Erinevate Kadsura Coccinea ekstraktide fotokaitsvad ja melanogeensed omadused

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Päikese ultraviolettkiirgus (UV), mida iseloomustavad UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) ja UVC (100–280 nm), on kõige kriitilisem keskkonnategur, mis põhjustab tsütotoksilisusest ja genotoksilisusest tulenevat nahavähki ja fotovananemist. ja fototoksilisus. Täpsemalt, UVA- ja UVB-kiirgus moodustavad vastavalt üle 95 protsendi ja 3 protsendi päevasest UV-kiirgusest [8]. UVA- ja UVB-kiirgus võib indutseerida reaktiivseid hapniku liike (ROS) kaudselt või otseselt, tungides läbi naha epidermise ja/või dermaalse kihi, põhjustades oksüdatiivseid kahjustusi ja rakusurma. Viimastel aastakümnetel on UV-kiirgus muutunud tõsiseks naha terviseprobleemiks ja levib endiselt ohtlikult kogu maailmas [9–11]. UV-kiirgus on otsene ja järjekindel keratinotsüütide stimulaator, mis moodustab ligikaudu 95 protsenti naha epidermise rakumassist. Keratinotsüüdid toimivad esimese barjäärina mikroobsete, keemiliste ja füüsikaliste ohtude eest ning aitavad kaitsta UVA- ja UVB-kiirguse eest. Kui keratinotsüüdid puutuvad kokku UVA ja UVB kiirgusega, tekib rakusisene ROS, mis käivitab seega apoptoosi [12–14].

Melanotsüüdid vastutavad melaniini pigmentide tootmise ja koguse eest, mis on olulised osalised naha epidermise bioloogilises kaitses; nende düsregulatsioon võib põhjustada hüperpigmentatsiooni või hüpopigmentatsiooni häireid [15,16]. Melanotsüüdid jaotuvad naha epidermise basaalkihis, mida mõjutavad ka päikesevalgus, reaktiivsed hapniku liigid (ROS) ja melanotsüüte stimuleerivad hormoonid (-MSH) [17,18]. Türosinaas, mis kuulub vasevalkude tüübi -3 perekonda, on evolutsiooniliselt konserveerunud metalloproteiin, mis mängib melanogeneesis ning monofenoolmonooksügenaasi, katehkolaasi ja difenoolide aktiivsuses üliolulist rolli. Türosinaasi, türosinaasiga seotud valgu -1 (TRP-1) ja türosinaasiga seotud valgu-2 (TRP-2) alareguleerimisel on selge katalüütiline toime. TRP-1 on 5,6-dihüdroksüindool-2-karboksüülhappe oksüdaas ja TRP-2 on DOPAkroomi tautomeraas [19,20]. Lisaks on müoftalmoosiga seotud transkriptsioonifaktor (MITF) ja cAMP-le reageeriv elemente siduv valk (CREB) transkriptsioonifaktorid, mis reguleerivad peamiselt melanogeneesi ja kodeerivad teavet stimulatsiooni režiimi ja intensiivsuse kohta [17, 21]. Mitmed uuringud on väitnud, et MITF ja CREB rajad reguleerivad melanogeneesi. MITF on melanogeneesiga seotud ensüümide transkriptsiooni võtmetegur ja melanogeneesi keskne regulaator. -MSH viib MITF-i ekspressioonini signaaliülekandemehhanismi kaudu, mis hõlmab cAMP-ga seotud siduvat valku (CREB). Seejärel siseneb MITF M-kasti järjestusega (AGTCATGTGCT) tuuma, et soodustada spetsiifiliste melanogeensete geenide ja ensüümide transkriptsiooni. Samuti on teada, et fosforüülitud CREB-d stimuleerib -MSH, mis seondub Mitf-i promootoris CRE konsensuselemendiga, et reguleerida Mitf-i transkriptsiooni [21–24].

Selles uuringus võrreldi põhjalikult KC juure (KCR), varre (KCS), lehtede (KCL) ja puuviljade (KCF) ekstrakte ning hinnati nende fotoprotektiivseid ja anti-melanogeenseid omadusi.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. KC ekstraktide valmistamine

Kolmeaastane KC 15 taim kasvatati Pusani riikliku ülikooli Miryangi ülikoolilinnakus 9-liitrises plastpotis. KC tuvastas selle uuringu autor professor Young Whan Choi. Need proovid deponeeriti vautšeriproovidena (juurdepääsunumber KC-PDRL-1) Pusani riikliku ülikooli loodusvarade ja bioteaduste kolledži aiandusbioteaduse osakonna herbaariumis. Taimi kasteti piisavalt täistoitelahusega, mille juhtivuse tase oli 1.0 mS·cm−1 ja mis sisaldas järgmisi elemente (me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; ja S, 4. KC kleit sadamas koristati 2020. aasta detsembris, liigitades juured, varred, lehed ja viljad (joonis 1A). Kogutud proovid lüofiliseeriti kohe külmkuivatis ja säilitati kuni analüüsimiseni vinüülkottides temperatuuril 20 ◦C. KC (20 g) kuivatatud juured, varred, lehed ja viljad jahvatati peeneks pulbriks ja ekstraheeriti toatemperatuuril etüülalkoholiga. Lühidalt, KC EtOH ekstraktide filtreerimine ja aurustamine viidi läbi alandatud rõhul temperatuuril 45 °C, millele järgnes lüofiliseerimine. Lõpuks lahustati tahke ekstrakt (50 mg/ml) edasisteks katseteks dimetüülsulfoksiidis (DMSO).

cistancheherba epimedium sagittatumväljavõte

2.2. KC ekstraktide polüfenoolide ja flavonoidide kogusisaldus

Nagu eelnevalt kirjeldatud [25], mõõdeti KC juure-, varre-, lehe- ja viljaekstraktide polüfenoolide ja flavonoidide kogusisaldust Folin-Ciocalteu (kokku polüfenool) ja alumiiniumkloriidi (flavonoid) kolorimeetriliste meetoditega. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 700 nm (kokku polüfenool) kasutades Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK) ja lainepikkusel 510 nm (flavonoid), kasutades VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA). .

Standardkõverad koostati, kasutades standardina gallushapet (kokku polüfenool) ja kvertsetiini (flavonoid) ning tulemused väljendati gallushappe ekvivalentidena grammi (GAE/g) KC juure-, varre-, lehtede- ja puuviljaekstraktide ning kvertsetiini ekvivalendina. grammi (QE/g) KC juure-, varre-, lehe- ja viljaekstrakti kohta.

2.3. DPPH ja ABTS analüüs

KC juure-, varre-, lehe- ja viljaekstraktide ({0}},5 mg/mL) DPPH ja ABTS radikaale püüdvaid aktiivsusi mõõdeti eelnevalt kirjeldatud meetodil [25], väikeste muudatustega. KC juure-, varre-, lehtede- ja viljaekstraktid (0,5 mg/mL) segati mikroplaatidel DPPH lahusega (60 µM). Pärast proovide tugevat loksutamist hoiti neid pimedas temperatuuril 25 ◦C 0,5 tundi. 7 mM ABTS ja 2,6 kaaliumpersulfaadi põhilahused valmistati destilleeritud vees toatemperatuuril pimedas 18 tundi. KC juure-, varre-, lehtede- ja viljaekstraktid (0,5 mg/ml) segati töölahusega ja lasti seejärel 0,5 tundi toatemperatuuril pimedas seista. Proovisegude neeldumist jälgiti lainepikkusel 510 nm (DPPH) või 734 nm (ABTS).

2.4. Rakukultuur

Kleepunud keratinotsüüdid (HaCaT) ja kleepunud melanotsüüdid (B16F10) inokuleeriti DMEM-i (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) kultuurilahusesse, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini. Corporation, Carlsbad, CA, USA) ja kultiveeriti 37 ◦C juures 5% CO2-ga. Kleepunud HaCaT ja B16F10 rakkude kasvu jälgiti regulaarselt ning söödet vahetati iga kahe kuni kolme päeva järel. Järgmistes katsetes kasutati logaritmilise kasvufaasi rakke.

2.5. UVA ja UVB kiirgus

Keratinotsüüdid eksponeeriti UVA- või UVB-kiirgusele (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Saksamaa) 5 8 W-torudega, mis kiirgavad suurema osa oma energiast emissioonipiigil kas 365 nm juures ( UVA) või 312 nm (UVB). UVA kiirgusdoosid olid 20 J/cm2 ja UVB kiirgusdoosid 50 mJ/cm2.

2.6. Rakkude elujõulisuse ja tsütotoksilisuse mõõtmine CCK-8 ja LDH analüüsi abil

Rakkude elujõulisuse analüüsimiseks lisati HaCaT keratinotsüütidele CCK-8 analüüsikomplekti (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) rakkude loenduskomplekti-8 (CCK-8) lahus. ja B16F10 melanoomirakkude suspensioonid vastavalt tootja juhistele ja inkubeeriti temperatuuril 37 ◦C 4 tundi. Lühidalt, 2 104 rakud külvati 24-süvendi plaadi igasse süvendisse ja inkubeeriti 5% CO-ga temperatuuril 37 °C 24 tundi. Lühidalt, 2 104 rakud külvati 24-süvendi plaadi igasse süvendisse ja inkubeeriti 5% CO-ga temperatuuril 37 ◦C 24 tundi. Pärast 24-tunnist inkubeerimist lisati igasse süvendisse CCK-8 reaktiiv ja rakke inkubeeriti veel 4 tundi. Tsütotoksilisuse tuvastamise komplekti (Roche Applied Science, Šveits) kasutati ekstratsellulaarse laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemise määramiseks HaCaT keratinotsüütide söötmes. Neeldumist analüüsiti lainepikkustel 450 nm (CCK-8) ja 490 nm (LDH), kasutades VICTOR Multilabel Plate Reader.

2.7. Intratsellulaarse ROS-i tootmise hindamine keratinotsüütides

Intratsellulaarset ROS-i taset analüüsiti, kasutades {{0}}(ja-6)-klorometüül-2′,7′-dikloriid-hüdrofluorestseiindiatsetaadi atsetüülestrit (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, pärast KC-ga töötlemist teiste osaekstraktidega (0,5 mg/mL) pesti keratinotsüüte (HaCaT) fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja inkubeeriti CM-H2DCFDA-ga (5 µM) 0,5 tundi. pimedus. Seejärel visualiseeriti intratsellulaarse ROS-i teke, kasutades Carl Zeissi fluorestsentsmikroskoobi; fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti fluorestsentsvärvi (CM-H2DCFDA) põhjal, kasutades voolutsütomeetrit (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA).

2.8. Apoptoosi analüüs

Pärast kokkupuudet ja töötlemist trüpsiiniti HaCaT keratinotsüüdid ja tsentrifuugiti. Seejärel hinnati saadud rakkude apoptoosi, kasutades fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) anneksiin V/Dead CellApoptosis komplekti (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, keratinotsüüte loputati kaks korda PBS-ga ja keratinotsüüdid anneksiini sidumispuhvris saadi ja segati FITC/anneksiin V (komponent A) ja propiidiumjodiidi (PI) töölahusega. Pärast inkubeerimist toatemperatuuril 15 minutit pimedas mõõdeti keratinotsüütide apoptoosi ja apoptootiliste rakkude protsent arvutati voolutsütomeetri abil (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA). Tuvastati FL1 (FITC/Nexin V) ja FL3 (PI) kanalite signaalid ning määrati värvitud rakkude kvadrandmarkerite värvimine ja punktdiagrammid.

2.9. Intratsellulaarse melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse analüüs

Intratsellulaarse melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse teste mõõdeti, selgitades, kus veidi muudetud protseduur erines [24]. Melanotsüüte töödeldi lõppkontsentratsiooniga 0,5 µM -MSH ja 0,5 mg/ml KC muude osaekstraktidega 48 tundi. Melanotsüütide pelleteid lüüsiti 1 N NaOH-ga 10% DMSO-s temperatuuril 80 ◦C 1 tund. Suhteline melaniinisisaldus määrati neeldumise mõõtmisega 475 nm juures, kasutades VICTORMultilabel plaadilugejat. Intratsellulaarne türosinaasi aktiivsus määrati dopakroomi tootmise kiiruse mõõtmisega L-DOPA abil. Melanotsüüdid pesti jääkülma PBS-ga ja lüüsiti PBS-is, mis sisaldas 1% (mass/maht) Triton X-100. Türosinaasi substraat L-DOPA (2 mg/ml) valmistati samas fosfaatlüüsipuhvris. Iga ekstrakt asetati 96-süvendiga plaadile ja ensüümianalüüs alustati L-DOPA lahuse lisamisega. Pärast 1-tunnist inkubeerimist mõõdeti neeldumist lainepikkusel 475 nm, kasutades dopakroomi tootmise analüüsimiseks VICTOR Multilabel Plate Readerit. Iga mõõtmise väärtus väljendati protsendina kontrollist. Positiivse kontrollina kasutati arbutiini (A, 0,5 mg/ml).

Cistancheehhinakosiidon türosinaasi inhibiitor.

2.10. Kvantitatiivne reaalajas PCR

Kogu RNA eraldati igast melanotsüütide rühmast, kasutades RNeasy Mini komplekti (QIAGEN, Hilden, Saksamaa). CDNA esimese ahela saamiseks viidi pöördtranskriptsioon läbi suure võimsusega cDNA pöördtranskriptsioonikomplekti (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA) abil vastavalt tootja juhistele. Seejärel kasutati kiude kvantitatiivse reaalajas PCR-i (qRT-PCR) mallidena, kasutades Bio-Rad Chromo4TM instrumenti ja SYBR Green qPCR põhisegu (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA). PCR viidi läbi eeldenatureerimisel temperatuuril 95 °C 5 minutit, denatureerimisel temperatuuril 95 °C 15 sekundit ja anniilimisel temperatuuril 55–58 °C 30 sekundit. GAPDH mRNA-d kasutati türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 mRNA sisemise võrdlusalusena. Sihtgeeni ekspressiooni suhteline väärtus=2−∆∆CT. Praimeri järjestused olid järgmised: türosinaas-sense (5'-ggccagctttcaggcagaggt-3'), türosinaas-antisense (5'-tggtgcttcatgggc aaaatc-3'), TRP-1-sense (5') ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-antisense (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sense (5′- tccagagccctga{37} '), TRP-2-antisense (5'-ggaaggagtgagccaagttatg-3'), GAPDH-sense (5'-aggtggtctcctctgacttc-3'aat) ja GAPDH-antisense-ta (5'-ggaaggagtgagccaagttatg-3'), -3′).

2.11. Western Blotting

Melanotsüüdid koguti ja lüüsiti, kasutades imetajate valgu ekstraheerimisreagenti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Kõik valgu kontsentratsioonid määrati Bio-Rad valguanalüüsi komplekti (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) abil. Seejärel lisati valgu supernatandile laadimispuhver ja segati. Segu keedeti 10 minutit ja valgud eraldati Mini-PROTEAN Precast Gels'iga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja kanti Hybond polüvinülideendifluoriidmembraanile (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Immuuntuvastus viidi läbi, kasutades türosinaasi (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF-i (1:1000), fosforüülitud CREB-i (p-CREB 1: 1000), CREB (1:1000) ja -tubuliin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), kasutades SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Membraani inkubeeriti üleöö primaarsete antikehadega temperatuuril 4 °C. Kitse küülikuvastane (IgG) sekundaarne antikeha (1:5000, Cell Signaling Technology) lisati membraanile ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund. Valguribasid vaadeldi täiustatud Pierce ECL Western blot meetodi abil (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja kvantifitseeriti sihtvalgu riba intensiivsuse suhtena -tubuliini riba intensiivsusse.

2.12. Statistiline analüüs

Kõiki analüüse korrati sõltumatult vähemalt kolm korda. Kõik statistilised parameetrid on esitatud keskmise standardveana (SEM). Statistilised analüüsid viidi läbi ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Dunni post-hoc test. Väärtust p < 0.01="" või="" p="">< 0,05="" peeti="">

flavonoidide test

3. Tulemused

3.1. Mitme KC osalise ekstrakti antioksüdantsete omaduste võrdlus

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 protsenti) > KCF (8,7 ± 1,1 protsenti) (joonis 1E).

3.2. Mitme osalise KC ekstraktiga töödeldud elujõuliste ja kahjustatud keratinotsüütide võrdlus UVA, UVB või mittekiirituse korral

KCR, KCS, KCL ja KCF onkeratinotsüütide mõju uurimiseks viisime läbi järgmised katsed. Esiteks kanti kõik ekstraktid HaCaT keratinotsüütidele UVA, UVB või mittekiirguse juuresolekul. CCK-8 analüüs näitas, et ekstraktid ei muutnud oluliselt keratinotsüütide elujõulisuse kontsentratsiooni 0,5 mg/ml. Hiljem töödeldi keratinotsüüte KCR, KCS, KCL ja KCF-ga UVA või UVB kiirguse juuresolekul. UVA- ja UVB-kiirgus pärssis oluliselt keratinotsüütide elujõulisust, nagu näitab CCK-8 analüüs joonisel 2A. Siiski leidsime, et UVA- ja UVB-kiirgusega kiiritatud keratinotsüütide elujõulisus suurenes järgmises järjekorras: KCL, KCR, KCS ja KCF (joonis 2A). Samuti jälgisime kahjustatud keratinotsüüte, mõõtes rakuvälist LDH vabanemist. Tulemused näitasid, et UVA või UVB kiiritamine hõlbustas oluliselt LDH vabanemist; kuid KCL, KCR, KCS ja KCF vähendasid märkimisväärselt LDH vabanemist UVA või UVB kokkupuutega selles järjekorras (joonis 2B). Ülaltoodud katsetulemused näitasid, et UVA- või UVB-kiirguse proliferatsioonivastane ja tsütotoksiline toime keratinotsüütidele leevenes KCL-i, KCR-i, KCS-i ja KCF-i järjekorras. Eelkõige võib KCL taastada rakkude elujõulisuse kontrolltasemele.

Joonis 2. KCR, KCS, KCL ja KCF ekstrakti keratinotsüütide elujõulisuse ja tsütotoksilisuse mõju UVA, UVB või mittekiirguse juuresolekul.

3.3. Intratsellulaarse ROS-i tootmise võrdlus keratinotsüütides, mida on töödeldud mitme KC osalise ekstraktiga UVA- ja UVB-kiirguse olemasolul või puudumisel

Kuna ROS-i rakusisene tootmine põhjustab tõsiseid keratinotsüütide kahjustusi, peetakse neid potentsiaalseteks UVA- või UVB-kiirguse poolt põhjustatud kahjustuste vahendajateks. Mitmed uuringud on näidanud, et UVA- või UVB-kiirgus kutsub esile endogeense ROS-i tootmise [12,14]. Meie eesmärk oli kindlaks teha, kas UVA- või UVB-kiirgusega kiiritatud keratinotsüütides oli endogeense ROS-i taseme tõus. Sellest lähtuvalt analüüsisime sondi CM-H2DCFDA rakusisese fluorestsentsi intensiivsust, kasutades fluorestsentsmikroskoopiat ja voolutsütomeetriat. Fluorestsentsmikroskoopia tulemusena näitasid CM-H2DCFDA värvimiskujutised kontroll-, KCR-, KCS-, KCL- ja KCF-ga töödeldud keratinotsüütides kerget värvumist ning olulist värvimist UVA- või UVB-kiiritatud keratinotsüütides (joonis 3A). Voolutsütomeetria kvantifitseeritud tulemuste kohaselt suurendas UVA- ja UVB-kiirgus keratinotsüütide rakusisest ROS-i taset vastavalt 27,2 ± 4,5 protsenti ja 34,1 ± 4,2 protsenti võrreldes kontrollrühmaga (5,7). ±0,2 protsenti). Lisaks kinnitati sarnaselt fluorestsentsmikroskoopia tulemustega, et KC ekstraktid surusid rakusisest ROS taset alla KCL > KCR > KCS > KCF UVA või UVB kiirituse juuresolekul (joonis 3B). Need tulemused näitavad, et mitmed KC osalised ekstraktid inhibeerisid endogeense ROS-i tasemeid vähendades oluliselt keratinotsüütide kahjustusi.

Joonis 3. KCR, KCS, KCL ja KCF ekstrakti mõju rakusisesele ROS-i tootmisele UVA, UVB või kiiritamata keratinotsüütides

3.4. Mitme osalise KC ekstraktiga töödeldud keratinotsüütide apoptoosi võrdlus UVA- ja UVB-kiirguse juuresolekul või puudumisel

Apoptoosi tuvastamiseks, mis on keratinotsüütide kahjustuse usaldusväärne näitaja, värviti keratinotsüüdid anneksiin V-ga koos propiidiumjodiidiga. Keratinotsüütide apoptoosi kiiruse testimiseks kasutati fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) anneksiin V / surnud rakkude apoptoosi komplekti. UVA ja UVB kiiritamine hõlbustas anneksiin V värvimisaktiivsust, samas kui KCR, KCS, KCL ja KCF vähendasid anneksiin V värvimisaktiivsuse kiirust UVA ja UVB kiirguse juuresolekul. KCR, KCS, KCL ja KCF üksi (0,5 mg/mL) ei kutsunud esile anneksiin V värvimisaktiivsust. Voolutsütomeetria kvantifitseeritud andmed näitasid, et UVA- ja UVB-kiirgus suurendas keratinotsüütide apoptoosi taset 46,3 võrra.± 1,5 protsenti ja 48,7 ± vastavalt 1.0 protsenti võrreldes kontrollrühma omaga (5.0 protsenti ± 0,7 protsenti). Oluline on see, et kinnitati, et KC ekstraktid surusid apoptoosi taset alla KCL> KCR> KCS> KCF UVA- või UVB-kiirguse juuresolekul (joonis 4A, B). Üldiselt põhjustas UVA- ja UVB-kiirgus keratinotsüütide kahjustusi ja mitmed KC osalised ekstraktid nõrgendasid UV-kiirguse põhjustatud keratinotsüütide kahjustusi.

Joonis 4. KCR, KCS, KCL ja KCF ekstraktide mõju apoptoosile UVA, UVB või kiiritamata keratinotsüütides.

3.5. Mitme osalise KC ekstraktiga töödeldud melanotsüütide rakusisese melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse võrdlus -MSH-ravi juuresolekul või puudumisel

Enne KCR-i, KCS-i, KCL-i ja KCF-i bioloogilise potentsiaali uurimist - MSH-indutseeritud melanogeneesil hinnati rakkude elujõulisust pärast KCR-i, KCS-i, KCL-i ja KCF-ravi (0.5 mg/mL) kasutades. CCK-8 analüüs melanotsüütides B16F10 koos -MSH-ga või ilma. KCR, KCS, KCL ja KCF (0,5 mg/ml) ei muutnud rakkude elujõulisust -MSH juuresolekul või puudumisel (joonis 5A). -MSH on oluline melanogeenne aine, mis võib suurendada rakusisese melaniini sisaldust, seondudes melanokortiin 1 retseptoriga ja aktiveerides adenülaattsüklaasi. Et uurida KCR, KCS, KCL ja KCF mõju melanogeneesile melanotsüütides, määrati rakusisene melaniini sisaldus visuaalse vaatluse ja biokeemiliste mõõtmistega. Nagu on näidatud joonisel 5B, suurendas rakusisest melaniini sisaldust märkimisväärselt -MSH. Kuid samaaegne ravi KCR, KCS, KCL ja KCF-ga näitas rakusisese melaniini sisalduse märkimisväärset vähenemist võrreldes -MSH-raviga. Biokeemiliste mõõtmiste jada, mis näitab rakusisese melaniini sisalduse pärssimist, oli järgmine: KCL > KCR > KCS > KCF (joonis 5B). Intratsellulaarse türosinaasi aktiivsuse test viidi läbi vastavalt rakusisese melaniini sisalduse analüüsile. -MSH-stimuleeritud melanotsüütide rakusisene türosinaasi aktiivsus suurenes, samas kui KCR, KCS, KCL ja KCF-ga töödeldud -MSH-stimuleeritud melanotsüütide aktiivsus vähenes. Intratsellulaarse türosinaasi aktiivsuse pärssimist näitavate biokeemiliste mõõtmiste järjestus oli järgmine: KCL > KCR > KCS > KCF (joonis 5C). Need tulemused näitavad, et mitmed KC osalised ekstraktid vähendasid oluliselt rakusisese melaniini sisaldust ja inhibeerisid türosinaasi aktiivsust, muutmata rakkude elujõulisust.

3.6. Türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 transkriptsiooni- ja translatsioonitasemete võrdlus melanotsüütides, mida on töödeldud mitme KC osalise ekstraktiga KC juuresolekul või puudumisel- MSH ravi

Et uurida KCR, KCS, KCL ja KCF mõju melanogeneesi markerite (türosinaas, TRP-1 ja TRP-2) valgu ja mRNA ekspressioonitasemete allareguleerimisele, töödeldi melanotsüüte KCR-ga. , KCS, KCL ja KCF -MSH juuresolekul või puudumisel. Nagu on näidatud joonistel fig 6A–C, tõusid türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 mRNA tasemed oluliselt -MSH-ga töötlemisel. Seevastu, võrreldes raviga -MSH, vähendasid KCR, KCS, KCL ja KCF türosinaasi, TRP{8}} ja TRP-2 mRNA ekspressiooni. Lisaks ei avaldanud KCR, KCS, KCL ja KCF üksi olulist mõju türosinaasi, TRP{10}} ja TRP-2 mRNA tasemele. Western blot analüüs viidi läbi koostöös reaalajas PCR-iga. Tulemused näitasid, et ravi -MSH-ga suurendas türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 valgu ekspressioonitaset ning need tasemed langesid KCR-i, KCS-i, KCL-i ja KCF-ga samaaegsel töötlemisel (joonis 6D ). Kvantitatiivse reaalajas PCR ja Western blotindikatsiooni türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 mRNA ja valgu ekspressiooni pärssimise järjestus oli järgmine: KCL > KCR=KCS > KCF (joonis 6). Need tulemused viitavad sellele, et mitmed KC osalised ekstraktid võivad soodustada melanogeneesivastast toimet, mida näitas melanogeneesi markerite allareguleerimine.

3.7. Mitme KC osalise ekstraktiga töödeldud melanotsüütide MITF-i ekspressiooni ja CREB-fosforüülimise võrdlus -MSH-ravi juuresolekul või puudumisel

Türosinaas, TRP-1 ja TRP-2 on melanogeneesis olulised. Nende ekspressiooni reguleerivad MITFexpression ja CREB fosforüülimine [17, 21]. Western blot analüüs näitas, et KCR, KCS, KCL ja KCF inhibeerisid tõhusalt -MSH-ravist põhjustatud MITF-i valgu taseme tõusu. Lisaks ei tuvastanud KCR, KCS, KCL ja KCF üksi peaaegu MITF-valgu ekspressiooni. Kvantifitseeritud Western blot tulemuste järjestus, mis näitab MITF valgu ekspressioonitasemete pärssimist, oli järgmine: KCL > KCR > KCS > KCF (joonis 7A). Veelgi enam, KCR, KCS, KCL ja KCF muutsid -MSH-ravi mõju CREB fosforüülimisele. Ainuüksi KCR, KCS, KCL ja KCF mõjutasid CREB fosforüülimist vähe. Kvantifitseeritud Western blot tulemuste järjestus, mis näitab CREB fosforüülimise tasemete inhibeerimist, oli järgmine: KCL > KCR > KCS > KCF (joonis 7B). Need tulemused näitasid, et mitmed KC osalised ekstraktid surusid MITF ekspressiooni ja CREB fosforüülimise kaudu vähemalt osaliselt alla melanogeneesi inmelanotsüüte.

4. Arutelu

Nahavalgenduse populaarsus kasvab kogu maailmas UV-kiirguse suurenemise tõttu ning tõenäoliselt saavutab see lähikümnenditel esteetilistel eesmärkidel suure ulatuse [8]. Kosmeetika- ja farmaatsiaturgudel on kasutatud mitut tüüpi pleegitusaineid, nagu kojichape ja arbutiin. Lisaks pööratakse looduslikele ekstraktidele üha suuremat tähelepanu tänu nende potentsiaalsele antioksüdantsele, põletikuvastasele, kasvajavastasele, antibakteriaalsele ja muule toimele [26,27]. Antioksüdantide ning fotoprotektiivsete ja melanogeneesivastaste omaduste põhjal on välja töötatud mitmeid kosmeetika- ja farmaatsiakandidaate. On hästi teada, et need valgenduskandidaatide omadused on kosmeetika- ja farmaatsiaalases uurimis- ja arendustegevuses asendamatud [28]. TDM-il on mitmekomponendilised ja mitme sihtmärgi omadused ning see parandab oluliselt inimese bioloogilist efektiivsust ja elukvaliteeti [29]. Kaasaegsed fütokeemilised uuringud näitavad, et KC sisaldab mitmesuguseid koostisosi, millest peamised koostisosad on lignaanid ja terpenoidid [30]. Tuvastatud on üle 202 ühendi, sealhulgas dibensotsüklooktadieenlignaanid, spirobensofuranoiddibensotsüklooktadieenlignaanid, arüülnaftaleeni lignaanid, kadlongilaktoontriterpenoidid ja seskviterpenoidid [31,32]. KC kuivatatud juurtel, vartel ja lehtedel on laialdane kasutustraditsioon TDM-is reumatoidartriidi, kaksteistsõrmiksoole haavandite, seedetrakti häirete ja günekoloogiliste probleemide raviks. KC kuivatatud juured, mis puhastavad kuumust ja eemaldavad toksiine, kutsudes esile diureesi tursete eemaldamiseks. KC puuvilju tarbitakse enamasti värskete puuviljade, mahlade ja puuviljaveinidena, mis näitab, et need on inimeste tervisele kasulikud [7,33,34]. Varasemad uuringud on samuti näidanud, et see sisaldab rohkelt bioaktiivseid koostisosi, nagu lignaanid, triterpenoidid, flavonoidid, fenoolhapped, steroidid ja aminohapped, millel on kõrge toiteväärtus ja meditsiiniline väärtus [3,35]. Selles uuringus ekstraheeriti KC erinevad osad. Nimelt oli polüfenoolide ja flavonoidide üldsisaldus KC lehtedes ja juurtes palju suurem kui varte ja viljade sisaldus. Lehed ja juured sisaldavad rohkem kui kaks korda rohkem polüfenoole ja flavonoide kui varred ja viljad. Selle tulemusena arvame, et polüfenoolide ja flavonoidide kogusumma annab olulise panuse KC fotoprotektiivsesse ja melanogeensesse toimesse.

UV-kiirguse põhjustatud naha fototoksilisus on peamiselt tingitud raku tsütotoksilisusest, rakusisesest ROS-i akumulatsioonist ja apoptoosist keratinotsüütides. Seetõttu on mõistlikum keskenduda raku tsütotoksilisuse, rakusisese ROS-i akumulatsiooni ja apoptoosi pärssimisele UVA- ja UVB-kiiritatud keratinotsüütides [36,37]. Nagu on kirjeldatud selles uuringus [10,38], näitas sekkumine KC ekstraktidega fototsütotoksilisuse (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) tulemustesse, et KC ekstraktid vähendasid oluliselt raku tsütotoksilisust, rakusisest ROS-i akumulatsiooni ja apoptoos. Kooskõlas varasemate tulemustega oli KC lehtede ja juurte fotokaitseefekt palju suurem kui varrel ja viljal. Lisaks näitasid meie tulemused, et KC ekstraktid näitavad ülalnimetatud toimet, soodustades antioksüdantset aktiivsust. Melanogeneesi täheldatakse sageli pärast UV-kiirgust ja see on peamiselt seotud pigmentatsiooni või hüperpigmentatsiooniga [39]. Varasemate uuringute kohaselt on -MSH abil melanogeneesi esilekutsumise meetodit laialdaselt tunnustatud ja rakendatud. Seetõttu põhines see uuring -MSH-ga stimuleeritud melanotsüütide mudeli konstrueerimisel [24, 39]. Leidsime, et KC ekstraktid pärssisid -MSH-stimuleeritud intratsellulaarset melaniinisisaldust ja türosinaasi aktiivsust. Lisaks reguleerisid KC ekstraktid melanogeneesi markerite, nagu türosinaas, TRP-1 ja TRP-2, transkriptsiooni ja translatsiooni -MSH-stimuleeritud melanotsüütides. Lisaks uurisime MITF-i valgu ekspressiooni ja CREB fosforüülimist -MSH-stimuleeritud melanotsüütides. Sarnaselt leidsime selles uuringus, et KC ekstraktid pärssisid -MSH-vahendatud MITF-valgu ekspressiooni ja CREB fosforüülimist melanotsüütides. Kooskõlas fotoprotektiivsete tulemustega oli KC lehtede ja juurte melanogeenne toime palju suurem kui vartel ja viljadel.

cistanche viilud

Lisateabe saamiseks klõpsake siin.

5. Kokkuvõtted

Üldiselt leiti selles uuringus KC ekstrakti potentsiaalne fotoprotektiivne ja anti-melanogeenne toime. Kõrge polüfenoolide ja flavonoidide sisaldusega KC ekstrakt võib avaldada keratinotsüütidele ja melanotsüütidele fotokaitsvat ja melanogeenset toimet. See uuring annab põhjenduse ja uurimisstrateegia kosmeetiliste ja farmatseutiliste sekkumiste jaoks looduslike valgendavate ja fotoprotektiivsete ainete jaoks.