Kuidas kasutatakse fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitorit alpelisiibi Lowe'i sündroomi/mõlkide tõve korral?

Fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitor alpelisiib taastab aktiini organiseerituse ja parandab proksimaalsete tuubulite düsfunktsiooni in vitro ja Lowe'i sündroomi ja Denti tõve hiiremudelis

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6ja Jennifer L. Gallop^2,6

MÄRKSÕNAD: tsütoskelett; endotsütoos; lipiidid; proksimaalne tuubul; neeru Fanconi sündroom

Fosfatidüülinositool [PI] 4, 5-bisfosfaat [PI(4,5)P2] 5-fosfataasi OCRL kodeerivas OCRL geenis esinevad funktsionaalsed mutatsioonid põhjustavad defektset endotsütoosi ja proksimaalsete tuubulite talitlushäireid. sisseLowe'i sündroom ja Denti haigus2. Defekt on tingitud suurenenud PI(4,5)P2 tasemest ja ebanormaalsest aktiini polümerisatsioonist, mis blokeerib endosomaalse kaubitsemise. PI 3- fosfaat [PI(3)P] on hiljuti tuvastatud kui PI(4,5)P2 koaktivaator aktiini rajas. Siin testisime hüpoteesi, etfosfoinositiidi 3-kinaas(PI3K) inhibiitorid võivad päästa OCRL-i kadumisest põhjustatud endotsüütilise defekti, tasakaalustades fosfoinositiidi signaale aktiini masinasse. Laia ulatusega PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitor kopanlisiib ja IA klass p110a PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas) inhibiitor alpelisibvähendas aberrantset aktiini polümerisatsiooni OCRL-puudulikes inimese neerurakkudes in vitro. PI 3,4, 5-trisfosfaadi, PI(4,5) P2 ja PI(3)P tasemed vähenesid alpelisiibiga töötlemisega ning PI3K katalüütilise subühiku p110a siRNA-d kopeeris aktiini fenotüüpi. Humaniseeritud OcrlY/-hiire mudelis vähendas alpelisiib endosomaalse aktiini värvumist, taastades samal ajal stressikiudude arhitektuuri ja proksimaalsete tuubulite rakkude plasmamembraani megaliini taseme, mida peegeldab madala molekulmassiga valkude paranenud endotsüütiline omastamine in vivo. Seega toetavad meie leiud seost fosfoinositiidi lipiidide, aktiini polümerisatsiooni ja proksimaalses tuubulis toimuva endotsüütilise kaubitsemise vahel ning kujutavad endast kontseptsiooni tõestust alpelisiibi taaskasutamiseksLowe'i sündroom/hammaste haigus2.

Tõlkeavaldus

Lowe'i sündroom ja Denti haigus2, mis on põhjustatud fosfoinositiidi lipiidide 5-fosfataasi OCRL mutatsioonidest, mis ilmnevad proksimaalsete tuubulite düsfunktsiooniga ja madala molekulmassiga proteinuuriaga, kui on saadaval ainult toetav ravi. Meie tulemused näitavad, etfosfoinositiidi 3-kinaas inhibiitor alpelisib, mis on praegu heaks kiidetud vähiraviks, leevendab OCRL-i kadumisega seotud hälbivat fosfoinositiidi tasakaalu ja aktiini fenotüüpi, parandades oluliselt endotsüütilist masinat ja neeldumisvõimet rakusüsteemides ning humaniseeritud hiiremudelit Lowe'i sündroomi / Denti tõve 2 jaoks. Arvestades selle näilist ohutusprofiili, on alpelisiib paljulubav kandidaat ravimite taaskasutamiseksLowe'i sündroom ja Denti haigus.

Neerude proksimaaltuubuleid (PT) vooderdavatel epiteelirakkudel on tõhus retseptori vahendatud endolüsosomaalne rada, mis taastab ja töötleb olulisi aineid, mis filtreeritakse läbi glomeruli. Endolüsosoome mõjutavad kaasasündinud häired põhjustavad PT düsfunktsiooni (neeru Fanconi sündroom) koos lahustunud ainete ja madala molekulmassiga (LMW) valkude kaoga uriiniga, mida sageli komplitseerivad metaboolsed ja kasvutüsistused ning kroonilise neeruhaiguse teke.¹OCRL-i inaktiveerivat mutatsiooni on seostatud hambahaigusega 2 (MIM #300555), häirega, mida iseloomustavad PT düsfunktsioon, neerukivid ja progresseeruv neerupuudulikkus, ning Lowe'i okulotsebrorenaalse sündroomiga (MIM #309000), mis näitab lisaks PT düsfunktsioon ja neerupuudulikkus, süsteemsed ilmingud, nagu kaasasündinud katarakt, kognitiivne puue ja hüpotoonia.^2-4Praegused Denti tõve 2 ja Lowe'i sündroomi ravimeetodid on ainult toetavad.

Joonis 1|PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitorid leevendavad OCRL-puuduliku inimese neeru (HK2) rakumudelis aberrantset aktiini kokkupanekut endosoomides. (a) Selle uuringu jaoks olulised fosfoinositiidi lipiidide muundamise etapid, mis näitavad konversioone PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 ja PI(3)P vahel kõige asjakohasemate ensüümidega paksus kirjas, kõige asjakohasem teisendused pidevate joontega ja teised katkendjoontega. PI(4,5)P2 on Lowe'i sündroomi korral kõrgenenud OCRL-i 5-fosfataasi aktiivsuse puudumise tõttu ja see tekib PI fosforüülimisel fosfatidüülinositool4-kinaaside (PI4K) ja PI(4) poolt. P 5- kinaas (PIP5K). PI(4,5)P2 fosforüülitakse I klassi PI3K-dega, et saada PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 saab defosforüülida PI(4,5)P2-ks PTEN-i abil või PI(3,4)P2-ks SH-2-sisaldusega inositool-50 polüfosfaate (SHIP) 1 ja 2, sünaptojaniin 1 ja 2 ning ka OCRL, kuigi see on (jätkub)

Joonis 1|(jätkub) arvatakse olevat alaealine. PI(3,4)P2 defosforüülitakse PI(3)P-ks IA tüüpi inositoolpolüfosfaat-4-fosfataasi (INPP4A) ja B abil. PI(3)P toodetakse ka endosoomides PI fosforüülimise teel III klassi poolt. PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas), vaakumsorteerimisvalk Vps34. (b) Western blot analüüsid, mis illustreerivad OCRL ekspressiooni kadu HK2 OCRL CRISPR knockout (KO) rakuliinis võrreldes metsiktüüpi (WT) HK2 kontrollrakkudega, mille laadimiskontrolliks on tubuliin. (c–e) Tüüpilised Airyscani konfokaalsed mikropildid ja varajase endosoomi antigeeni 1 (EEA1) / aktiini kattuvuse kvantifitseerimine (väljendatud protsendina tuvastatud EEA1þ vesiikulite koguarvust) HK2 WT või OCRL KO rakkude jaoks, mida on töödeldud dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) (d) või näidatud inhibiitoriga ja fikseeritud 4-protsendilise formaldehüüdfiksiga. Kõikidel juhtudel illustreerivad pildid ühte z-lõiku Airyscaniga töödeldud konfokaalsest rakkude virnast, mis on immunomärgistatud EEA1 (kollane), falloidiini (aktiin, magenta) ja 40,6-diamidino{ jaoks. {14}}fenüülindool (DAPI) (tsüaan). Vardad =5 mm. Kvantifikatsioonides näitavad jooned keskmist ± SEM ja iga andmepunkt on individuaalne lahter. Kõikides katsetes viidi ravi läbi 16 tundi enne fikseerimist. Kõigis kvantifitseerimistes hinnati statistilist olulisust Kruskal-Wallise (KW) dispersioonanalüüsiga Dunni mitmekordse võrdluse testiga. (c) WT- või KO-rakud, mida on töödeldud kas DMSO-ga või 100 nM kopanlisiibiga, mis näitab aktiini ja endosomaalse kattumise päästmist. KW test: ***P < 0.0{{50}}1,="" mitu="" võrdlust;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" kopanlisib="" mõlemad="" ***p="">< 0,001,="" wt="" kopanlisiib="" versus="" ko="" kopanlisib="" p="0,44" (mitte="" oluline="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" ja="" 63="" rakud="" vastavalt="" wt="" dmso,="" wt="" kopanlisiibi,="" ko="" dmso="" ja="" ko="" kopanlisiibi="" jaoks.="" (d)="" wt-="" või="" ko-rakud,="" mida="" on="" töödeldud="" kas="" dmso="" või="" 10="" mm="" alpelisibiga,="" näidates="" aktiini="" ja="" endosomaalse="" kattumise="" päästmist.="" kw="" test:="" ***p="">< 0,001,="" mitmekordne="" võrdlus;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" mõlemad="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 ja 41 lahtrid vastavalt WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO ja KO alpelisib jaoks. (e) WT- või KO-rakud, mida on töödeldud kas DMSO-ga, 10 mM GSK2636771-ga või 10 mM idelalisibiga, mis näitab, et kumbki ühend ei suuda aktiini ja endosomaalset kattumist oluliselt vähendada. KW test: ***P < 0,001,="" mitmekordne="" võrdlus;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" gsk,="" *p="0,04," ko="" dmso="" versus="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 ja 145 rakku vastavalt WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 ja KO idelalisib jaoks. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www.kidney-international.org

Kuidas kasutatakse fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitorit alpelisiibi Lowe'i sündroomi/Denti tõve korral?

LMW proteinuuria on Lowe'i sündroomi / Denti tõve 2 korral täheldatud järjekindel tunnus, mis näitab, et OCRL mõjutab retseptori vahendatud endotsütoosi.⁵OCRL kodeerib fosfatidüülinositooli (PI) 4,5-bisfosfaati [PI(4,5)P2] 5- fosfataasi OCRL,⁶mis kontrollib lipiidide identiteeti endolüsosomaalses rajas, lagundades PI(4,5)P2 (joonis 1a). PI(4,5)P2 puudulik lagunemine OCRL-i kaudu on seotud fibroblastide klatriiniga kaetud vesiikulite katmata jätmises, millega kaasneb polümeriseeritud filamentse aktiini "komeedi" struktuuride moodustumine tekkivatest aberrantsetest varajastest endosoomitaolistest organellidest.^7-9Teistes rakutüüpides, eriti neerude PT-rakkudes, põhjustab OCRL-i puudulikkus F-aktiini "korvi" struktuure, mis ümbritsevad ebanormaalseid endolüsosomaalseid organelle.¹⁰Liigne F-aktiin blokeerib membraani liikumist läbi endotsüütilise ja endolüsosomaalse raja ning soovitatakse vähendada multiligandi retseptori megaliini ringlust apikaalsesse membraani, süvendades endolüsosomaalse raja defekti.¹¹Kooskõlas aberrantse F-aktiini peamise rolliga leevendatakse OCRL-i mutatsioonidest põhjustatud defektset endotsüütide omastamist, suunates aktiini masinavärki latrunkuliin B-ga või ammendades aktiini reguleerivaid valke, samuti väikese, segava RNA (siRNA) poolt vahendatud ammendumise. PI(4)P 5-kinaasi, et reguleerida PI(4,5)P2 sünteesi^7,10(Joonis 1a).

Aktiini polümerisatsiooni mõistetakse üha enam nii, et see ei tulene mitte ainult PI(4,5)P2-st, vaid ka teistest fosfoinositiidi lipiididest. Näiteks aktiveerib PI(3,4,5)P3 Rho-tüüpi GTPaasi Rac ja PI(3)P toimib koos PI(4,5)P2-ga, et stimuleerida aktiini polümerisatsiooni teisest Rho-tüüpi GTPaasist Cdc42 allavoolu.^12-14Nende fosfoinositiidide omavaheline muundamine on seotud lipiidide liikumisega läbi endotsüütilise ja endosomaalse raja. PI(4,5)P2 fosforüülitakse I klassi fosfatidüülinositool- 30 -kinaasi (PI3K) toimel plasmamembraanil PI(3,4,5)P3-ks ja defosforüülitakse järk-järgult PI(3,4)P2-ks ja PI-ks. (3)P või PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P on rikastatud endosoomides, kus see on nende funktsioneerimiseks hädavajalik, ja seda valmistatakse peamiselt PI otsesel fosforüülimisel III klassi PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas), Vps34¹⁶(Joonis 1a). OCRL-i puudulikkusega võrkkesta pigmenteeritud epiteeli (RPE) rakuliinis vähendatakse tekitatud aktiini komeete töötlemine PI3K-ga (fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitorid wortmannin ja Vps{0}}IN1, kooskõlas biokeemiliste uuringutega, mis näitavad aktiini kaasregulatsiooni nii PI(3)P kui ka PI(4,5)P2 kokkulangemise kaudu.¹⁴

Endotsütoosi päästmine, mida täheldati aktiini masinate sihtimisel OCRL-i patsiendi ja knockout (KO) rakkudes,^7,10koos aktiini ülesvoolu reguleerimisega PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)tegevust¹⁴ja PI muundamise väga omavahel seotud olemus annab intrigeeriva võimaluse, et I klassi PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitorid võivad olla kasulikud Lowe'i sündroomi korral. Sellised vähiraviks välja töötatud inhibiitorid on kliiniliseks kasutamiseks heaks kiidetud¹⁷ja on seega potentsiaalselt sobilikud ravimite taaskasutamiseks. Kuigi sellised ühendid nagu kopanlisiib¹⁸omavad laia spetsiifilisust ja kõrvaltoimeid, on hiljutisi edu näidanud spetsiifilisemate inhibiitorite puhul. Idelalisib,¹⁹mis sihib PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)subühik p110d on heaks kiidetud kroonilise lümfotsüütilise lümfoomi jaoks ja alpelisiib, mis on suunatud p110a-le, on heaks kiidetud kasutamiseks rinnavähi korral.^20,21Lisaks on alpelisiibil olnud kliiniline kasu PROS/CLOVESi sündroomiga lastel,²²haruldane ülekasvu sündroom, mis tuleneb PIK3A aktiveerimisest.

Siin testisime hüpoteesi, et I klassi PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitorid võivad päästa OCRL-i kadumisest tingitud endotsüütilise defekti, kasutades väljakujunenud raku- ja hiiremudeleid.^10,11,23Näitame, et PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)aktiivsus kopanlisiibi või alpelisiibi kaudu või alpelisiibi sihtmärgi katalüütilise subühiku p110a siRNA-vahendatud ammendumine vähendab liigset aktiini polümerisatsiooni OCRL-i puudulikes inimese neeru (HK2) rakkudes. Keskendudes alpelisiibile kui kliinilises kasutuses kõige spetsiifilisemale ühendile, näitame, et see vähendab aktiini polümerisatsiooni ja parandab omastamist endolüsosomaalse raja kaudu humaniseeritud Ocrl-i PT-rakkudes.^Y/-hiired in vitro. Lisaks leevendab in vivo ravi alpelisiibiga proteinuuriat, vähendab PT düsfunktsiooni ja päästab humaniseeritud Ocrl raku megaliini taseme.^Y/-hiired. Need tulemused toetavad alpelisibi kui kandidaati ravimite taaskasutamiseksLowe'i sündroom ja Denti haigus 2.

Joonis 2|Alpelisiibi toime aktiinile on annusele reageeriv ja selle võtab kokku PI3K siRNA (fosfoinositiidi 3-kinaas)p110a. (a) tüüpilised Airyscani konfokaalsed mikropildid (fikseeritud 4-protsendilise formaldehüüdi fiksaatoriga ja immunomärgistatud varajase endosoomi antigeeni 1 [EEA1], kollase; aktiini [falloidiin], magenta; ja 4{{40}},{{ 5}}diamidino-2-fenüülindool [DAPI], tsüaan; tulbad=5 mm) ja dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) töödeldud metsiktüüpi (WT) või knockout (KO) inimese neeru (HK2) rakkude kvantifitseerimine või alpelisiibi näidatud annustes 16 tunni jooksul, mis näitab aktiini ja endosomaalse kattumise annusest sõltuvat päästmist. Kõikidel juhtudel tähistavad jooned keskmist ± SEM ja punktid üksikuid lahtreid. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 ja 67 rakku WT kontrollimiseks, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , ja KO 2,5, 5, 10, 15, 25 ja 50 mM alpelisib vastavalt. Statistiline olulisus, mida hinnati Kruskal-Wallise (KW) testiga Dunni mitme võrdluse testiga: üldine ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" ja="" 50="" mm="" alpelisib="" kõik="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" versus="" ko="" 10="" mm="" alpelisiib="" **p="0,0043," wt="" dmso="" versus="" nii="" wt="" 10="" kui="" 50="" mm="" alpelisiib="" p=""> 0,9999 (mitte oluline [ns]). (b) Western blot p110a ja WT- või KO-rakkude laadimiskontrolli a-tubuliini jaoks, mida on töödeldud kas scramble (Scram.) või p110a siRNA-ga. (c) tüüpilised Airyscani konfokaalsed mikropildid (fikseeritud 4-protsendilise formaldehüüdiga ja immunomärgistatud EEA1, kollane; aktiin [falloidiin], magenta; ja DAPI, tsüaan; tulbad =5 mm) ja töödeldud WT- või KO-rakkude kvantifitseerimine kas scramble (S) või p110a siRNA-ga, mis näitab EEA{60}}aktiini kattuvuse vähenemist p110a ammendumisel. KW test Dunni mitme võrdluse testiga: ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust;="" wt="" rüselus="" versus="" ko="" segamine,="" ko="" rüselus="" versus="" ko="" p110a="" sirna="" mõlemad="" ***p="">< 0,001.="" n="79," vastavalt="" 108,="" 93="" ja="" 131="" lahtrit.="" hk2,="" inimese="" neer;="" pi3k,="" fosfatidüülinositool-30="" -kinaas;="" sirna,="" väike,="" segav="" rna.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Joonis 3|Fosfatidüülinositool (PI) 4, 5-bisfosfaat [PI(4,5)P2] on kõrgendatud OCRL-i väljatõrjumisega (KO) ja PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , ja PI(3)P pärsitakse alpelisiibraviga. Kõigis katsetes rakendati näidatud ravi 16 tundi enne fikseerimist. Kvantifikatsioonides näitavad jooned keskmist ± SEM ja iga andmepunkt tuleneb üksikust lahtrist. Kõigis kvantifitseerimistes hinnati statistilist olulisust Kruskal-Wallise (KW) dispersioonanalüüsiga Dunni mitmekordse võrdluse testiga. Kõigil piltidel =20mm ribad. (a) Tüüpilised laivälja mikropildid metsiktüüpi (WT) või KO inimese neeru (HK2) rakkudest, mida on töödeldud dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) või 10 mM alpelisiibiga ja seejärel fikseeritud plasmamembraani fiksaatoriga ja immunomärgistatud PI (3,4,5) jaoks. )P3 (punane) ja 40, 6-diamidino-2-fenüülindool (DAPI) (tsüaan) koos keskmise rakulise PI(3,4,5)P3 märgistamise intensiivsuse kvantifitseerimisega, mis näitab alpelisiibi efektiivsust töötlemine PI(3,4,5)P3 sünteesil. N=96, 128 ja 109 lahtrit vastavalt WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO ja KO alpelisib jaoks. KW (jätkub)

Joonis 3|(jätkub) test: üldine ***P < 0.001,="" mitu="" võrdlust;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" ja="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" kõik="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" tüüpilised="" konfokaalsed="" mikropildid="" wt="" või="" ko="" hk2="" rakkudest,="" mida="" on="" töödeldud="" kas="" dmso,="" 10="" mm-="" või="" 50-="" mm="" alpelisibiga="" 16="" tundi,="" seejärel="" fikseeriti="" golgi="" fiksiga="" ja="" märgistati="" m="" ch="" abil.="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" sond="" (magenta)="" ja="" dapi="" (tsüaan)="" koos="" alpelisiibi="" erinevate="" kontsentratsioonidega="" töödeldud="" rakkudes="" tuvastatud="" pi(3)p-positiivsete="" punktide="" arvu="" kvantifitseerimisega="" ,="" nagu="" näidatud,="" on="" pi(3)p-positiivsed="" punktid="" vähenenud="" annusest="" sõltuval="" viisil.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" ja="" 215="" rakku="" wt="" kontrolli="" jaoks,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" ja="" ko="" 2,5,="" vastavalt="" 5,="" 10,="" 25="" ja="" 50="" mm="" alpelisiibi.="" kw="" test:="" üldine="" ***p="">< 0,001,="" mitmekordne="" võrdlus;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" ja="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" kõik="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" ja="" 5="" mm="" alpelisib="" mõlemad="" p=""> 0,9999 (mitte oluline [ns]); KO DMSO versus KO 10 mM alpelisib **P=0.0049; KO DMSO versus KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Tüüpilised laivälja mikropildid WT või KO HK2 rakkudest, mida on töödeldud DMSO või 10 mM alpelisiibiga ja seejärel fikseeritud plasmamembraani fifixiga ja immunomärgistatud PI(4,5)P2 (kollane) ja DAPI (tsüaan) jaoks, kvantifitseerides keskmine raku PI (4, 5) P2 märgistamise intensiivsus, mis näitab suurenenud plasmamembraani PI (4, 5) P2 KO rakkudes, mida vähendab alpelisiib, eriti KO rakkudes. N=126, 112, 85 ja 116 rakku vastavalt WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO ja KO alpelisib jaoks. KW test: üldine ***P < 0,001,="" mitmekordne="" võrdlus;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" ja="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" mõlemad="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" tüüpilised="" laivälja="" mikropildid="" wt="" või="" ko="" hk2="" rakkudest,="" mida="" on="" töödeldud="" dmso="" või="" 10="" mm="" alpelisiibiga="" ja="" seejärel="" fikseeritud="" 4-protsendilise="" formaldehüüdi="" fifiksiga="" ja="" immunomärgistatud="" pi(4,5)p2="" (kollane)="" ja="" dapi="" (tsüaan)="" jaoks,="" koos="" kvantifitseerimisega="" pi(4,5)p2--positiivsete="" punctade="" arvust,="" mis="" näitab="" suurenenud="" pi(4,5)p2="" puncta't="" ko-rakkudes,="" mida="" vähendab="" ravi="" alpelisiibiga,="" eriti="" ko-rakkudes.="" n="75," 65,="" 52="" ja="" 69="" rakud="" vastavalt="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" ja="" ko="" alpelisib="" jaoks.="" kw="" test:="" üldine="" ***p="">< 0,001,="" mitmekordne="" võrdlus;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" ja="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" mõlemad="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, suvalised ühikud. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www.kidney-international.org.

Kuidas kasutatakse fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitorit alpelisiibi Lowe'i sündroomi/Denti tõve korral?

1. TULEMUSED

1.1 I klassi PI3K inhibiitorid vähendavad aktiini agregatsiooni OCRL-KO HK2 rakkudes

Kasutasime CRISPR-Cas9 geeni redigeerimist, et HK2 rakuliinis OCRL välja lüüa (KO), et võimaldada I klassi PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)Iseloomuliku aktiini agregatsiooni inhibiitorid endolüsosomaalsetes sektsioonides.^7,9,10,14Western blotting kinnitas KO HK2 rakkude lüsaatides OCRL ekspressiooni vähenemist 98.0± 0,7 protsenti (joonis 1b). OCRL KO võttis kokku aktiini korvi fenotüübi HK2 rakkudes, mida näitab F-aktiini ja varajase endosoomi antigeeni 1 (EEA1) suurenenud kattumine, kvantifitseeritud Airyscani konfokaalse mikroskoopia z-virnadega (joonis 1c – e). See OCRL KO rakkudes täheldatud suurenenud kattuvus tühistati raviga kopanlisiibiga (C), mis on laia ulatusega PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitor, mis on suunatud p110a ja d ning vähemal määral p110b ja g isovormidele (joonis 1c). HK2 täisrakuekstraktide Western blot analüüsiga leidsime, et PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)p110 regulatoorsed alaühikud a, b ja d ekspresseerusid hästi nii metsiktüüpi (WT) kui ka KO rakkudes, kusjuures p110g isovormis esines ainult jälgi (täiendav joonis S1A).

Me eristasime PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)F-aktiini inhibeerimise spetsiifilisus, kasutades alpelisiibi (A), mis on p110a selektiivne inhibiitor, ning GSK2636771 (G) ja idelalisiibi (I), vastavalt p110b ja p110d selektiivseid inhibiitoreid (täiendav joonis S1A). Kuigi ravi alpelisiibiga vähendas endosomaalse aktiini polümerisatsiooni sarnaselt kopanlisiibiga (joonis 1d), avaldasid GSK2636771 ja idelalisib aktiini akumulatsioonile veidi mõju (joonis 1e). I klass PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)MTT testi põhjal ei olnud inhibiitoritel OCRL KO-le suurenenud toksilisust võrreldes modifitseerimata rakkudega (täiendav joonis S1B).

1.2 Alpelisib ja p110a knockdown päästavad aktiini fenotüübi HK2 rakkudes

Järgmistes uuringutes keskendusime alpelisiibile, kuna see on kõige selektiivsem ja kõige vähem toksiline PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)seni välja töötatud inhibiitor ja seda kasutatakse praegu PI3K klassi Ia mosaiikliku üleaktiveerimise raviks PROS/CLOVES-i sündroomiga lastel.²²Alpelisib vähendas aktiinikorve OCRL KO HK2 rakkudes annusest sõltuval viisil (joonis 2a). Mõju täheldati 10 mM annuse juures niipea kui 4 tundi pärast töötlemist, ilma nähtava toksilisuseta (täiendav joonis S2). Et testida, kas PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)alpelisiibi pärssimine oli vähenenud aktiini värvumise allikas, me vähendasime konkreetselt selle sihtmärki, p110a subühikut, kasutades siRNA-d (joonis 2b). Võrreldes töötlemisega kontroll-siRNA-ga (järjestusega segatud) andis p110a vastane siRNA p110a valgu vähenemise vastavalt 78,3 ± 4,8 protsenti ja 68,9 ± 7,7 protsenti WT ja OCRL KO HK2 rakkudes, mis väljendub aktiinikorvide olulises vähenemises ( Joonis 2c).

1.3 PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 ja PI(3)P vähenenud tase alpelisibtöödeldud HK2 rakkudes

Et uurida, kuidas OCRL KO ja alpelisiibravi mõjutab fosfoinositiidi lipiide, värvisime HK2 rakud PI(3,4,5)P3, PI(3)P ja PI(4,5)P2 vastaste antikehade või valgu domeenidega, kasutades optimeeritud fikseerimistingimused plasmamembraani või intratsellulaarse värvimise jaoks.^24,25PI(3,4,5)P3 paikneb plasmamembraanil difuusselt ja ravi alpelisiibiga (10 mM) kutsus esile PI(3,4,5)P3 värvumise tugeva vähenemise nii WT kui ka OCRL KO rakkudes, kuna selle toimemehhanismi ja spetsiifilisuse tõttu IA klassi PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)p110a (joonis 3a). Eeldatakse, et PI(3,4,5)P3 defosforüülub järk-järgult, kui membraanid endotsütoositakse ja endosoomidesse kaubeldakse.^14,26,27Fikseerides rakud nii, et rakusisene PI(3)P säiliks,²⁵leidsime, et PI(3)P punctae vähenes ka alpelisiibiga töötlemisel (annusele reageerival viisil, mis ilmneb kontsentratsioonidest, mis on nii madalad kui 10 mm 16-tunnise ravi korral) nii WT kui ka OCRL KO rakkudes (joonis 3b ja lisajoonis S2C). Ootuspäraselt kutsus OCRL KO HK2 rakkudes esile PI (4, 5) P2 taseme märkimisväärse tõusu nii plasmamembraanil (joonis 3c) kui ka intratsellulaarselt (joonis 3d), võrreldes WT rakkudega.^10,28Ravi alpelisiibiga vähendas märkimisväärselt OCRL KO poolt tekitatud PI (4, 5) P2 tõusu mõlemas kambris, samas kui see ei avaldanud mõju WT-rakkudele (joonis 3c ja d). Alpelisib inhibeerib väidetavalt PI 4-kinaasi b 50-protsendilise inhibeeriva kontsentratsiooniga 0,5 mM,¹⁹mis on PI(4,5)P2 vähenemise võimalik allikas. Meie andmed näitasid ühiselt, et alpelisiib inhibeerib aktiini kokkupanekut OCRL KO endosoomidel bispetsiifilise toime kaudu PI (4, 5) P2 ja PI (3) P tasemetele.

Joonis 4|Alpelisiib leevendab Orali aktiini defekte kultiveeritud humaniseeritud Ocrl-is^Y/-hiire PTC-d (m PTC-d). (a) Tüüpilised maksimaalse intensiivsusega Z-projektsiooniga konfokaalsed mikropildid OcrlY/þ või Ocrl^Y/-m PTC-d, mida töödeldi dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) või 10 mM alpelisiibiga 16 tundi ja seejärel fikseeriti 4% formaldehüüdi fifiksiga ning immunomärgistati aktiini (falloidiini) (valge) ja 40, 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) (sinine), mis näitab pingekiudude esinemise määra igas seisundis, mis näitab, et pingekiud kadusid Ocrl-is^Y/-m PTC-d päästetakse alpelisiibraviga. Jooned näitavad keskmisi ± SEM ja andmepunktid näitavad iga pildistamispiirkonda: N=5 kujutise piirkonda seisundi kohta (igaüks sisaldab ligikaudu 15–20 rakku). Olulisust hinnati tavalise 1-viisi dispersioonanalüüsiga (ANOVA) Holm-Sidaki mitmekordse võrdluse testiga, **P=0.001, mitu võrdlust; Ocrl Y/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO**

P=0.002, Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (mitteoluline [ns]). Vardad =20mm. (b) DMSO või 10 mM alpelisiibiga 16 tunni jooksul töödeldud Ocrl m PTC-de tüüpilised 3D pinnatöötlused suure suurendusega, seejärel fikseeriti 4-protsendilise formaldehüüdi fifiksiga ja immunomärgistati varase endosoomi antigeeni 1 (EEA1) (lilla), aktiini (lilla) jaoks. phalloidiin, kollane) ja DAPI (sinine) ning kvantifitseerimine, mis illustreerib aktiini ja endosomaalse kattumise päästmist alpelisiibi poolt. Madalama suurendusega vaated, mis näitavad (jätkub)

Joonis 4|(jätkub) need piirkonnad on näidatud lisajoonisel S4B ja lisafilmides S1–S3. Jooned näitavad keskmist ± SEM. N=42, 47 ja 45 juhuslikult valitud väljad OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl jaoks^Y/-þ DMSO ja Ocrl^Y/-þ vastavalt alpelisibi tingimused, mis on igal juhul ühendatud 4 hiire neerust seisundi kohta. Olulisust testiti Kruskal-Wallise (KW) ANOVA abil Dunni mitme võrdluse testiga: üldine ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO ja Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Vardad =1 mm. (c) OcrlY/þ või Ocrl tüüpilised konfokaalsed mikropildid^Y/-m PTC-d, mida on töödeldud DMSO või 10-mM alpelisibiga ja seejärel fikseeritud Golgi fixiga ja märgistatud m Ch-2xFYVE PI(3)P sondi (magenta) ja DAPI (tsüaan) abil, kvantifitseerides rakkudes tuvastatud PI(3)P-positiivsete punctade arv. N=188, 177, 246 ja 206 lahtrit OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO ja Ocrl^Y/-þ vastavalt alpelisib; rakud ühendati 3 oraalsest neerust rühma kohta. KW test: üldine ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib ja Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, kõik ***P < 0.001.="" vardad="20" mm.="" (d)="" ocrly/þ="" või="" ocrl="" tüüpilised="" konfokaalsed="">^Y/-m PTC-d, mida töödeldi DMSO või 10 mM alpelisiibiga 16 tundi, seejärel fikseeriti 4-protsendilise formaldehüüdi fiksaatoriga ja immunomärgistati fosfatidüülinositool (PI) 4, 5-bisfosfaadi [PI(4,5) P2] (kollane) ja DAPI suhtes. (tsüaan), koos PI(4,5)P2-positiivsete punktide arvu kvantifitseerimisega, mis näitab suurenenud PI(4,5)P2 punkti Ocrl-is^Y/-rakud, mida alpelisiibravi vähendab. N=477, 444, 423 ja 494 OcrlY/þ þ DMSO-st, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO ja Ocrl^Y/-þ vastavalt alpelisib; rakud ühendati 3 oraalsest neerust rühma kohta. KW test: üldine ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib ja Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, kõik ***P < 0.001.="" vardad="20" mm.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

1.4 Alpelisiib vähendab rakusiseseid fosfoinosiide ja leevendab tsütoskeleti defekte Ocrl-is^Y/-m PTC-d

Järgmisena testisime, kas alpelisiibil oli sama toime PT-rakkude primaarsetes rakkudes, mis on saadud humaniseeritud Ocrldeficient hiiremudelist (Ocrl^Y/-), mis koondab patsiendilt saadud rakkudes täheldatud ebanormaalse aktiini polümerisatsiooni ja endotsüütide defekti.^10,11Hiire PTC-d (m PTC-d) väljendati sarnaselt I klassi PI3K-ga (fosfoinositiidi 3-kinaas) reguleerivad alaühikud HK2 rakkudele nii WT kui ka Ocrl^Y/-hiired ja neil oli alpelisiibi suhtes sarnane toksilisuse profiil, kui seda hinnati MTT testidega (täiendav joonis S3). Konfokaalse mikroskoopiaga pildistamine näitas normaalse F-aktiini stressikiu arhitektuuri silmatorkavat häiret Ocrl-i m PTC-des^Y/-võrreldes OcrlY / þ hiirtega, mis on tõenäoliselt tingitud aktiini reguleerivate valkude ümberpaiknemisest nende normaalsetest rakulistest asukohtadest endosoomidesse, kuna suured aktiini komplektid ümbritsevad neid organelle ja arvatakse, et see on kaubitsemise defekti põhjus.^10,29Ocrl ravi^Y/- m PTC-d alpelisiibiga (10 mM) taastasid stressikiu arhitektuuri (joonis 4a).

Kuidas kasutatakse fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitorit alpelisiibi Lowe'i sündroomi/Denti tõve korral?

Peamise probleeminaLowe'i sündroom ja Denti haigus2 on vähenenud endosomaalne kaubitsemine ja sellest tulenev megaliini lagunemine, püüdsime eristada endosomaalset aktiini stressikiududest. Kogusime rakkudes laserskaneerimisega konfokaalseid z-virnasid, rekonstrueerisime värvimismustri 3D-pinna renderdustes ja kasutasime suuruse kuju / parameetreid, et tuvastada täpilised aktiini struktuurid ja nende kattumise määr endosomaalsete struktuuridega (täiendav joonis S4 ja filmid S1 –S3). See analüüs näitas, et ravi alpelisiibiga vähendas F-aktiini ebanormaalset polümerisatsiooni EEA1-ga värvitud endosoomides, mis erineb stressikiudude arhitektuurist (joonis 4b). M PTC-d, mis on tuletatud Ocrl^Y/-hiirtel ilmnesid olulised muutused rakusiseses värvimises PI (3) P (vähenenud) ja PI (4, 5) P2 (suurenenud) puhul, võrreldes WT OcrlY / þ hiirte m PTC-ga (joonis 4c ja d). M PTC-de ravi Ocrl-st^Y/- alpelisiibiga hiired vähendasid oluliselt intratsellulaarset PI (3) P ja PI (4, 5) P2 värvimist (joonis 4c ja d).

1.5 Alpelisib parandab Ocrl endotsüütilist omastamist^Y/-m PTC-d

Järgmisena hindasime, kas alpelisiibi mõju m PTC-des täheldatud tsütoskeleti ja vesikulaarsetele defektidele põhjustas muutusi endotsüütide omastamisvõimes. Et eristada alpelisiibi mõju ligandi sidumisele ja/või internaliseerumisele, inkubeeriti m PTC-d esmalt märgistatud veise seerumi albumiiniga (BSA), et kutsuda esile sondi seondumine endotsüütiliste retseptoritega, ja seejärel inkubeeriti kasvusöötmega. jälgige albumiini sisestamist (joonis 5a). Ocrl^Y/-rakud näitasid Alexa 488-veise seerumi albumiini madalamat plasmamembraani seondumist koos albumiini sisemise halvenemisega võrreldes OcrlY/þ rakkudega. Ravi alpelisiibiga päästis nii albumiini seondumise kui ka omastamise Ocrl-s^Y/-rakkudele, mis päästsid endotsüütides omastamises 50 protsenti (joonis 5b ja c). Neid andmeid toetas albumiini kogu omastamise mõõtmine (täiendavad joonised S5a ja b). Märkasime, et internaliseeritud/seotud Alexa 488-veise seerumi albumiini suhe jäi erinevates tingimustes sarnaseks (joonis 5d), mis viitab sellele, et albumiini vähenenud omastamine on peamiselt tingitud pigem kahjustatud seondumisest kui defektsest internaliseerimisprotsessist.

1.6 Alpelisib parandab PT düsfunktsiooni ja retseptori vahendatud endotsütoosi Ocrl-is^Y/- hiired

Testisime alpelisiibi potentsiaalset terapeutilist toimet PT düsfunktsioonile in vivo. Suukaudsetele hiirtele manustati 6 nädala jooksul suukaudse sondiga kas vehiiklit või alpelisiibi (50 mg/kg kehakaalu kohta päevas) (joonis 6a). See raviskeem valiti vastavalt varasematele in vivo uuringutele, mis näitasid efektiivsust ja ohutust.^22,30Kooskõlas sellega, et alpelisiibi manustamine põhjustab teadaolevalt insuliiniresistentsust ja hüperglükeemiat,²²ravi alpelisiibiga tõi kaasa glükosuuria olulise suurenemise nii Ocrl Y/þ kui ka suukaudse manustamise korral^Y/-hiired, mida võib pidada ravimite annustamise biomarkeriks (täiendav tabel S1). Pärast 6-nädalast ravi alpelisibiga tuvastati Ocrl^Y/-hiirtel vähenes oluliselt LMW valkude CC16 (-34 protsenti) ja albumiini (-38 protsenti) eritumine uriiniga võrreldes kandjaga töödeldud kontrollidega (joonis 6b ja c), samas kui uriin ja muud parameetrid ei muutunud (täiendav tabel S1). Mõlema genotüübi Alpelisiibiga ravitud hiirtel oli kontrollhiirtega võrreldes sarnane kasvukiiruse vähenemine, nagu eelnevalt kirjeldatud.²²Sellegipoolest võtsid nii kandja kui ka ravitud hiired kehakaalu juurde, mis näitab, et ravim ei mõjuta tõsiselt postnataalset arengut (joonis 6d ja täiendav tabel S1).

Et testida, kas alpelisiibi mõju LMW proteinuuriale peegeldas retseptori poolt vahendatud endotsütoosi taastumist PT-rakkudes, jälgisime Cy5--märgistatud b-laktoglobuliini in vivo omastamist hiire neerus. Alpelisibiga töödeldud Ocrl^Y/-hiirtel õnnestus Cy{0}}märgistatud b-laktoglobuliinide omastamine oluliselt päästa, mis on peaaegu samaväärne vehiikuliga töödeldud OcrlY/þ hiirtel täheldatud internaliseerumise ulatusega (joonis 6e). Seda peegeldas märkimisväärne päästmine endotsüütide retseptori megaliini ekspressioonis PT-rakkudes, mida täheldati alpelisiibiga töödeldud Ocrl-i neerulüsaatide immunomärgistamise ja Western blot analüüsiga.^Y/-hiired; Pange tähele, et PT-markeri AQP1 ekspressioon ei muutunud (joonis 6f ja g ning täiendav joonis S5C ja D). Need andmed näitavad, et PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitor alpelisibindutseerib PT endotsüütilise masina olulise paranemise ja vähendab LMW proteinuuriat Lowe'i sündroomi humaniseeritud hiiremudelis.

Joonis 5|Alpelisiib parandab humaniseeritud Ocrl endotsüütilist omastamist^Y/-hiire PTC-d (m PTC-d). (a) Skeem, mis illustreerib impulsi jälitamise katset, mida kasutati Alexa 488-veise seerumi albumiini (BSA) seondumise ja sisestamise uurimiseks m PTC-deks. Rakke eksponeeriti Alexa 488-BSA-ga (0,2 mg/ml) 1 tund temperatuuril 4 kraadi, et võimaldada BSA-l seonduda rakupinna retseptoritega (pulss), ja seejärel soojendati rakusöötmes temperatuurini 37 kraadi. 20 minutit enne fikseerimist, et võimaldada ligandi sisestamist (tagaajamist). (b) OcrlY/þ või Ocrl tüüpilised konfokaalsed mikropildid^Y/-m PTC-d, mida töödeldi dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) või 10 mM alpelisiibiga 16 tundi ja viidi läbi Alexa 488-BSA (roheline) impulsi jälitamise katse, enne kui need fikseeriti ja märgistati 40 6-diamidino{ jaoks {6}}fenüülindool (DAPI) (sinine). Katse impulsi faas on näidatud iga seisundi ülemisel paneelil, allpool on tagaajamine. Vardad =20 mm. (c) Rakupinna Alexa 488-BSA (i) ja sisestatud Alexa 488-BSA (ii) kvantifitseerimine, mida hinnati keskmise FL fluorestsentsi intensiivsusena raku kohta. Alpelisib päästab päästetud BSA sidumise ja sisestamise, mida täheldati Ocrlis^Y/-rakud. N=209, 228, 186 ja 196 lahtrit OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/DMSO ja Ocrl jaoks^Y/-alpelisibi tingimused vastavalt punktides (i) ja N=203, 183, 199 ja 233 lahtrites OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl jaoks^Y/-DMSO ja Ocrl^Y/-alpelisiibi tingimused, vastavalt punktis ii, igal juhul kombineeritud 2 hiire neerust seisundi kohta; iga andmepunkt tähistab keskmist FL fluorestsentsi intensiivsust üksikus rakus. Olulisust testiti Kruskal-Wallise (KW) dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil Dunni mitme võrdluse testiga: (i) rakupinna BSA puhul üldine ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO ja Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (mitte="" oluline="" [ns]);="" (ii)="" sisestatud="" bsa="" puhul,="" üldine="" ***p="">< 0,001,="" mitu="" võrdlust:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO ja Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" rakupinna="" alexa="" 488-="" bsa="" ja="" sisestatud="" alexa="" 488–bsa="" fl="" fluorestsentsi="" intensiivsuse="" vahelise="" suhte="" kvantifitseerimine,="" mis="" ei="" näita="" olulisi="" erinevusi="" iga="" seisundi="" suhetes.="" iga="" punkt="" esindab="" keskmist="" suhet="" väljal,="" mis="" sisaldab="" ligikaudu="" 15–20="" lahtrit="" (n="13," 13,="" 10="" ja="" 11="" juhuslikult="" valitud="" välja="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="" ocrl="">^Y/-DMSO ja Ocrl^Y/-vastavalt alpelisibi tingimused, mis on igal juhul ühendatud 2 hiire neerust seisundi kohta). Olulisust testiti KW ANOVA abil Dunni mitme võrdluse testidega: üldine P=0,46 (ns), mitmekordne võrdlus: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO ja Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www.kidney-international.org.

Joonis 6|Alpelisiib parandab OcrlY/L hiirte proksimaalse tuubuli (PT) funktsiooni, taastades ligandi omastamise ja megaliini ekspressiooni. (a) Eksperimentaalne seadistus. Suukaudseid hiiri raviti 6 nädalat päevase suukaudse annusega kas 1% karboksümetüültselluloosi (vehiikul) või alpelisiibi (50 mg/kg kehakaalu kohta). Ravi viimasel päeval süstiti hiirtele Cy5-märgistatud b-laktoglobuliini (N=6 Ocrl^Y/-või 8 okr^Y/-hiired rühma kohta). (b – d) Näidatud D väärtused näitavad keskmist muutust BL-st D42-le tingimuse ± SEM korral. (b) Clara raku valk 16 (CC16), (c) albumiini uriinieritus (mõlemad 15 tunni jooksul) ja (d) kehamass mõõdeti OcrlY/- hiirtel, keda raviti näidatud ajahetkel kas kandja või alpelisiibiga. Iga punkt tähistab 1 hiirt. Olulisust hinnati 2-sabaga paaritud Studenti t-testiga; punktis b CC16 (jätkub)

Joonis 6|(jätkub) toodangu muutus võrreldes algtasemega; þ sõiduk, P=0.9802 (mitteoluline [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; (c) albumiini väljundi muutus võrreldes algtasemega; þ sõiduk, P=0,0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0,0006; d) kehamassi muutus võrreldes algtasemega; þ sõiduk, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0,0083." (e)="" tüüpilised="" konfokaalsed="" mikrograafid,="" mis="" näitavad="" cy5-märgistatud="" b-laktoglobuliini="" (magenta)="" 15="" minutit="" pärast="" sabaveeni="" süstimist="" ja="" märgistusega="" 40,6-diamidino-2-fenüülindooli="" (dapi)="" (tsüaan),="" pluss="" vastavate="" fl="" fluorestsentssignaalide="" kvantifitseerimine="" hiire="" ocrl="" neerudest="" (n="412," vastavalt="" 500="" ja="" 588="" tuubulit,="" ocrly/þþ="" kandja,="" ocrl="">^Y/-þ sõiduk ja Ocrl^Y/-þ alpelisib) 3 hiire puhul ravirühma kohta. b-laktoglobuliinide omastamist päästis ravi alpelisiibiga. Vardad ¼ 20 mm. Kvantifitseerimisel tähistab iga punkt FL fluorestsentsi intensiivsust, mis on normaliseeritud torukeste pindalaga; joonistatud andmed näitavad keskmist ± SEM. Olulisust hinnati Kruskal-Wallise (KW) testiga, millele järgnes Dunni mitmekordne võrdlustest; ***P < 0,001,="" mitmekordne="" võrdlus;="" ocrly/þþ="" sõiduk="" versus="">^Y/-þ sõiduk ja Ocrl^Y/-þ sõiduk versus Ocrl^Y/-þ alpelisib, mõlemad ***P < 0.001.="" (f)="" suukaudsete="" hiirte="" tervete="" neerulüsaatide="" megaliini="" taseme="" western="" blot="" ja="" densitomeetria="" analüüs.="" laadimiskontrollina="" kasutati="" a-tubuliini.="" vähendatud="" megaliini="" ekspressioon="">^Y/-päästis alpelisib. Densitomeetria analüüsi kvantifitseerimisel tähistab iga punkt 1 hiirt (N=4 OcrlY/þþ kandur ja Ocrl^Y/-þ sõiduk ja N=3 Ocrl^Y/-þ alpelisib hiired); jooned näitavad keskmist ± SEM. Olulisust hinnati 2-sabaga sidumata Studenti t-testidega: OcrlY/þþ sõiduk versus Ocrl^Y/-þ sõiduk; **P ¼ 0.0057, okr^Y/-þ sõiduk versus Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Tüüpilised konfokaalsed mikropildid suure suurendusega sisenditega ja megaliini (kollane) intensiivsuse kvantifitseerimine suukaudsete neerude AQP1þ PT-des (magenta) märgiti ka DAPI (tsüaan) jaoks, mis illustreerivad megaliini taseme päästmist pärast alpelisiibiga ravi. Vardad =20 mm. Kvantifitseerimisel tähistab iga punkt FL fluorestsentsi intensiivsust, mis on normaliseeritud torukeste pindalaga; joonistatud andmed näitavad keskmist ± SEM; N=142, vastavalt 191 ja 266 tuubulit OcrlY/þþ sõiduki jaoks, Ocrl^Y/-þ sõiduk ja Ocrl^Y/-þ alpelisiib 3 hiirele ravirühma kohta. Olulisust hinnati KW dispersioonanalüüsiga, millele järgnes Dunni mitmekordne võrdlustest; üldine ***P < 0,001,="" mitu="" võrdlust;="" ocrly/þþ="" sõiduk="" versus="">^Y/-þ sõiduk ja Ocrl^Y/-þ sõiduk versus Ocrl^Y/-þ alpelisib, mõlemad ***P < 0.001.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Kuidas kasutatakse fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitorit alpelisiibi Lowe'i sündroomi/Denti tõve korral?

2. ARUTELU

Praegu puudub ravi PT düsfunktsiooni põhjustava defektse endotsütoosi leevendamiseksLowe'i sündroom ja Denti haigus2. Meie leiud näitavad, et alpelisiib leevendab ebanormaalset aktiini fenotüüpi, vähendades PI(4,5)P2 ja PI(3)P tasemeid, parandades oluliselt endotsüütilist masinat ja rakusüsteemide neeldumisvõimet ning humaniseeritud hiiremudelit. Lowe'i sündroom/hamba tõbi 2. Need tulemused toetavad seost fosfoinositiidi lipiidide, aktiini polümerisatsiooni ja endotsüütide kaubitsemise vahel, mis on vahetu tähtsusega üliaktiivsete epiteelirakkude jaoks, mis osalevad olulistes homöostaatilistes protsessides (joonis 7). Arvestades tõhusate ravimeetodite puudumist ja selle klassi PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)alpelisiib on paljulubav kandidaat ravimite taaskasutamiseksLowe'i sündroom ja Denti haigus.

LMW proteinuuria on kõige järjekindlam tunnus, mis esineb patsientidel, kellel onLowe'i sündroom ja Denti haigus2 OCRL-i inaktiveerivate mutatsioonide tõttu.⁴Neid LMW valke saab hõlpsasti tuvastada ja kvantifitseerida, pakkudes usaldusväärset biomarkerit defektse retseptori vahendatud endotsütoosi kohta PT-rakkudes.1 LMW proteinuuria on eriti oluline, kuna seda tuvastatakse järjekindlamalt ja sageli varem kui teisi lahustunud aineid (nt glükoos, fosfaat, aminohapped), mis on osa klassikalisest "neeru-Fanconi sündroomist" - vähemalt endolüsosomaalse raja kaasasündinud häirete korral.¹Siin näitame, et alpelisiib päästab PT-rakkude apikaalse endotsüütilise omastamise võime in vitro ja in vivo, kuna plasmamembraanil on taastatud megaliini retseptori tase. See toime kajastub LMW valkude (CC16 ja albumiini) uriiniga eritumise olulises vähenemises Ocrl-is^Y/-hiired, keda raviti alpelisiibiga 6 nädalat. Neid alpelisiibi toimeid on täheldatud m PTC-des, mis säilitavad oma apikaalse diferentseerumise ja sobivad eriti hästi retseptori vahendatud endotsütoosi uurimiseks füsioloogias ja haigustes.⁹ Täpsemalt saime humaniseeritud hiiremudelist m PTC-d, mis ekspresseerisid inimese INPP5B-d Ocrl-s^Y/-; Inpp5b^-/-taust, mis võimaldab meil uurida OCRL-i aktiivsuse kaotamise konkreetseid tagajärgi.^11,23

Endotsütoosi päästmine alpelisiibi poolt on seletatav selle mõjuga aktiini masinatele, mis on selgelt tõestatud OCRL KO HK2 rakkudes ja m PTC-des. Meie tähelepanekud kinnitavad ja laiendavad seega varasemaid uuringuid, mis näitavad seost fosfoinositiidi tasakaalu kontrolli ja F-aktiini vahel varases endosomaalses rajas OCRL-i patsientidel ja KO-rakkudel.^7,10OCRL aktiivsuse funktsionaalne kadu kahjustab PI (4, 5) P2 lagunemist, mis omakorda põhjustab klatriiniga kaetud vesiikulite katmata jätmise, mille tulemuseks on ebanormaalsed endosomaalsed organellid erinevates rakutüüpides, sealhulgas PT-rakkudes.^7-10Hiljuti näitasime, et liigne F-aktiin vähendab multiligandi retseptori megaliini ringlust PT-rakkude apikaalsesse membraani, põhjustades defektset endotsütoosi ja LMW proteinuuriat.¹¹

Meie andmed näitavad, et alpelisiibi toimemehhanism endosomaalsele aktiinile tuleneb alpelisiibi inhibeerimise bispetsiifilisest toimest: esiteks PI(3,4,5)P3 tootmisel ja selle muutumisel PI(3)P-ks ning teiseks PI(4,5)P2 tootmine. PI(4,5)P2 taseme langus neutraliseerib otseselt OCRL-i puudulikkust ja on kooskõlas varasemate töödega, mille eesmärk on leevendada liigset aktiini ja suurendada endotsüütide väljavoolu, vähendades fosfatidüülinositool-4-fosfaat-5-kinaasi taset. , ensüüm, mis genereerib PI(4,5)P2.¹⁰Alpelisibil on 0,5 mM 50-protsendiline inhibeeriv kontsentratsioon PI(4,5)P2 genereeriva kinaasi PI4Kb suhtes, mis võib olla vastutav, või see võib tuleneda OCRL-i kombinatsioonist tulenevatest üldisematest mõjudest fosfoinositiidide tasakaalule. KO ja alpelisib ravi. Oleme tuvastanud, et klass IA PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)alpelisiibi pärssimine on aktiini inhibeerimise jaoks oluline, kuna siRNA-vahendatud p110a ammendumine pärsib aktiini akumulatsiooni sarnaselt alpelisiibiga ja kopanlisiibiga (mis väidetavalt ei inhibeeri PI4K-sid). RPE rakkudes oleme varem täheldanud, et INPP4A siRNA, mis muudab PI(3,4)P2 PI(3)P-ks, inhibeerib aktiini kokkupanekut OCRL KO rakkudes, pakkudes teed PI(3,4,5) inhibeerimiseks. P3 tootmine endosomaalse PI(3)P vähenemiseni. Näitasime, et osa PI (3) P-st jääb alles, arvatavasti varajases endosoomis toodetud kogum III klassi PI3K, Vps34 poolt, sest leidsime, et alpelisiibravi pigem suurendab kui pärsib endosomaalset inimkaubandust. PI metabolismi keerulist kaasregulatsiooni ja selle olulisust OCRL-i inaktiveerimisel on rõhutatud ka hiljutises uuringus, kus fosfoinositiidi 3- fosfataasi PTEN mittekatalüütilised funktsioonid aktiveerivad PI(4,5)P2 lagunemise PLCXD kaudu, leevendades raku fenotüüpide ja imendumist. ligandid sebrakala mudelis.³¹

Aktiini fenotüübi leevendamine PI(4,5)P2 ja PI(3)P alandatud tasemetega alpelisiibraviga on kooskõlas PI(4,5)P2 ja PI(3)P sünergilise toimega SNX9 värbamisel aktiveerimiseks. aktiini masin Ocrl endosoomides,¹⁴mis viitab väga tõhusale alpelisiibi spetsiifilisusele, et manipuleerida aktiini aktiveerimise molekulaarse regulatsiooniga endosoomides. Omakorda, nagu eelnevalt näidatud, viib endosomaalse aktiini vähenenud kokkupanek omakorda PT endotsütoosi paranemiseni OCRL-i puudulikkusega rakkudes.¹⁰Vaja on täiendavat iseloomustamist, et paremini mõista, kas aktiini reguleerimine fosfoinositiidi metabolismi kaudu on terapeutilise toime tõeline allikas, mida me alpelisiibiga Ocrl-is täheldame.^Y/-hiire mudel. Kuna I klass PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)reguleerida radasid, mis kontrollivad rakkude kasvu, proliferatsiooni, ellujäämist, ainevahetust ja autofaagiat,³²me ei saa välistada, et endotsüütiline päästmine on tingitud otsesest mõjust PI (3, 4, 5) P3-le ja kombineeritud mõjust teistele radadele, mida moduleerib I klassi PI3K. Rohkem tööd on vaja ka selleks, et testida, kas PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitorid võivad samuti leevendada OCRL-i mutatsioone kandvate patsientide neuroloogilisi ja muid kliinilisi ilminguid.⁴

Hiljutised kogemused alpelisiibiga PROS/CLOVES-i sündroomiga lastel viitavad sellele, et ravim võib olla hästi talutav. Alpelisiibi võetakse suukaudselt ja see on selektiivselt suunatud PI3K (fosfoinositiidi 3-kinaas)klass I ja sellel on pan-PI3K inhibiitoritega võrreldes väike toksilisuse profiil. Kuna alpelisib ei blokeeri täielikult PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)aktiivsust, säilitades seega signaaliraja funktsioonid, võib see olla eriti sobiv pikaajaliseks kasutamiseks. Huvitav on see, et alpelisiibi kasutamisest põhjustatud hüperglükeemia võib olla juhitav toitumise muutustega.²²Kuna PT düsfunktsioon on esimene Denti tõve 2 ja Lowe'i sündroomiga väikelastel täheldatud neeruhaiguse ilming, võib sellise PT düsfunktsiooni varajane ravi, mis viib metaboolse profiili ja kasvu paranemiseni, aeglustada kroonilise neeruhaiguse progresseerumist ja seetõttu avaldab olulist mõju elueale ja elukvaliteedile.³³Kuigi OCRL-i mutatsiooni haiguse ilmingud on eriti laiad, ei näidanud hiljutised uuringud, mis põhinesid Denti tõve 2 Lowe'i sündroomiga genotüübiga patsientide suurtel rühmadel, olulist mõju mutatsiooni tüübile või mutatsiooni asukohale neerude elulemusele.³⁴Kokkuvõttes näitavad meie andmed alpelisiibi potentsiaali uuesti kasutada PT düsfunktsiooni raviks Lowe'i sündroomi / Denti tõve 2 korral, luues seega aluse kiireks ja kulutõhusaks kasutuselevõtuks inimeste kliinilistes uuringutes.

3. MEETODID

3.1 Täielikud üksikasjad leiate lisameetoditest.

HK2 rakke töödeldi kopanlisiibi, alpelisiibi, GSK2636771 või idelalisiibiga näidatud kontsentratsioonides 16 tundi, kui pole öeldud teisiti. Valgud ekstraheeriti standardsete meetoditega rakkudest või neerukudedest ja Western blot viidi läbi, kasutades avaldatud või kaubanduslikult saadavaid antikehi. siRNA knockdown viidi läbi, kasutades 2 transfektsiooni 72 ja 24 tundi enne analüüsi. Kasutasime vanuse ja soo järgi sobitatud OcrlY/þ; Inpp5b^{- /-}; ja Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- hiire pesakonnakaaslased, kellel on BAC-INPP5B ekspressioon. 8 nädala vanuste Ocrl hiirte neerudest saadi m PTC-de primaarsed kultuurid ja suukaudsete m PTC-de endotsüütivõimet hinnati albumiini omastamise mõõtmisega. Alpelisiibiga töötlemine oli 10 mM 16 tundi, kui pole öeldud teisiti. Albumiini omastamist m PTC-des hinnati "impulsi tagaajamise" protokolli abil, et hinnata apikaalset seondumist ja sellest tulenevat omastamist. m PTC-sid värviti üleöö sobiva primaarse antikehaga ja 45 minutit sobivate FL fluorofooriga konjugeeritud sekundaarsete antikehade ja/või Alexa-488 Phalloidiiniga. PI(3)P värvimine m PTC-ga viidi läbi, kasutades FYVE domeenisondi. Pildianalüüs viidi läbi rakendusega CellProfifiler, kasutades kohandatud torujuhtmeid aktiini / EEA1 kattuvuse ja punktide arvu mõõtmiseks ning ImageJ-ga immunofluorestsentsi intensiivsuse ja tuvastatud servade mõõtmiseks stressikiudude skoori arvutamiseks. Kvantitatiivsed andmed väljendati keskmisena ± keskmise standardviga. In vivo katsete jaoks töödeldi 6 nädala vanuseid hiiri kandja või alpelisiibiga 50 mg/kg kehakaalu kohta. Uriini koguti iga 14 päeva järel ja loomad surmati pärast 42-päevast ravi ning koguti veri ja neerud. Suukaudsete hiirte PT endotsüütide võimet uuriti b-laktoglobuliini omastamise mõõtmise teel.

4. AVALIKUSTAMINE

JLG rahastab AstraZeneca oma laboris õppimist. SPJ kuulub nõuandekogudesse ja omab aktsiaid ettevõtetes Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics ja Adrestia Therapeutics ning on Ahren Innovation Capitali teaduspartner. Kõik teised autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

5. TUNNUSTUS

Seda tööd toetas Euroopa Teadusnõukogu toetus 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z. Research Isaac, Gran23 New18 Trust (j) JLG-le ja Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z SPJ-le ning tunnustame Gurdoni Instituudi rahastust Wellcome Trustilt (092096) ja CRUKilt (C6946/A14492). Oleme tänulikud tsüstinoosiuuringute sihtasutusele (Irvine, CA), Šveitsi riiklikule teadusfondile (projektitoetus 310030_189044), Šveitsi UZH kliiniliste uuringute prioriteetsele programmile (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zürich).

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) toetuse eest ning NIDDK/NIH ja Lowe Syndrome Trust/UK oraalsete hiirte arendamise toetamise eest. Tunnustame Robert L. Nussbaumi (Invitae Corporation ja UCSF, San Francisco, CA) ja Maria Antonietta De Matteisi (Telethoni geneetika ja meditsiini instituut, Federico II ülikool Napolis, Napoli, Itaalia) Oral hiirekoloonia asutajate eest.

ja Eric Olinger (UZH, Zürich) viljakate arutelude eest. Täname Nadine Näegelet ja Daniela Nierit tehnilise abi eest uriini kogumisel ja analüüsimisel; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Pariis), et jagas meiega üksikasjalikku protokolli Alpelisib'i ettevalmistamiseks in vivo raviks; ning Renata Kozyraki ja Pierre Verroust reaktiivide pakkumise eest. Täname ka Zürichi ülikooli (Zürich, Šveits) mikroskoopia ja pildianalüüsi keskust ja Zürichi integreeriva näriliste füsioloogia (ZIRP) rajatist pildistamise ja tehnilise toe pakkumise eest in vivo katsete ajal.

Kuidas kasutatakse fosfoinositiidi 3-kinaasi inhibiitorit alpelisiibi Lowe'i sündroomi/Denti tõve korral?

6. LISAMATERJAL

Täiendav fail (PDF)

Täiendavad meetodid ja viited.

Tabel S1. Kehakaal, uriin ja vere parameetrid aja jooksul suukaudsetel hiirtel, keda raviti alpelisiibi või kandjaga.

Joonis S1. p110 isovormi ekspressiooni ja ravimi annuse-vastuse tsütotoksilisuse testid HK2 rakkudes.

Joonis 2. PI3Kinhibiitor alpelisibtaastab aktiini ja endosoomi kattuvuse ja vähendab PI(3)P taset annusest sõltuval viisil 4 tundi pärast ravi HK2 rakkudes.

Joonis S3. p110 isovormi ekspressioon ja alpelisiibi toksilisus Ocrl mPTC-des.

Joonis S4. EEA1/aktiini kattumise analüüsi töövoog Ocrl mPTC-des.

Joonis S5. Alpelisib taastab albumiini omastamise Ocrlis^Y/-mPTC-d. Aqp1 ekspressiooni ei mõjuta. Täiendav fail (filmid)

Film S1. EEA1 / aktiini Imaris 3D-renderdamine kattub DMSO-ga töödeldud OcrlY / þ mPTC-des. 16 tundi DMSO-ga töödeldud OcrlY/þ mPTC-de konfokaalse virna tüüpiline 3D pinna renderdamine, seejärel fikseeritud 4-protsendilise formaldehüüdi fiksaatoriga ja immunomärgistatud EEA1 (lilla), aktiini (falloidiin; kollane) ja DAPI (sinine) suhtes, illustreerides vähe. aktiini / endosomaalne seos. Riba =5 mm.

Film S2. EEA1/aktiini kattumise Imaris 3D-renderdamine Ocrl-is^Y/-DMSO-ga töödeldud mPTC-d. 16 tunni jooksul DMSO-ga töödeldud OcrlY/– mPTC-de konfokaalse virna tüüpiline 3D-pinna renderdamine, seejärel fikseeritud 4-protsendilise formaldehüüdi fiksaatoriga ja immunomärgistatud EEA1 (lilla), aktiini (falloidiin; kollane) ja DAPI (sinine) suhtes, illustreerides punktmärke aktiini seostamine endosomaalsete struktuuride lähedal. Riba=5mm.

Film S3. EEA1/aktiini kattumise Imaris 3D-renderdamine Ocrl-is^Y/- alpelisiibiga töödeldud mPTC-d. 16 tunni jooksul 10 mM alpelisiibiga töödeldud OcrlY/– mPTC-de konfokaalse virna tüüpiline 3D pinna renderdamine, seejärel fikseeritud 4-protsendilise formaldehüüdi fifiksiga ja immunomärgistatud EEA1 (lilla), aktiini (falloidiin; kollane) ja DAPI (sinine) jaoks. , mis illustreerib endosoomide ümber asuvate aktiini punktstruktuuride päästmist. Riba =5 mm.

VIITED

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Füsioloogia õppimine päritud neeruhäiretest. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Loi M. Lowe'i sündroom. Orphanet J Rare Dis. 2006; 1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Lowe sündroom. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., toim. GeneReviews® [internet]. Seattle (WA): Washingtoni Ülikool, Seattle; 1993-2020. Saadaval aadressil: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Avaldatud 24. juulil 2001; Värskendatud 18. aprillil 2019. Avatud 8. augustil 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-fosfataasi OCRLLowe'i sündroom ja Denti haigus2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Kloriidi transporterid ja retseptori vahendatud endotsütoos neeru proksimaalses tuubulis. J Physiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Lowe'i sündroomi puhul on puudulik valk fosfatidüülinositool-4, 5-bisfosfaat5- fosfataas. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nánndez R, Balkin DM, Messa M, et al. Lowe'i sündroomi rakkude uuringud näitasid OCRL-i rolli klatriiniga kaetud kaevu dünaamikas ja katmata jätmises. eElu. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Lowe'i sündroomi valgu OCRL1 rakulised ja füsioloogilised funktsioonid. Liiklus. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. Autofagosoomi-lüsosoomi liitmine käivitab lüsosomaalse vastuse, mida vahendab TLR9 ja mida kontrollib OCRL. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E jt. OCRL kontrollib kaubitsemist varajaste endosoomide kaudu endosomaalse aktiini PtdIns4,5P(2)-sõltuva regulatsiooni kaudu. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A jt. OCRL-i puudulikkus kahjustab endolüsosomaalset funktsiooni humaniseeritud hiiremudelisLowe'i sündroom ja Denti haigus. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD jt. P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- ja Gbetagamma reguleeritud guaniini-nukleotiidi vahetusfaktor Rac jaoks. Kamber. 2002;108:809–821.

13. Gallop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinositiidid ja membraani kõverus muudavad aktiini polümerisatsiooni režiimi Toca-1 ja Snx9 selektiivse värbamise teel. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Warrant A, Holst MR jt. Aktiini polümerisatsiooni juhtimine fosfoinositiidide ja kõrge membraani kõveruse kokkulangemise kaudu. J Cell Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T et al. PTEN reguleerib PI(3,4)P2 signaaliülekannet I klassi PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas). Mol Cell. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M jt. Fosfatidüülinositool3-fosfaadi lokaliseerimine pärmi- ja imetajarakkudes. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD et al. PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inimeste haiguste rada. Kamber. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, et al. BAY 80-6946 on väga selektiivne intravenoosne PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibiitor, millel on tugev p110alfa ja p110delta aktiivsus kasvaja rakuliinides ja ksenotransplantaadi mudelites. Mol Cancer Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C jt. Romaani iseloomustus ja spetsiifiline PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)alfa inhibiitor NVP-BYL719 ja patsientide kihistusstrateegia väljatöötamine kliinilisteks uuringuteks. Mol Cancer Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA jt. Kliiniliseks hindamiseks valitud tugeva ja selektiivse fosfatidüülinositool-3 kinaasi alfa inhibiitori NVP-BYL719 avastamine. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G jt. Alpelisib PIK3CA-mutatsiooniga, hormoonretseptor-positiivse kaugelearenenud rinnavähi jaoks. N Engl J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH jt. Sihipärane ravi PIK3CA-ga seotud ülekasvu sündroomiga patsientidel. Loodus. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM jt. Hiiremudel Lowe'i sündroomi / Dent Disease 2 neerutuubulopaatia jaoks. J Am Soc Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J et al. Monoklonaalne antikeha PtdIns(3,4,5)P(3) visualiseerimiseks rakkudes. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Immunotsütokeemilised meetodid näitavad PtdIns4P ja PtdIns(4,5)P(2) mitut erinevat rakukogumit. Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S jt. Fosfoinositiidi muundamise dünaamika klatriini vahendatud endotsüütilises liikluses. Loodus. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, kehv Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)isovormid raku signaalimises ja vesiikulite kaubitsemises. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P jt. Dent-2 tõvega patsientide OCRL-mutatsiooniga fibroblastid näitavad INPP5B-st sõltumatut fenotüübilist varieeruvust võrreldes Lowe'i sündroomi rakkudega. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. PIP2 5-fosfataasi puudulikkus Lowe'i sündroomi korral mõjutab aktiini polümerisatsiooni. Olen J Hum Genet. 2002; 71:1420–1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J jt. Kasvajaspetsiifiline PI3K(fosfoinositiidi 3-kinaas)inhibeerimine nanoosakestele suunatud kohaletoimetamise kaudu pea ja kaela lamerakk-kartsinoomi korral. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C jt. PTEN vähendab endosomaalset PtdIns(4,5)P2 fosfataasist sõltumatul viisil PLC raja kaudu. J Cell Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. RAB GTPaasi ja fosfoinositiidi regulatsiooni ja funktsioonide koordineerimine. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G jt. Haruldased pärilikud neeruhaigused: väljakutsed, võimalused ja perspektiivid. Lancet. 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M jt. Pikaajaline neerutulemus OCRL-i mutatsioonidega lastel: suure rahvusvahelise kohordi retrospektiivne analüüs. Nephrol Dial siirdamine. 2018;33:85–94.

Alates: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Autoriõigus ª 2020, International Society of Nephrology. Väljaandja Elsevier Inc. See on avatud juurdepääsuga artikkel CC BY litsentsi alusel (HTTP://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Cambridge'i ülikooli instituut, Tennis Court Road, Cambridge CB{0}}QN, Ühendkuningriik. E-post: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; või Olivier Devuyst, Zürichi Ülikooli Füsioloogia Instituut, Zürich, Šveits. E-post: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Need autorid panustasid sellesse töösse võrdselt.⁶Need autorid juhtisid uuringut. Saabunud 8. augustil 2019; muudetud 1. mail 2020; vastu võetud 15. mail 2020; avaldatud veebis 9. septembril 2020