 70 ja 100 ug/ml. Värskelt valmistati 4-protsendiline vanilliini lahus metanoolis. Fraktsioonide põhilahused kontsentratsiooniga 100 ug/ml valmistati, kasutades lahustina metanooli. Töölahuse jaoks segati 0,5 ml iga fraktsiooni lahust 3 ml vanilliinilahuse ja 1,5 ml kontsentreeritud HCl-ga. Segul lasti seista 15 minutit ja seejärel mõõdeti neeldumine 500 nm juures, kasutades pimekatsena prooviekstrakti asemel metanooliga seadistatud töölahust. Kõiki tööproove analüüsiti kolmes korduses, millest arvutati keskmised ja standardhälbe väärtused. Iga fraktsiooni tanniini kogusumma väljendati katehhiini ekvivalentidena (mg CAE/g lehtede kuivmassi kohta)[23].

Antioksüdantse toime meetod

Vaba 2,2-difenüülpikrüülhüdrasüüli (DPPH) radikaali püüdmise testi kasutati antioksüdantse aktiivsuse mõõtmiseks R. rothschildianus'e lehtede erinevates fraktsioonides. Igast taimefraktsioonist valmistati metanoolis 1000 ug/ml põhilahus. Lisaks valmistati ka 1000 ug/ml Troloxi lahus (võrdlusstandard). Iga fraktsiooni põhilahustest valmistati lahjendusseeria, mis andis kuus järjestikust lahjendust 2, 5, 10, 20, 50 ja 100 ug/ml. Üks ml igast ekstrakti lahjendusest segati 1 ml 0,002 g/ml DPPH-ga metanoolis. Lisati 1 ml metanooli, et saada lõplikuks töömahuks 3 ml. DPPH lahus valmistati värskelt, kuna see oli väga valgustundlik. Seeriakontsentratsioonide pimekontroll oli DPPH metanoolis vahekorras 1:2, ilma ekstrakti lisamata. Kõiki töölahuseid inkubeeriti toatemperatuuril (25 °C) pimedas umbes 30 minutit. Seejärel mõõdeti optilist tihedust spektrofotomeetriga lainepikkusel 517 nm. DPPH inhibeerimise protsendi arvutamiseks iga taimefraktsiooni jaoks kasutati järgmist võrrandit, standardühendina Trolox:

kus Ag on pimelahuse registreeritud neeldumine ja Ats on testitud proovilahuse registreeritud neeldumine [21].

Sigade pankrease lipaasi inhibeerimise test

Igast taimefraktsioonist valmistati põhilahused kontsentratsiooniga 500 ug/ml 10 protsendilises DMSO-s. Nendest tehti viiest kontsentratsioonist 50,100,200, 300 ja 400 ug/ml koosnev lahjendusseeria. Sea pankrease lipaasi 1 mg/ml põhilahus Tris-HCl puhvris valmistati värskelt vahetult enne kasutamist. Substraat p-nitrofenüülbutüraat (PNPB) valmistati 20,9 mg lahustamisega 2 ml atsetonitriilis. Iga töölahuse jaoks segati 0,1 ml sea pankrease lipaasi 0,2 ml taimefraktsiooniga lahjendusseeria igast liikmest. Lisati Tris-HCl, et töölahuste lõppmaht oleks 1 ml, ja neid inkubeeriti 37 °C juures 15 minutit. Pärast inkubeerimist lisati igasse katseklaasi 0,1 ml p-nitrofenüülbutüraadi lahust. Seejärel inkubeeriti segu veel 30 minutit 37 kraadi juures. Pankrease lipaasi aktiivsus määrati, mõõtes PNPB hüdrolüüsi p-nitrofenolaadiks lainepikkusel 410 nm, kasutades UV-spektrofotomeetrit. Sama protseduuri korrati, kasutades standardse võrdlusühendina orlistati. Lipaasi inhibeerimise protsent taimefraktsioonide poolt arvutati järgmise võrrandiga:

kus Ap on pimelahuse registreeritud neeldumine ja Ats on testitud proovilahuse registreeritud neeldumine [24]. a-amülaasi inhibeerimise test

A100 mg igast fraktsioonist lahustati mõnes millimeetris 10 protsendilises DMSO-s ja seejärel lahustati kuni 100 ml 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4, 0,006 M NaCl, pH 6,9, et saada lõpuks põhilahused kontsentratsiooniga 1000 ug/ml. Nendest valmistati järgmised lahjendused 10, 50, 70, 100 ja 500 ug/ml, kasutades lahjendina 10% DMSO-d. 0,2 ml 2 ühikut/ml sea pankrease amülaasi segati 0,2 ml

taimefraktsiooni ja inkubeeriti 10min 30 kraadi juures. Pärast inkubeerimist lisati 0,2 ml värskelt valmistatud 1-protsendilist tärkliselahust vees ja tuube inkubeeriti veel vähemalt kolm minutit. Sel hetkel reaktsioon peatati 0,2 ml 3,5-dinitrosalitsüülhappe (DNSA) värvireagendi lisamisega ja lahjendati 5 ml destilleeritud veega, seejärel kuumutati 90 kraadi juures 10 minutit vees. vann. Seejärel jahutati segu toatemperatuurini ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 540 nm. Pimekatse valmistamisel kasutati samu koguseid, mida on kirjeldatud ülal, kuid taimefraktsioon asendati 0,2 ml puhvriga. Akarboosi kasutati standardse võrdlusalusena, järgides ülalkirjeldatud protseduuri. a-amülaasi inhibeeriv aktiivsus arvutati järgmise võrrandi abil: