Füüsiline treening pärsib fibroosi teket Alzheimeri tõve korral neerudes, mõjutades TGFB signaaliradu

edmund.chen@wecistanche.com

SISSEJUHATUS 

Alzheimeri tõbi (AD) on kõige levinum dementsuse vorm, kuid selle süsteemse välimuse üle on hakatud rääkima alles viimastel aastakümnetel. Kuigi ravimite ja haigusi modifitseerivate ravimeetodite väljatöötamiseks on tehtud suuri jõupingutusi, ei ole seni raviprotseduure saadaval [1–3]. Amüloidnaastude teket ja amüloidvalgu prekursorite (APP) ebanormaalset funktsiooni peetakse haiguse esimesteks tunnusteks mitte ainult kesknärvisüsteemis (KNS), vaid ka selle perifeerias [4]. Veenvad tõendid toetavad amüloid-B (AB) keskset rolli AD patogeneesis [5], viidates sellele, et AB vähenenud kliirens on üks patomehhanismi võtmeprotsesse. AD korral on kaasatud mitmed perifeersed organid, nagu munandid [5], pankreas [6] janeerud[7], mis tõstab esile mitme sihtmärgiga kompleksse süsteemse haiguse arengut [8]. On tõestatud, etneerudosaleb AB kliirensis [9]. Veelgi enam, AB kontsentratsioon seerumis on kroonilise haiguse korral märkimisväärselt kõrgemneeruhaigus (CKD) patsiendid [10, 11]. AB akumulatsiooni on näidatud kaneerud[12], mis põhjustab filtreerimishäireid. Õiget filtreerimist reguleerib osaliselt transformeeriv kasvufaktor B (TGFB), mis on peamine tsütokiin patogeneesis.neeru-põletik ja fibroos [13] ning see on tuntud ka kui oluline tegur AD patogeneesis [14]. AD korral mängib TGFB signaalimine rolli mikrogliia aktiveerimises ja astrotsüütide poolt vahendatud neuroprotektsioonis [15]. Lisaks mõjutab TGFB muutunud ekspressioon ka põletikku kesknärvisüsteemis ja perifeersetes kudedes [13, 16].

CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST

TGFB-l on kolm isovormi: TGFB1, TGFB2 ja TGFB3 [17]. TGFB1 osaleb mitmetes protsessides, nagu loote areng, rakkude kasvu ja diferentseerumise kontroll, fibroos ja armkoe moodustumine, kasvaja kasv ja immuunvastus [18]. See on oluline tsütokiin fibroosi moodustumisel erinevates organites nagu maks janeerud[19]. TGFB1 moodustab dimeere, mis esmalt seonduvad TGFB II tüüpi retseptoriga (TGFRII), seejärel aktiveerivad I tüüpi TGFB retseptori (TGFRI) Ser/Thr kinaasi, käivitades Smad transkriptsioonifaktorite rakusisese signaalikompleksi moodustumise. Kanoonilises TGFB signaalirajas fosforüülitakse Smad2/3 transkriptsioonifaktorid ja pärast kompleksi moodustumist Smad4-ga siirduvad nad tuuma [20]. TGFB1 aktiveerimine võib mõjutada mitmeid geene, kuna see indutseerib erinevate kollageenide ekspressiooni, kontrollib rakkude proliferatsiooni, mõjutab apoptoosi [20] ja reguleerib maatriksi metalloproteinaasi (MMP) ekspressiooni [21]. Mittekanooniline TGFB signaalirada käivitab MAPK-de aktiveerimise fosforüülimise teel, mis omakorda võib indutseerida edasist TGFB ekspressiooni [22]. JNK ja p38 kinaasid kui TGFB sihtmärgid on identifitseeritudneeru-fibroosi ja reguleerida apoptoosi [23].

On näidatud, et füüsiline aktiivsus avaldab inimpatsientidele kasulikku mõju. Treening võib reguleerida ja edasi lükata AD avaldumist [24, 25] ning samuti on teatatud AD biomarkerite, nagu tau ja AB, vähenemisest plasmas [25]. On leitud, et füüsiline aktiivsus vähendab AD, AD-ga seotud neuropatoloogilise koormuse ja kognitiivse languse esinemissagedust [26]. Kuigi füüsilise aktiivsuse eeliste kohta AD moodustumisel on avaldatud arvukalt uuringuid [27], ei ole nende positiivsete mõjudega seotud rakusiseseid mehhanisme üksikasjalikult arutatud. On mõned loommudelid, kus tau ja AB üleekspressiooniga geneetiliselt muundatud hiiri on füüsilise koormuse ajal testitud. Nendes mudelites on tõestatud, et kõrgenenud füüsiline aktiivsus suutis AD avaldumist edasi lükata [28, 29]. Lisaks näidati, et nende hiirte pikaajaline treenimine avaldas positiivset mõju perifeersete elundite düsfunktsioonidele AD-s. Füüsiline aktiivsus muutis AD-s PACAP-BMP läbirääkimistneerudIV ja A tüüpi kollageeni akumulatsiooni ekspressiooni normaliseerimise kaudu [30]. Lisaks on avaldatud üksikasjalik analüüs Sox9 ekspressiooni treenimise kaitsefunktsioonist AD munandites [31]. Aktiivne treening mõjutab ka TGFB signaalimist, kuna see pärsibneeru-põletik ja sellele järgnev fibroos [32]. Lisaks on TGFB ja selle signaalimine oluline täiskasvanud luude ümberkujundamiseks, mis on häiritudneerudfibroos [33]. Seejärel oli meie peamine hüpotees, et pikaajalisel füüsilisel treeningul on süsteemne mõju TGFB signaaliülekandele, mis võib reguleeridaneerudmaatriksi tootmine AD-s. Nende signaaliradade muutused võivad põhjustada vähenemist neerudfibroosi ja normaliseerida AD kliirensit. Seetõttu oli meie eesmärk selgitada seost TGFB-signalisatsiooni ja füüsilise treeningu kasulike mõjude vahel.neerudfibroos AD-s. Oma katsetes esitame tõendeid selle kohta, et pikaajalisel koolitusel on otsene mõju TGFB signalisatsioonileneerudAD hiirtest. Lisaks näitame, et suurenenud füüsiline koormus vähenebneerudfibroos kanoonilise ja mittekanoonilise TGFB signaalimise normaliseerimise kaudu.

Märksõnad:Alzheimeri tõbi, fibroos, füüsiline aktiivsus, Smad, neeruhaigus; neeru-

CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI

MATERJALID JA MEETODID

LoomAD mõju jälgimiseks kasutati isaseid Alzheimeri-transgeenseid (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) hiiri. Kolmekuused metsiktüüp (WT) (transgeense modulatsiooni ja koolituseta) (n=5), Alzheimeri tõve transgeensed hiired (AD) (n=5) ja treenitud AD (TAD) (n=5) hiiri hoiti valguse/pimeduse tsüklites 12/12 h koos toidu ja veega ad libitum. Treeningule ja kombineeritud rühmale rakendati intervalljooksu. Varem olid kõik treenivad loomad 2 nädala jooksul harjunud mootoriga jooksulint (Columbus Inst., Columbus Ohio, USA) ja jooksukiirusega. Treening toimus neli korda nädalas, 60 min. Iga treening kestis 10 tsüklit, iga tsükkel koosnes 4 minutist kõrge intensiivsusega ja 2 minutist madala intensiivsusega jooksust. Madala intensiivsusega jooksukiirus oli katse ajal püsiv, mis tähendab kiirust 10 m/min. Kõrge intensiivsusega jooksukiirus algas 16 m/min ja seda tõsteti igal kolmandal nädalal kiirusega 1 m/min, kuni saavutati kiirus 20 m/min. Kontroll- ja toitumisrühm harjusid samuti jooksulindiga ja viibisid seal 5 minutit päevas seisval jooksulindil [28]. Katseid alustati 3-kuuste loomadega ja need lõpetati 10 kuu vanuselt. Uuring viidi läbi eetiliste juhiste kohaselt (selle uuringu eetilise loa number: PEI/001/2105-6/2014, Semmelweisi ülikool, Ungari). Loomade genotüpiseerimiseks kasutati Phire Animal Tissue Direct PCR komplekti (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) vastavalt tootja juhistele.

Valgusmikroskoopiline morfoloogiaPärast kõigi kognitiivsete testide lõppu tuimastati {{0}} kuu vanused hiired ketamiini (Richter, kontsentratsioon: 100 mg/ml)/ksülasiini (Produlab Pharma, kontsentratsioon: 20 mg/) intraperitoneaalse süstiga. ml) kokteili annuses 0,1 ml/10 g kehamassi kohta ja perfuseeritud transkardiaalselt hepariniseeritud jääkülma soolalahusega [28] janeerudeemaldati. Koeproove pesti kolm korda PBS-is ja fikseeriti absoluutse etanooli ja 40% formaldehüüdi 4:1 segus, seejärel sisestati parafiini. Massoni trikroomvärvimiseks (Sigma-Aldrich, MO, USA) tehti seerialõigud ja visualiseeriti fibrootiline kude. Värvimisprotokoll viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Mikrofotode tegemiseks kasutati DP74 kaamerat (Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan) Olympus Bx53 mikroskoobis (Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan).

Immunohistokeemiakanti etteneerudkoeproovid WT-, AD- ja TAD-hiirtelt, et visualiseerida Smad2, PCNA (prolifereeruv raku tuumaantigeen) ja I tüüpi kollageeni (kolg I) lokaliseerimine [30].Neerudfikseeriti absoluutse etanooli ja 4{41}}% formaldehüüdi 4:1 segus ning pesti 70% etanoolis. Pärast seerialõikude manustamist järgnes deparafineerimisele loputamine PBS-s (pH 7,4). Mittespetsiifilised seondumissaidid blokeeriti 1% veise seerumi albumiiniga, mis oli lahustatud PBS-is (Amresco LLC, Solon, OH, USA). Sektsioone inkubeeriti polüklonaalse Smad2-ga (Sigma-Aldrich, MO, USA) lahjendusega 1:500, PCNA-ga (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) lahjendusega 1:800 või kolonniga I (Sigma-Aldrich, MO, USA) antikeha lahjenduses 1:500 temperatuuril 4 °C üleöö. Primaarsed antikehad visualiseeriti küülikuvastase Alexa Fluor 555 sekundaarse antikeha lisamisega (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) kasutati lahjenduses 1:1000. Proovid paigaldati tuuma DNA värvimiseks Vectashieldi paigaldussöötmesse (Vector Laboratories, Peterborough, Inglismaa), mis sisaldas DAPI-d (4, 6-diamidino-2-fenüülindooldivesinikkloriid). Küülikuvastast Alexa Fluor 555 kasutati negatiivse kontrolli jaoks ilma primaarsete antikehadeta. Kolonni I visualiseerimiseks tehti mikrofotod DP74 kaameraga (Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan) Olympus Bx53 mikroskoobiga (Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan). Pildid saadi, kasutades tarkvara cellSense Entry 1.5 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Jaapan) ) pidevate kaameraseadetega, et võimaldada FL fluorestsentssignaali intensiivsuse võrdlemist. Smad2 ja PCNA tuvastamiseks kasutati Olympus FV3000 konfokaalset mikroskoopi (Olympus Co. Tokyo, Jaapan), kasutades 60-kordset õliimmersioonobjektiivi (NA: 1,42). Ergastamiseks kasutati 543 nm laserjooni. Keskmine piksliaeg oli 4Bs. 1 m optilise paksusega Z pildiseeriad salvestati järjestikuse skaneerimise režiimis. Alexa555 ja DAPI pildid kaeti Adobe Photoshopi versiooni 10.0 tarkvara abil. Piltide kontrastsust suurendati võrdselt ilma pidevaid seadeid muutmata.

RT-PCR analüüsNeerudWT (n=5), AD (n=5) ja TAD (n=5) jahvatati mehaaniliselt ja lahustati Tri zolis (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ), pärast 30-minutilist inkubeerimist 4 °C juures eraldati kogu RNA [30]. RNA koguti RNaasi-vabas vees ja säilitati temperatuuril –70 °C. High Capacity RT komplekti kasutati pöördtranskriptsiooniks (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kasutatud praimeripaaride järjestuste ja polümeraasi ahelreaktsioonide üksikasjade kohta vt tabelist 1. Amplifikatsioonid viidi läbi termotsükleris (Labnet MultiGene™ 96-kaevuga Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, USA). järgneb: 95 °C, 2 min, millele järgneb 35 tsüklit (denatureerimine, 94 °C, 30 s, lõõmutamine 45 s optimeeritud temperatuuridel, nagu on näidatud tabelis 1; pikendamine, 72 °C, 90 s) ja seejärel 72 °C ,

7 min. Sisekontrollina kasutati aktiini. PCR-produkte analüüsiti 1,2-protsendilise etiidiumbromiidi sisaldava agaroosgeeliga ja dokumenteeriti FluorchemE geeldokumetaarse süsteemiga (ProteinSimple, CA, USA). PCR-produkti signaalide optilised tihedused määrati ImageJ 1,40 g vabavara abil. Enne optilise tiheduse mõõtmist tegime iga mikrofoto puhul individuaalsed kalibreerimised. Seejärel suurendasime fotode suurendust, et jõuda üksikute pikslite suuruseni ning vabakäemeetodil ringutati rajad täpselt ja mõõdeti ala integreeritud tihedus. Piksleid mõõdeti 5 sõltumatu katsega 3 sõltumatu operaatori poolt. Kõigepealt võrreldi signaale WT aktiiniga, et paremini võrrelda ekspressioonierinevusi AD ja TAD hiirtel. Radade all olevad numbrid näitavad katsete statistilist analüüsi, kus iga eraldi katse (vähemalt 5) normaliseeriti oma aktiini signaali jaoks ja seejärel arvutati statistilised erinevused.

Western blot analüüs

NeerudWT (n {0}}), AD (n=5) ja TAD hiiri (n=5) pesti füsioloogilises soolalahuses N ja säilitati temperatuuril –7{{1 0}}◦C. Proovid jahvatati mehaaniliselt vedelas lämmastikus ja koguti 100 ml homogeniseerimispuhvris RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) (150 mM naatriumkloriid; 1,0 protsenti NP40, 0,5 protsenti naatriumdeoksükolaati; 50 mMTris, pH 8,0), mis sisaldas proteiinaasi inhibiitoreid (protinaasi inhibiitorid) 10 g/ml), 5 mM bensamidiin, leupeptiin (10 ug/ml), trüpsiini inhibiitor (10 g/mL), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluoriidi, 1 mM Na-ortovanadaat). Pelleteid töödeldi ultraheliga 30 sekundi jooksul 40 A juures pulsspurskega (ColeParmer, IL, USA). Valmistati westernblot analüüside kogu rakulüsaadid [30]. 20 g valku eraldati 7,5% SDS-polüakrüülamiidgeelides, et tuvastada TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, lõhustatud kaspaas3, MMP9, I tüüpi kollageen (I veerg) ja aktiin. Ser/Thr aminohapete kõrvalahelate fosforüülimise taseme tuvastamiseks kasutati PhosphoSer/Thr detekteerimiskomplekti (Millipore, Billerica, MA, USA). Valgud blotiti nitrotselluloosmembraanidele ja eksponeeriti primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C lahjenduses, nagu on näidatud tabelis 2. Inkubeerimisele järgnes 30-minutiline PBST pesemine, seejärel kaeti membraanid peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarse antikehaga küülikuvastase IgG-ga. :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) või hiirevastane IgG 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) lahjenduses. Tuvastamiseks kasutati tugevdatud kemoluminestsentsi (Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Sisekontrollina kasutati aktiini. Signaalid jäädvustati jahutatud kaameraga geeldokumentaalsüsteemis (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, USA). Signaalide optilisi tihedusi mõõdeti ImageJ 1,40g vabavara abil. Enne optilise tiheduse mõõtmist tegime iga mikrofoto puhul individuaalsed kalibreerimised. Seejärel suurendasime fotode suurendust, et jõuda üksikute pikslite suuruseni ning vabakäemeetodil ringutati rajad täpselt ja mõõdeti ala integreeritud tihedus. Piksleid mõõdeti 5 sõltumatu katsega 3 sõltumatu operaatori poolt. Kõigepealt võrreldi signaale WT aktiiniga, et paremini võrrelda AD ja TAD ekspressioonierinevusi. Radade all olevad numbrid näitavad katsete statistilist analüüsi, kus iga eraldi katse (vähemalt 5) normaliseeriti oma aktiini signaaliga ja seejärel arvutati statistilised erinevused.

Statistiline analüüsKõik andmed esindavad vähemalt viit sõltumatut katset. Kõigi jooniste jaoks valiti parema võrdluse huvides samade WT, AD ja TAD loomade proovid nende sisemise kontrolliga. Igal figuuril kasutati ainult ühte demonstratiivset fotot samast loomarühmast. Statistiline analüüs viidi läbi ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey HSD post-hoc test. Statistiliselt oluliste erinevuste lävi võrreldes kontrollproovidega määrati väärtusele ∗p < 0.05="" ja="" ad="" proovide="" puhul="" #p="">< 0,05.="" ∗="" tähistab="" erinevusi="" wt="" võrreldes="" ad="" ja="" tad-ga,="" #="" tähistab="" erinevusi="" ad="" võrreldes="">

TULEMUSED

Füüsiline aktiivsus normaliseeris kanoonilise TGF signaaliülekanderaja AD hiirte neerudesÜksikasjalikult uuriti kanoonilise TGFB signaaliraja elementide ekspressiooni. TGFB1 valgu ja mRNA ekspressioon ei näidanud olulist erinevustneerudWT ja AD hiirte arvu võrreldi, kuid suurenenud ekspressioon leiti TAD proovides (joonis 1A, B). TGFRI ekspressioon vähenes AD korral, kuid füüsiline aktiivsus normaliseeris selle (joonis 1A, B), samas kui TGFBRII ekspressioon tõusisneerudAD hiirtel, kuid vähenes pärast füüsilist aktiivsust (joonis 1A, B). Kooskõlas nende tähelepanekutega suurenes Smad2 ekspressioon AD proovides ja see normaliseeriti pärast füüsilistaktiivsus (joon. 1A, B). Vastupidi, Smad3 ekspressioon näitas mõõdukat langustneerudAD hiirtest, mis kompenseeriti TAD proovides (joonis 1A, B). Smad2 positiivsete signaalide tõusu täheldati ajukoore torukujulises süsteemis, kuid mitteneeru-veresooned AD hiirtel. See tõus vähenes TAD loomade tuubulites (joonis 1C).

Mittekanoonilisi signalisatsiooniteid muudeti AD hiirte neerudes pärast füüsilist aktiivsustMAPK-d, nagu ERK, p38 ja JNK, moodustavad mittekanoonilise TGF-signaali olulise osa [22]. ERK mRNA ekspressioon ei muutunudneerudAD hiirtel, kuid näitas TAD proovide vähenemist (joonis 2A). Selle kinaasi valgu ekspressioon ei olnud korrelatsioonis mRNA ekspressiooniga ja tuvastati tugev vähenemineneerudAD hiirtel, kelle kehaline aktiivsus oli mõõdukalt normaliseerunud (joonis 2B). Aktiivne, fosforüülitud vorm oli AD proovides huvitavalt kõrgem ja näitas sarnast vähenemistneerudTAD hiirtel (joonis 2B). p38 mRNA ekspressioon ei muutunud oluliselt üheski proovis (joonis 2A). P38 valgu ekspressioon suurenes tugevaltneerudAD hiirtel, mida osaliselt kompenseeris füüsiline aktiivsus (joonis 2B). Huvitaval kombel näitas aktiivsem fosforüülitud vorm AD proovide vähenemist, mis

normaliseeriti TAD loomadel (joonis 2B). JNK mRNA ekspressioon vähenes nii AD kui ka TAD proovides (joonis 2A). JNK kahe isovormi valgu ekspressioon tuvastati Western blot analüüsiga. Avastati JNK1 ja JNK2 mitteliigsed funktsioonid [34] ning tuvastati AD proovides 57 kDa isovormi ja 46 kDa isovormi oluline vähenemine (joonis 2B). 57 kDa ja 46 kDa isovormid näitasid pärast füüsilist aktiivsust tõusuneerudTAD hiirtel (joonis 2B).

Ser / Thr fosfataaside muutunud ekspressioon ja modifitseeritud valgu fosforüülimine AD-sAD-s on näidatud muutunud Ser/Thr-spetsiifilise valgu fosfataasi ekspressiooni ja funktsiooni [35, 36]. Me tuvastasime PP2B suurenenud ekspressioonineerudAD hiirtel, kuid see vähenes füüsilise aktiivsuse tõttu (joonis 2A, B). Vastupidi, teise peamise rakulise Ser/Thr-spetsiifilise fosfataasi PP2A ekspressioon ilmnes koos tugeva vähenemiseganeerudAD hiirtel (joonis 2A, B). TAD proovides suurenes PP2A katalüütilise subühiku mRNA ja valgu ekspressioon (joonis 2A, B). Valkude fosforüülimise uurimine Ser/Thr jääkidel näitas tugevat signaali 55 kDa juuresneerudAD hiirtel, mis esindavad tau molekulmassi (joonis 2C). Teine kõrgendatud riba ilmus 10 kDa juures, mis vastab APP lõhustatud C-otsa molekulmassile (joonis 2C). Nende mõlema valgu fosforüülimine vähenes treeningu ajal (joonis 2C).

TGF-i signaalimine mõjutas rakutsüklit ja apoptoosiRakkude proliferatsiooni markeritena jälgiti p21 ja PCNA ekspressioonitasemeid. On teada, et TGFB aktiveerimine indutseerib p21 ekspressiooni [37]. Lisaks põhjustab TGFB1 aktiveerimine muutunud rakkude proliferatsiooni [38]. Seetõttu uuriti proliferatiivse raku tuumaantigeeni (PCNA) ekspressiooni. P21 valgu tase oli AD korral oluliselt kõrgem, kuid TAD proovides vähenes (joonis 3A, B). PCNA reageeris erinevalt: AD põhjustas valguekspressiooni vähenemist, samas kui PCNA valk suurenes treenimisel (joonis 3A, B). PCNA-positiivsete rakkude tuvastamiseks viidi läbi immunohistokeemia ja selle tulemusel vähenes immunoreaktiivsus AD hiirte neerude tubulaarsetes rakkudes. Huvitaval kombel näidati TAD hiirte torukujulistes rakkudes normaliseeritud PCNA positiivsust. Selles ei tuvastatud PCNA-positiivseid rakkeneeru-veresooned (joonis 3C). Kuna TGF1 signaaliülekanne võib mõjutada apoptoosi [39], uuriti proapoptootilise kaspaas3 aktiivset vormi. Kuigi WT proovides tuvastati kaspaas3 kerge mRNA ekspressioon, ei näidatud lõhustatud aktiivset kapaasi3. Vastupidi, AD proovides ilmnes tugev mRNA ja lõhustatud kaspaas3, samas kui suurenenud füüsiline aktiivsus vähendas proapoptootilise valgu ekspressiooni (joonis 3A, B).

Neerufibroosi vähendas füüsiline aktiivsusVarasemad tulemused näitavad võimalikku fibroosi AD loomade neerudes. Esiteks uuriti MMP9 ekspressiooni, mida saab reguleerida TGFB1 aktiveerimise kaudu [21]. MMP9 mRNA ekspresseeriti kõigis proovides, kuid see näitas olulist suurenemist ainult TAD hiirte neerudes. Maatriksi metalloproteinaasi valgu ekspressioon oli WT proovides avastamispiiril, kuid see näitas AD loomadel olulist tõusu. Üllataval kombel suurendas aktiivne füüsiline treening järsult MMP9 ekspressiooni (joonis 4A, B). Fibrootiliste protsesside teine ​​komponent on I tüüpi kollageeni suurenenud ladestumineneerud[40]. WT proovides tuvastati I tüüpi kollageeni madal mRNA ja valgu ekspressioon, kuid AD loomadel ilmnes tugev tõus. Aktiivne füüsiline liikumine normaliseeris nii I tüüpi kollageeni mRNA kui ka valgu ekspressiooni (joonis 4A, B). I tüüpi kollageen ümbritseb tavaliselt torukesi ja paikneb ka interstitsiumis. Massoni trikroomi tavapärase patohistoloogilise värvimise korral tähistab sinine värv mis tahes tüüpi kollageeni olemasolu, mis oli nähtav tuubulite ümber.neeru-veresooned ja väike kogus WT neerude interstitsiumis. AD proovides oli interstitsiumis ja mõnes tuubulis nähtav tugev akumulatsioon. Pärast füüsilist aktiivsust vähenes kollageeni kogus ja interstitsiumis akumuleerumist ei tuvastatud (joonis 4C). Kogunenud kollageeni täpsustamiseks viidi läbi I tüüpi kollageeni immunohistokeemia. WT-sneerud, sarnaselt Massoni värvimisele ilmusid tuubulite ümber signaalid,neeru-samuti olid nähtavad kehakesed ja nõrk interstitsiaalne signaal. AD-hiirte proovides ilmnes interstitsiumis ja torukujulise süsteemi ümbruses tugev immunopositiivsus. Üllataval kombel oli interstitsiaalse koe vähenemine nähtav, kuid TAD-loomadel ilmnes tuubulite epiteelirakkude apikaalses osas märkimisväärne signaal (joonis 4D).

CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU

ARUTELU

Kuigi AD moodustumise protsessi arutatakse KNS-is laialdaselt, ei uurita muutusi ja võimalikke perifeerseid kaasnevaid patoloogiaid üksikasjalikult. Meie peamine hüpotees oli seeneerudfibroos on võimalik protsess, mis mõjutab AD manifestatsiooni ja A akumulatsiooni. Teisest küljest on pikaajalisel füüsilisel treeningul positiivne mõju AD-le, millel võib olla korrelatsioon süsteemse muutuse TGFB signaaliülekande rajaga. On näidatud, et perifeersed elundid osalevad AD patogeneesis, kuna muu hulgas on AD patsientidel tuvastatud muutunud metaboolsete ensüümide aktiivsus [41] ning akumuleerumine on näidatud kõhunäärmes [42] janeerud[30]. See süsteemne haigus, mis mõjutab erinevaid organeid, muudab AD varajase diagnoosimise ja ravitavuse keeruliseks. AD kliirensit kesknärvisüsteemist reguleerivad osaliselt astrotsüüdid ja mikrogliia, kuid osa pärast hematoentsefaalbarjääri läbimist saab perifeeriast eemaldada [43]. Seda perifeerset kliirensit peetakse üheks võimalikuks ravimi sihtmärgiks AD kontsentratsiooni vähendamiseks plasmas [44]. Väikeste molekulide sekretsioon neerude proksimaalsete tuubulite poolt esindab elutähtsat homöostaatilist funktsiooni ja võib osaleda toksiinide või valkude eritumisel uriini [45]. On tõestatud, et AD eritub uriiniga ja võib olla dementsuse diagnostiline märk [46]; Lisaks võib neerufunktsiooni häire eakatel suurendada dementsuse riski [47] ja leiti, et seerumi AD tase oli kroonilise neeruhaigusega patsientidel oluliselt kõrgem [10]. Need andmed viitavad võimalikule funktsioonileneerudAD kliirensis perifeerias. On näidatud, et füüsilisel treeningul on positiivne mõju neerufunktsioonile, kuna see säilitas õige glomerulaarmorfoloogia ja kaitses tubulaarset sekretsiooni [48]. On näidatud, et suurenenud füüsiline aktiivsus vähendab TGFB signaaliülekandeid neerudes ja füüsiline treening võib olla hea antifibrootiline strateegia [32]. Kokkuvõttes võib TGF-i aktiveerimisel olla otsene seos füüsilise aktiivsusega seotud signaalimisega, mis võib säilitada AD kliirensi perifeerias. Seetõttu uurisime TGFB signaaliülekande rada WT, AD ja pikaajaliselt treenitud AD hiirtel.

Käesolevas uuringus näidati, et TGFFRII ekspressioon suurenes AD hiirte neerudes ja normaliseeriti osaliselt TAD proovides. Kõrgenenud TGFBRII näitab TGFB signaaliraja suurenenud aktiveerimist AD-s [49]. TGF RI vähenenud ekspressioon näitas, et TGF seondub suurema afiinsusega TGFBRII suhtes ja homodimeeri moodustumine on tõenäoline AD korral [50]. Sarnaselt nendele tulemustele on makrofaagides näidatud TGFFRII homodimeeri moodustumistneeru-fibroos [51]. Teisest küljest võrdsustas pikaajaline treenimine TGFB retseptorite ekspressiooni, mis viitab heterodimeeri retseptori kompleksi moodustumisele, mida saab stabiliseerida kõrgendatud TGFB1 ekspressiooniga [50]. Lisaks muudeti Smad2 ja Smad3 ekspressiooni AD-s vastuoluliselt. On teada, et Smad2 aktiveeritakse klassikaliselt TGF-i retseptorite poolt ja translokeeritakse tuuma, samas kui Smad3-l on selge funktsioon [52]. On avaldatud, et Smad3 allareguleerimine mõjutab fibroosi [53]. Smadi transkriptsioonifaktorite normaliseeritud ekspressioon TAD proovides näitab

et füüsiline aktiivsus tasakaalustas TGFB signaaliülekande ja vähendas selle patobiokeemilist aktivatsiooni. Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) perekond, mis sisaldab p38MAPK-d, JNK-d ja ERK-d, omab interaktsiooni TGF-i signaalimisega [54]. Neerufibroosi indutseerivates tubulaarsetes epiteelirakkudes on näidatud p38 kõrgenenud ekspressiooni ja selle blokeerimine võib olla fibroosiravi hea sihtmärk [55]. AD hiirtel tuvastati suurenenud p38 valgu ekspressioon, mis toetab veelgi fifibroosi teket. Vastupidi, p38 fosforüülimine vähenes AD neerudes, mis näitab fibroosi staadiumist sõltuvat p38 MAPK aktivatsiooni [56]. Teisest küljest normaliseeris suurenenud füüsiline aktiivsus osaliselt nii p38 kui ka neerudes leiduva fosforüülitud vormi, mis viitab p38-vahendatud fibroosi moodustumise treenimise tasakaalustavale funktsioonile. Sarnaselt p38 kinaasiga võib JNK inhibeerimine pärssida fibroosi teket [57]. JNK aktiveerimisel on neeru erinevates osades erinevad funktsioonid, nagu glomerulaarfiltratsioon ja interstitsiaalsed fibrootilised protsessid [58]. Meie katsetes saadud valguekstrakt, mis on saadud kogu neerulüsaadist, näitab, et AD arengu ajal on JNK-l tõenäoliselt erinev funktsioon torukujulistes ja glomerulaarsetes osades koos rakuspetsiifilise isotüübi aktivatsiooniga AD-ga mõjutatud neerudes. Sõltuvalt p38 funktsioonist teatati TGFB1 indutseeritud MMP aktivatsioonist [59], samas kui ERK aktiivsuse pärssimine vähendas interstitsiaalset fibroosi [60]. Need andmed toetavad tugevalt MAPK perekonnaliikmete erinevaid funktsioone AD neerufibroosi patogeneesis. Me tuvastasime AD hiirte neerudes madala ERK ekspressiooni, samas kui selle fosforüülitud aktiivse vormi kogus oli oluliselt suurenenud. Pikaajalises füüsilises treeningus osalenud hiirte katserühmas tuvastasime normaliseerunud ERK ja fosfo-ERK ekspressiooni ning soodsa mõjuneerufunktsioon.Need tähelepanekud toetavad ERK panust neerude fibrootilises transformatsioonis AD-s ja näitavad füüsilise väljaõppe üllatavalt ilmset positiivset mõju AD hiirte neerude morfoloogiale ja funktsioonile. Hiljuti on meie labor tõestanud ERK osalust arenevate kõhrerakkude mehaanilises transduktsioonis [61].

TGFBRII, Smad, JNK, p38 ja ERK fosforüülimine toimub Ser jääkidel [62], mis viitavad Ser/Thr fosfataaside võimalikule aktiveerimisele. PP2B düsregulatsiooni on demonstreeritud AD puhul [35, 63]. Teisest küljest ei reguleeri PP2B oluliselt tau fosforüülimist ajus, kuigi on võimeline seda mitmes fosforüülimissaidis defosforüülima [35]. Teine peamine rakuline Ser/Thr fosfataas, PP2A, defosforüülib ka Ser-jääkide peal olevaid valke ja selle aktiivsus väheneb AD korral ning see on võimeline reguleerima tau fosforüülimist kõrgema afiinsusega kui PP2B [64]. Sarnaselt kesknärvisüsteemiga demonstreeriti AD hiirte neerudes vähenenud PP2A, kuid suurenenud PP2B ekspressiooni. Ser-jääkide suurenenud fosforüülimine PP2A ekspressiooni vähenemise tulemusena võib indutseerida tau valgu või APP hüperfosforüülimist, nagu seda ennustati AD hiirte neerudes. JNK ja p38 defosforüülimist saab otseselt reguleerida PP2B [65], seetõttu võib nende kinaaside vähenenud aktivatsioon AD-s olla PP2B suurenenud ekspressiooni tagajärg. Teisest küljest võib ERK kinaasi defosforüülimine toimuda valdavalt PP2A aktiveerimise kaudu [66], seejärel võib PP2A vähenenud ekspressioon põhjustada AD suurenenud ERK fosforüülimist. AD hiirte pikaajaline treenimine aitas normaliseerida PP2B ja PP2A ekspressiooni, mis omakorda näis nihutavat MAPK ensüümide Ser/Thr fosforüülimise taset normaalsele lähemale. Mehaaniline koormus avaldas tasakaalustavat mõju pöörduvale fosforüülimisele, kuna PP2B ja PP2A osalesid ka kondrotsüütide diferentseerumises [61].

Mittekanoonilise TGFB signaaliraja aktiveerimine reguleerib rakkude proliferatsiooni ja apoptoosi. Sarnaselt meie tulemustele on p21-positiivseid rakke näidatud neeru torukujulises süsteemis [67] ja me näitasime ka nende suurenenud ekspressiooni AD-s. See tõus viitab rakutsükli seiskumisele AD-s, mida vahendab MAPK aktiveerimine, samas kui p21 interakteerub PCNA-ga ja blokeerib rakud rakutsükli S-faasis [68]. Me tuvastasime AD hiirte torukujulises süsteemis p21 aktivatsiooni ja tõenäoliselt sellest tuleneva tugeva PCNA vähenemise. Sarnaselt meie varasematele leidudele normaliseeris suurenenud füüsiline aktiivsus rakutsüklit torukujulise süsteemi rakkudes. Teisest küljest on p21-l seos ka kaspaasi aktiveerimise ja JNK-ga, samas kui ERK indutseerib ka kaspaas3 lõhustumist [69, 70]. On kindlaks tehtud, et kaspaas3 aktiveerimine mängib AD patogeneesis olulist rolli A akumulatsiooni ja kaspaasi poolt vahendatud ABPP lõhustumisest põhjustatud sünoptiliste häirete kaudu [71]. AD hiirte neerudes tuvastasime kõrge lõhustatud kaspaas 3 ekspressioonid, mis viitavad suurenenud apoptoosile ja tubulaarsete ja glomerulaarrakkude funktsiooni kadumisele. Need protsessid võivad soodustada AD akumuleerumist neerude interstitsiumis, nagu oleme varem näidanud [30].

CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI

On näidatud, et TGFB vahendatud signalisatsioon suurendab kollageeni ekspressiooni ja akumulatsiooni interstitsiumis [40]. Nende tulemuste kohaselt näitasime AD hiirte neerudes interstitsiumis kogunenud I tüüpi kollageeni märkimisväärselt suurenenud ekspressiooni. Need andmed viitavad tugevalt sellele, et muutunud kanooniline ja mittekanooniline TGFB signalisatsioon AD-s mängib neerufifibroosi korral otsustavat rolli [18, 72]. Vastupidi, pikaajaline treenimine vähendas I tüüpi interstitsiaalset kollageeni lokaliseerimist vähemalt osaliselt TGFB signaalimise tasakaalustamise kaudu. Vähenenud fifibroos võib esile kutsuda AD kliirensi ja vähendada sedaneeru-kogunemine, nagu oleme varem näidanud [30]. Seda hüpoteesi toetasid meie leiud, kuna füüsiline väljaõpe tõi kaasa I tüüpi kollageeni akumuleerumise torukujulistes epiteelirakkudes, mida demonstreeriti TAD-hiirte neerudes, mis viitab kollageeni lagunemisprotsessile. MMP9 saab aktiveerida TGFB signaaliülekande kaudu neerudes [73] ja selle tulemuseks on maatriksifibrillide lagunemine. Kuigi MMP-del on fibroosis nii inhibeeriv kui ka stimuleeriv roll, peetakse MMP9-d profibrootiliseks aineks, mida vahendab TGFB aktiveerimine [74]. Vastupidi, on näidatud, et MMP9 võib mängida regulatiivset rolli I tüüpi kollageeni lagunemisel neerudes [75]. AD hiirte neerudes näitasime kõrgenenud MMP9 ekspressiooni, mis viitab selle funktsioonile fibrootilises protsessis, mida kontrollib TGFB signaaliülekande kaskaadi. Teisest küljest mõõdeti pärast pikaajalist treeningut edasist tõusu, mis võib olla I tüüpi kollageeni ekspressiooni tugeva vähenemise ja tubulaarse väljanägemise põhjuseks. Mehaanilise stiimuli korral on meie labor näidanud, et primaarsetes kondrogeensetes kultuurides oli MMP9 ekspressioon kõrgem. [76] ja sarnaseid tulemusi on avaldatud armkoe moodustumise kohta, kus mehaaniline kokkusurumine suurendas MMP9 ekspressiooni [77]. Ägeda neerukahjustuse korral on MMP9 tõusul anti-apoptootiline funktsioon ja see kaitseb proksimaalsete tuubulite S3 osa [78]. Lisaks on kopsudes avastatud ka nihkepingest aktiveeritud TGFB signaalirada ja vähenenud fibroosi moodustumine [79]. Veelgi enam, mehaaniline stress kopsuepiteelirakkudes kutsus esile ECM-i ümberkujundamise MMP9 aktiveerimise ja kollageeni ekspressiooni muutmise kaudu [80]. Seetõttu võime järeldada, et suurenenud füüsiline aktiivsus kutsub esile maatriksi tootmise ümberkujundamise TGFB signaalimise moduleerimise kaudu mitte ainult lokaalselt, vaid ka süsteemselt. Meie töö piirangud seisnevad selles, et transgeensetel hiirtel võib olla kiirem AD moodustumine ja neerufunktsiooni ei uurita üksikasjalikult. Täiendavalt tuleb uurida, et AD hiirte fibrootilistes neerudes muutub ainult TGFB indutseeritud maatriksi tootmine või naatriumi ja kaaliumi tasakaalu reguleerimine ning AD kliirens on samuti seotud pikaajalise koolitusega. Lisaks saab täiendavalt jälgida I tüüpi kollageeni akumuleerumist uriinis, et parandada seda, et pikaajaline füüsiline treening AD korral viib neerufibroosi vähenemiseni. Teisest küljest tõestasime in vivo, et pikaajalisel füüsilisel treeningul on süsteemne mõju kanoonilisele ja mittekanoonilisele TGFB signaalimisele. In vivo näitasime, et füüsiline treening vähendas AD-s neerufibroosi teket, millel on positiivne mõju haiguse avaldumisele. Kokkuvõtteks näitavad meie andmed, et TGFB signaaliradade aktiveerimine mängib põhjuslikku rolli AD hiirte neerude fibrootilises transformatsioonis. Väga lihtsa lähenemisviisina selles seisundis positiivsete muutuste saavutamiseks soovitame pikaajalist füüsilist treeningut, kuna see suutis normaliseerida kanooniliste ja mittekanooniliste TGFB signaaliradade liikmete ekspressiooni ja fosforüülimist ning parandas neerufibroosi. Veelgi enam, fifibroosi inhibeerivad füüsilised harjutused võivad neerufunktsiooni uuesti tasakaalustada ja indutseerida AD-s süsteemse AD kliirensi suurenemist.