Floretiin pärsib neuropõletikku autofagia poolt vahendatud Nrf2 aktiveerimise kaudu makrofaagides

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne

Taust: Makrofaagidel on neuropõletikuliste häirete, nagu hulgiskleroos (MS) puhul kahekordne roll. Nad osalevad kahjustuse tekkes ja progresseerumises, kuid võivad soodustada ka kahjustuse paranemistpõletikja kahjustatud koe parandamine. Selles uuringus uurime, kas ja kuidasfloretiin, flavonoid, mida leidub rohkesti õuntes ja maasikates, alandab makrofaagide põletikulist fenotüüpi ja pärsibneuropõletik.

meetodid: transkriptsioonilisi muutusi hiire luuüdist pärinevates makrofaagides pärast floretiiniga kokkupuudet hinnati RNA hulgijärjestuse abil. Põletiku, oksüdatiivse stressivastuse ja autofagiaga seotud alusrajad valideeriti kvantitatiivse PCR-i, fluorestsents- ja neeldumisanalüüside, tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktoriga 2 (Nrf2) knockout hiirte, Western blot ja immunofluorestsentsi abil. Eksperimentaalset autoimmuunse entsefalomüeliidi (EAE) mudelit kasutati floretiini mõju uurimiseks neuroinflammatsioonile in vivo ja selle aluseks olevate mehhanismide kinnitamiseks.

TulemusedNäitame, et floretiin vähendab makrofaagide põletikulist fenotüüpi ja pärsib märkimisväärselt EAE neuroinflammatsiooni. Floretiin vahendab selle toimet, aktiveerides Nr2 signaaliraja. Nrf2 aktiveerimine omistati 5'AMP-aktiveeritud proteiinkinaasi (AMPK) sõltuvale autofagia aktiveerimisele ja sellele järgnevale kelchi-sarnasele ECH-ga seotud valgu 1 (Keap1) lagunemisele.

Järeldused: see uuring avab floretiini tulevikuperspektiivid neuropõletikuliste häirete, nagu MS, ravistrateegiana.

Proovi registreerimine: Ei ole kohaldatav.

Märksõnad: floretiin, makrofaagid, neuropõletik, hulgiskleroos, autoimmuunsus

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Taust

Aktiivseid hulgiskleroosi (MS) kahjustusi iseloomustab arvukate kahjustuste esineminemakrofaagid[1-5]. Varased uuringud näitasid, et makrofaagid võtavad MS kahjustustes kasutusele põletikueelse fenotüübi, soodustades seeläbineuropõletik, demüelinisatsioon ja neurodegeneratsioon. Haigust soodustavad efektorfunktsioonid hõlmavad kesknärvisüsteemist (KNS) pärinevate antigeenide esitlemist autoreaktiivsetele T-rakkudele ja põletikuliste vahendajate, näiteks põletikueelsete tsütokiinide, reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja lämmastikoksiidi (NO) tootmist. 6,7]. Hiljuti leiti, et makrofaagidel on kasulikud funktsioonid ka MS kahjustuste korral, kuna nad võivad oma fenotüübi ümber kujundada selliseks, mis on tavaliselt seotud immunosupressiooni ja kesknärvisüsteemi paranemisega. Seda kaitsvat fenotüüpi iseloomustab põletikueelsete vahendajate vähenenud tootmine, põletikuvastaste vahendajate ja kasvufaktorite tootmine ning antioksüdatiivsete radade, näiteks tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktori 2 (Nrf2) aktiveerimine. [8-14]. Kuna makrofaagide põletikulist seisundit on seostatud SM progresseerumisega ja krooniliste aktiivsete kahjustuste tekkega, peetakse makrofaagide suunamist kasuliku fenotüübini paljulubavaks strateegiaks SM progresseerumise piiramiseks [15].

Toidukomponendid soodustavad makrofaagide funktsiooni ja neuropõletikku [16]. Eelkõige tunnistatakse üha enam flavonoidide perekonda, mis sisaldab paljutõotavaid ühendeid, mis mõjutavad patogeenseid radu ja moduleerivad immuunrakkude, näiteks makrofaagide fenotüüpi[17,18]. Flavonoidid moodustavad ühe suurima fütotoitainete perekonna, mis sisaldab üle 8000 erineva bioaktiivsusega fenoolühendi. Mitmetel flavonoidide perekonna liikmetel on makrofaagidele põletikuvastane ja antioksüdatiivne toime [19-21]. Flavonoidne floretiin on dihüdrokalkoonide liige ja seda leidub tavaliselt tarbitavates puuviljades, nagu õunad ja maasikad. Floretiin avaldab teadaolevalt immunomoduleerivaid omadusi ja seda kasutatakse laialdaselt nahahoolduses selle antioksüdatiivse omaduse tõttu [22-24]. Lisaks on floretiin glükoosi transporteri (GLUT) inhibiitor – omadus, mis mõjutab makrofaagide fenotüüpi, kuna makrofaagide aktiveerimist soodustab GLUT [25, 26]. Üldiselt muudavad need omadused floretiinist paljulubavaks ühendiks makrofaagide fenotüübi ja neuroinflammatsiooni moduleerimiseks. Selles uuringus näitame, et floretiin juhib makrofaage vähem põletikulise fenotüübi poole ja leevendab neuropõletikku eksperimentaalses autoimmuunse entsefalomüeliidi (EAE) mudelis. RNA sekveneerimine ja funktsionaalsed katsed tuvastasid Nrf2 raja selle floretiini poolt indutseeritud kaitsva makrofaagi fenotüübi sõlmpunkti ja juhina. Leiti, et makrofaagides on Nrf2 aktiveerimise aluseks AMPK-sõltuv autofagia masinavärgi aktiveerimine ja sellele järgnev SQSTMl/p62-vahendatud (edaspidi p62) Keapli lagunemine, adapter, mis hõlbustab proteasomaalset Nrf2 lagunemist. Need leiud näitavad, et floretiinil on potentsiaali kasutada neuropõletikuliste häirete ravistrateegiates.

meetodid

Antikehad ja keemilised reaktiivid

Floretiin(Sigma Aldrich) lahustati 50 mM KOH-s 15 mM põhilahuseks ja säilitati -20 kraadi juures. Edasised lahjendused tehti RPMI1640 (Gibco) söötmes. In vivo töötlemiseks lahustati floretiin 1 N NaOH-s, seejärel reguleeriti pH 7,2-ni 1 N HCl-ga ja lahust lahjendati täiendavalt füsioloogilises vees, et saada kontsentratsioon 50 mg/kg. BML-275 (1 μM, Santa Cruz Biotechnology) lisati 1 tund enne ravi floretiiniga, et pärssida AMPK aktivatsiooni. Bafilomütsiin A1 (BAF, 0, 1 μM, InvivoGen) lisati 2 tundi enne kogumist, et blokeerida autofagosoomide ja lüsosoomide sulandumine. Lipopolüsahhariidi (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) kasutati rakkude stimuleerimiseks põletikulise fenotüübi määramiseks. ROS-i tootmise indutseerimiseks kasutati forbool12-müristaat13-atsetaati (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich). Western blot jaoks kasutati järgmisi antikehi: hiire anti- -aktiin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), hiire anti-GAPDH (1:{{29) }};AB_2537659, Invitrogen), küüliku anti-AMPK (1:1000;5831S, rakusignaalitehnoloogia), küüliku anti-fosforüülitud AMPK (1:1000; 2535S, rakusignaalitehnoloogia), küüliku anti-LC3 (1:1000;L7543, Sigma-Aldrich), küüliku anti-p62 (1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Immunofluorestsentsi jaoks kasutati järgmisi antikehi: roti anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), roti anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), küüliku anti-LC3 (1:1000). ;L7543, Sigma-Aldrich), küüliku anti-p62 (1:500;23214, rakusignaalitehnoloogia), küüliku anti-Keap1 (1:500;60027-1-Ig, Proteintech Europa), küüliku anti-TMEM119 (1) :100, ab209064, Abcam). Sobivad sekundaarsed antikehad osteti ettevõttelt Invitrogen.

Hiired

Metsiktüüpi (WT) C57BL / 6JOlaHsd hiired osteti Envigost. Loomi toideti korrapärase dieediga ja majutati Hasselti ülikooli biomeditsiiniuuringute instituudi loomarajatis. Kõik katsed viidi läbi vastavalt institutsionaalsetele juhistele ja need kiitis heaks Hasselti ülikooli loomkatsete eetikakomitee.

Rakukultuur

Luuüdist saadudmakrofaagid(BMDM-id) isoleeriti WT ja Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd hiirtelt, osteti Envigost ja tarniti RIEN BRC poolt vastavalt MTA-le prof S. Kerdine-Römerile [27,28]. BMDM-id saadi nagu eelnevalt kirjeldatud [29]. Lühidalt öeldes kasvatati 12-nädala vanuste WT ja Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd hiirte sääreluu ja reieluu luuüdi rakke 10- cm Petri plaatidel kontsentratsiooniga 10 × 106 rakku/ plaat, RPMI1640 söötmes, millele on lisatud 10 protsenti vasika loote seerumit (FCS, Gibco), 50 U/ml penitsilliini (Invitro-gen), 50 U/ml streptomütsiine (Invitrogen) ja 15 protsenti L929-konditsioneeritud söödet (LCM). ). Pärast diferentseerumist eraldati BMDM-id 37 kraadi juures 10 mM EDTA-ga PBS-is (Gibco) ja kultiveeriti (0,5 × 10 kraadi rakke/ml) RPM1640-s, millele oli lisatud 10 protsenti FCS-i, 50 U/ml penitsilliini, 50 U/ml streptomütsiini ja 5 protsenti LCM-i. 37 kraadi C, 5 protsenti CO2). Mikrogliia kultuurid eraldati sünnijärgsete P1-3 C57BL/6/OlaHsd poegade ajudest. Pärast ajutüve, koroidpõimiku ja ajukelme eemaldamist eraldati aju mehaaniliselt ja seediti ensümaatiliselt 15 minutit 1 × trüpsiiniga (Gibco) temperatuuril 37 kraadi. Seejärel külvati rakususpensioon DMEM-i kõrge glükoosisisaldusega söötmesse (Sigma), millele oli lisatud 30% LCM-i, 10% FCS-i, 50 U/ml penitsilliini ja 50 U/ml streptomütsiini T75 kultiveerimiskolbidesse. Kaks kuni kolm päeva hiljem viidi läbi täielik söötme vahetus. Segatud gliiakultuure loksutati (230 p/min, 3 h, 37 kraadi) 6-7 päeva pärast, et saada puhtad mikrogliia kultuurid.

RNA sekveneerimine

Rakke töödeldi eelnevalt floretiiniga (50 μM) 20 tundi ja LPS-stimuleeritud (100 ng/ml) 6 tundi. Rakkude lüüs viidi läbi, kasutades Qiazol Lysis reagenti (Qiagen). RNA ekstraheeriti rakkudest RNeasy minikomplekti (Qiagen) abil. Seejärel töödeldi proove Genomics Core Leuven (Belgia). Illuminaga ühilduvate raamatukogude loomiseks valmistati raamatukogu ette Lexogeni QuantSeq komplektiga. Raamatukogud sekveneeriti Illumina HiSeq4000 sekveneerimissüsteemis. Splice-teadlik joondus viidi läbi STAR v2.6.1b-ga[30]. Lugemiste kvantifitseerimine geeni kohta viidi läbi HT-seq Count v2.7.14 abil. Loenduspõhine diferentsiaalekspressiooni analüüs viidi läbi R-põhise (The R Foundation for Statistical Computing, Viin, Austria) Bioconductor paketiga DESeq2. Erinevalt ekspresseeritud geenide loend valiti aadressil ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni PCR

Rakke töödeldi eelnevalt floretiiniga (5{8}} μM) 20 tundi ja LPS-i stimuleeriti (100 ng/ml) 6 tundi. Lüüsimine viidi läbi, kasutades Qiazol Lysis reagenti (Qiagen). RNA ekstraheeriti RNeasy minikomplekti (Qiagen) abil. RNA kontsentratsioon ja kvaliteet määrati nanotilga spektrofotomeetriga (Isogen Life Science). cDNA süntees viidi läbi, kasutades Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) vastavalt tootja juhistele. qPCR viidi läbi StepOne-Plus" reaalajalise PCR süsteemiga (Applied Biosystems), kasutades SYBR rohelist segu, mis sisaldas 1 × SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM praimereid (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA-d ja nukleaasivaba vett. Geeniekspressiooni kvantifitseerimiseks kasutati võrdlevat Ct meetodit Andmed normaliseeriti kõige stabiilsemate võrdlusgeenide tsükliin A ja hüpoksantiini fosforibosüültransferaasi 1 järgi. Praimeri järjestused on saadaval nõudmisel.

Reaktiivsete hapnikuliikide määramine

Rakke töödeldi eelnevalt floretiiniga (50 uM) 2 tundi. Seejärel stimuleeriti rakke PMA-ga (15 minutit, 100 ng/ml) ja ROS-i tootmist mõõdeti fluorestsentssondi 2',7'-diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaati abil 10 μM juures PBS-is 30 minutit. Fluorestsentsi mõõdeti fluorestsentsiga mikroplaadilugejaga FLUOstar optima (BMG Labtech, Ortenberg, Saksamaa) (ergastus: 495 nm, emissioon: 529 nm).

Lämmastikoksiidi mõõtmised

Rakke töödeldi eelnevalt floretiiniga (50 µM) 2 tundi. Seejärel stimuleeriti rakke LPS-ga (24 tundi, 100 ng/ml). NO-d jälgiti kaudselt, kasutades Griessi reaktiivi nitritimõõtmiskomplekti (Abcam). Lühidalt öeldes reageerib nitraat sulfaniilamiidi ja N-(1-naftüül)etüleendiamiindivesinikkloriidiga, et saada roosa asovärv. Seejärel mõõdeti selle asoderivaadi neeldumist 540 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Rakke töödeldi floretiiniga (5{{10}} μM) ja LPS-ga (100 ng/ml) 1 või 24 tundi, et määrata vastavalt AMPK aktivatsioon või p62, LC3 ja Keapl valgu tase. Rakud lüüsiti RIPA-puhvriga (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% naatriumdeoksükolaati, 1% SDS, 50 mM Tris) ja eraldati naatriumdodetsüülsulfaadi polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga. Geelid kanti üle PVDF-membraanile (VWR) ja blotid blokeeriti 1 tund 5% veise seerumi albumiiniga Tris-puhverdatud soolalahuses, mis sisaldas 0,1% Tween{20}}(TBS-T). Membraane sondeeriti primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C, pesti TBS-T-ga ja inkubeeriti vastava sekundaarse mädarõika peroksidaasiga märgistatud antikehaga 1 tund toatemperatuuril (RT). Immunoreaktiivsed signaalid tuvastati täiustatud kemoluminestsentsiga (ECL Plus, Thermo Fisher), kasutades Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences). Ribade tihedus määrati ImageJ abil.

Immunofluorestsents

Seljaaju krüosektsioonid kuivatati õhu käes ja fikseeriti jääkülmas atsetoonis 10 minutiks - 20 kraadi juures. Hiire BMDM-e kasvatati klaasist katteklaasidel ja fikseeriti jääkülmas metanoolis 10 minutit -20 kraadi juures. Sektsioonid ja BMDM-id blokeeriti 30 minutiks, kasutades Dako valguplokki (Agi-lent). Seejärel inkubeeriti neid üleöö 4 °C juures primaarsete antikehadega, pesti ja inkubeeriti sobivate sekundaarsete antikehadega 1 tund toatemperatuuril. Seljaaju koest tehti kujutised Nikon Eclipse 80i mikroskoobiga (10x objektiiv) ja NIS-iga. Elements BR 3.10 tarkvara (Nikon). P62, LC3 ja Keapli jaoks värvitud BMDM-ide kujutised tehti Zeiss LSM 880 konfokaalse mikroskoobiga ja korrigeeriti Airyscaniga (63× objektiiv).P62-ja LC3- positiivsed punktid määrati poolautomaatse puncta analüüsi kujutisega J. Lühidalt, pärast kujutise binaarseks muutmist ja rakkude käsitsi valimist analüüsiti punkte raku kohta. P62 ja Keapl kolokaliseerimine viidi läbi CellProfileri tarkvara kolokaliseerimiskonveieri abil [31 ].Joonistel kujutatud kujutised on digitaalselt täiustatud.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeutiline seadistus). Hiiri kaaluti ja hinnati iga päev haiguse neuroloogiliste nähtude suhtes vastavalt tootja hiire EAE hindamisjuhendile: 0: kliinilised sümptomid puuduvad,0.5: saba ots on lõtv, 1: loid saba , 1,5: saba ja tagajalgade lonkamine 2: saba lonkamine ja tagajalgade nõrkus, 2,5: saba lonkamine ja tagajalgade lohisemine, 3: saba lonkamine ja tagajalgade täielik halvatus, 3,5: saba lonkamine ja tagajalgade täielik halvatus jalad ja hiir ei suuda end külili asetades parandada, 4: diafragma halvatus, 5: surm EAE poolt.

Statistiline analüüs

GraphPad Prism kasutati andmete statistiliseks analüüsimiseks, mis on esitatud keskmisena ± sem D'Agostino ja Pear-soni omnibussi normaalsuse testi kasutati normaalse jaotuse testimiseks. Normaalse jaotusega andmete jaoks kasutati kahepoolset paaristamata Studenti t-testi (vajadusel koos Welchi parandusega). Mann-Whitney analüüsi kasutati andmete jaoks, mis ei läbinud normaalsuse testi.p-väärtused<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Tulemused

Makrofaagide floretiinraviga seotud transkriptsioonilised muutused

Võimalike põletikuvastaste toimete kindlakstegemiseks ja makrofaagide floretiinravi aluseks olevate mehhanismide tuvastamiseks viisime läbi RNA hulgijärjestuse (täiendav joonis 1). Floretiiniga töödeldud aktiveeritud makrofaagide rajaanalüüs näitas, et erinevalt ekspresseeritud geenid olid kanoonilistes radades üleesindatud.põletik, nagu iNOS(z-skoor:-2.449), tasuline retseptor(z-skoor:-2.236), interferooni signaalimine (z-skoor:- 2), ja ägeda faasi vastuse rada (z-skoor: - 1.633) (joonis 1A, B). Sarnaselt kanoonilise raja analüüsiga ennustas RNA-seq andmete ülesvoolu analüüs, et floretiin vähendas peamiste põletikueelsete transkriptsiooniregulaatorite, nagu IRF7 (z-skoor: 2,229), IRF1 (z-skoor: -2), aktiveerimist. 025)ja STAT1(z-skoor:-2.022)(joonis 1D). Lisaks makrofaagide põletikueelsete radade allareguleerimisele näitas floretiiniga töödeldud makrofaagide RNA-seq analüüs, et lisaks muudele radadele aktiveeris floretiin tugevalt ka Nrf2 rada (z-skoor: 1,897), mida tõendab seotud Nrf{35}} ülesreguleerimine. geenid nagu mafG ja proxy (joonis 1A, C). Veelgi enam, Nrf2(NFE2L2) tuvastati kui enim aktiveeritud ülesvoolu transkriptsiooniregulaator (z-skoor: 2,801) ja ROS-i taseme reguleerimine tuvastati kui üks enim reguleeritud bioloogilisi funktsioone floretiiniga töödeldud BMDM-ides (z-skoor: 2,008). )(Joonis 1D, E). Kokkuvõttes näitavad leiud, et floretiin aktiveerib Nrf2 ja pärsib makrofaagide põletikulist fenotüüpi.

Nrf2 rada kontrollib floretiiniga töödeldud makrofaagide fenotüüpi

Järgmisena kinnitasime floretiini põletikuvastase toime ja tegime kindlaks, kas see moduleerib makrofaagide põletikulist fenotüüpi, toimides Nrf2-le. PMA-ga stimuleeritud floretiiniga töödeldud WT BMDM-ide puhul täheldati ROS-i taseme langust (joonis 2A). Lisaks täheldati LPS-iga stimuleeritud floretiiniga töödeldud WT BMDM-ide korral põletikueelsete geenide NOS2, I-6, COX2 ja I-12 vähenenud NO tootmist ja mRNA taset (joonis 2B, C). Seoses Nrf2 olulise rolliga vähem põletikulise fenotüübi esilekutsumisel näitavad meie andmed, et floretiin aktiveerib WT-s Nrf{13}}reaktsioonigeene HO1 ja NQO1, kuid mitte LPS-iga stimuleeritud Nrf2 KO BMDM-e (joonis 2D). Lisaks vähendas floretiiniravi ROS-i tootmist WT-s, kuid mitte Nrf2 KO BMDM-is (joonis 2E). Lisaks antioksüdatiivsete reaktsioonide kontrollimisele pärsib Nrf2 teadaolevalt makrofaagide põletikulist fenotüüpi [12]. Viimase toetuseks ei suutnud floretiin vähendada põletikueelsete geenide NOS2, IL-6, COX2 ekspressiooni. ja IL-12 aktiveeritud Nrf2-puudulike BMDM-de korral (joonis 2F). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et Nrf2 juhib makrofaagide floretiini poolt vahendatud põletikulist fenotüübi nihet.

Floretiin soodustab AMPK aktiveerimist

Floretiin on täpselt määratletud GLUT-i inhibiitor ja hiljutised uuringud rõhutavad GLUT-vahendatud glükoosi omastamise tähtsust makrofaagide aktiveerimisel [26,32]. Seega tegime kindlaks, kas floretiin võib aktiveerida energiaanduri AMPK, mis aktiveeritakse madala energia / glükoositaseme korral. Meie tulemused näitavad, et ravi floretiiniga viib AMPK fosforüülimiseni ja aktiveerimiseni (joonis 3A, B). Lisaks takistab AMPK inhibiitori BML-275 lisamine suures osas AMPK aktivatsiooni floretiiniga töödeldud BMDM-ides (joonis 3A, B). Veelgi enam, meie leiud näitavad, et AMPK aktiveerimine on floretiini jaoks ROS-i tootmise pärssimiseks hädavajalik, nagu näitab kõrgem ROS-i tase nii floretiini kui ka AMPK inhibiitoriga ravitud BMDM-des võrreldes ainult floretiiniga ravitud BMDM-dega (joonis 3C). Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et floretiini poolt indutseeritud AMPK aktiveerimine on ülioluline makrofaagide suunamisel vähem põletikulise fenotüübi poole.

Floretiin stimuleerib autofagiat AMPK-st sõltuval viisil

Kuna AMPK aktiveerimine on seotud kataboolsete protsesside aktiveerimisega vastuseks toitainete puudusele [33], uurisime järgmisena, kas floretiin võib aktiveerida autofagiat. Autofagia on konserveerunud kataboolne protsess, mis indutseeritakse nälgimisel ja muudel stressireaktsioonidel, mis soodustab rakusisese lasti lüsosomaalset lagunemist, mis on eraldatud vesiikulitesse, mida nimetatakse autofagosoomideks. RNA-seq analüüs ennustas autofagiat kui ühte allavoolu bioloogilist protsessi, mis näitas floretiiniga töödeldud BMDM-ide aktiivsuse suurenemist (z-skoor: 0.779) (joonis 4A). Veelgi enam, floretiini ja autofagia inhibiitori bafilomütsiin Al-ga töödeldud BMDM-ide immunotsütokeemiline analüüs näitas autofagia markerite MAP1LC3/LC3 (mikrotuubulitega seotud valgu 1 kerge ahel 3) ja p62 suurenenud akumuleerumist võrreldes bafilomütsiin A{14}}-ga töödeldud BMDM-ga 4B-D), mis näitab suurenenud autofagilist voogu pärast ravi floretiiniga [34]. Autofagia indutseerimisel muundatakse LC3 LC3I vormist lipiiditud LC3I vormiks, mis korreleerub autofagosoomide arvuga. Kooskõlas sellega määrati Western blot meetodil floretiin-stimuleeritud BMDM-ides LC3II ja p62 kõrgemad valgutasemed (joonis 4E, F). Huvitav on see, et seda p62 ja LC3II suurenemist floretiini poolt hoiti ära BMDM-ide ravimisel AMPK inhibiitoriga BML-275 (joonis 4E-F). Meie andmed näitavad kollektiivselt, et floretiin stimuleerib autofagiat AMPK-st sõltuval viisil.

Floretiin aktiveerib Nrf2 raja autofagia poolt vahendatud Keap1 lagunemise kaudu

Meie andmed näitavad, et floretiin aktiveerib Nrf2 ja stimuleerib makrofaagides autofagiat. Huvitav on see, et autofagia retseptor p62 võib konkureerida Nrf2-ga seondumise eest Keapliga, adapteriga, mis hõlbustab Nrf2 ubikvitineerimist ja lagunemist normaalsetes tingimustes. See Keap1/Nrf2 p62-vahendatud dissotsiatsioon takistab seega Nrf2 lagunemist ja viib lõpuks Nrf2 aktiveerumiseni [35]. Sel põhjusel tegime kindlaks, kas floretiin soodustab p62 / Keapli interaktsiooni, aktiveerides seeläbi Nrf2 rada. Siin näitame, et floretiin aktiveerib Nrf2 raja p62-vahendatud Keapli lagunemise kaudu makrofaagides. Kasutades kõrge eraldusvõimega Airyscani kon-fokaalset mikroskoopiat koos kolokalisatsioonianalüüsiga, näitame, et floretiin stimuleerib p62 ja Keapl interaktsiooni, mida näitab kolokalisatsiooniparameetri (Pearsoni koefitsient) suurem väärtus floretiiniga töödeldud BMDM-ides (joonis 5A). , B). Veelgi enam, meie leiud näitavad, et floretiiniga töödeldud BMDM-ides on Keapli valgu tase madalam, mis kinnitab Keapli lagunemist (joonis 5C). Kinnitamaks, et lagunemine on autofagiast sõltuv, lisasime floretiiniga töödeldud ainele autofagia inhibiitori bafilomütsiini A1. BMDM-id. Huvitav on see, et see Keapli vähenemine pöördus bafilomütsiin Al-raviga (joonis 5C). Neid tulemusi kinnitas Western blot, mis näitas Keapl valgu taseme langust floretiiniga töödeldud BMDM-des, mida bafilomütsiin A1 takistas (joonis 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretiin vähendas haiguse tõsidust (joonis 6B). Haiguse raskuse vähenemine floretiiniga ravitud loomadel oli paralleelne põletikuliste geenide MHCI ekspressiooni vähenemisega,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 ja CXCL2 seljaajus (joonis 6C). Veelgi enam, floretiiniga töödeldud loomade seljaajus leiti F4/80t-rakkude vähenemine (joonis 6E, F). Kuna nii F4/80*mikroglia kui ka F4/80* makrofaagid soodustavad neuropõletikku, näitas põhjalikum analüüs, et floretiin vähendas märkimisväärselt F480 pluss TMEMl kogust.{17}}

makrofaagid EAE hiirtel (täiendav joonis 2 DF), samas kui täheldati mitteolulist suundumust F480 pluss TMEMl19 pluss mikroglia vähenemise suunas. Kooskõlas selle leiuga pärssis floretiin põletikuliste vahendajate tootmist mikrogliias, kuid see supressioon oli makrofaagidega võrreldes vähem väljendunud (täiendav joonis 2 AC). Need leiud viitavad sellele, et EAE paranemine floretiini poolt on peamiselt tingitud makrofaagidest. Lisaks põletikuliste geenide ekspressiooni vähendamisele suurendas floretiin põletikuvastaste ja neurotroofsete tegurite, st IL-4, CNTF ja IGF-1 ekspressiooni EAE loomade seljaajus (joonis 6D). ). Need leiud viitavad tugevalt sellele, et floretiin vähendab EAE haiguse tõsidust, suunates makrofaagid haigust lahendava fenotüübi poole. Kooskõlas meie varasemate in vitro leidudega tuvastasime ka floretiiniga töödeldud EAE loomade kesknärvisüsteemis suurenenud Nrf2 signaaliülekande, mida näitab Nrf2 ja selle allavoolu sihtmärkide NQO1 ja GPX1 suurenenud mRNA ekspressioon (joonis 6G). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et floretiin pärsib neuropõletikku nii profülaktilises kui ka terapeutilises keskkonnas. Lisaks näitavad meie leiud, et floretiin võib vähendada neuropõletikku, pärssides makrofaagide põletikulisi tunnuseid Nrf2 aktiveerimise kaudu.

Arutelu

Selles uuringus demonstreerime, et floretiin juhib makrofaage nrf{1}}sõltuval viisil vähem põletikulise fenotüübi suunas. Leiti, et floretiini poolt Nrf2 aktiveerimise aluseks on AMPK-sõltuv autofagia aktiveerimine ja sellele järgnev Keapli lagunemine. Lisaks kinnitame floretiini põletikuvastast toimet EAE mudelis, kus see vähendab haiguse tõsidust ja leevendab makrofaagidest sõltuvat toimet.neuropõletik.

Näitame, et floretiin pärsib makrofaagide põletikulist fenotüüpi. See on kooskõlas Wei-Tien Changi et al. kes näitasid, et floretiinil on makrofaagide rakuliinis põletikuvastased omadused [36]. Näitame, et selle fenotüübi nihke esilekutsumine sõltub Nrf2-st. Nrf2 on antioksüdatiivsete reaktsioonide peamine regulaator ja selle aktiveerimine suunab makrofaage põletikuvastase fenotüübi suunas [1l, 12, 37]. Lisaks on mitmed uuringud määratlenud, et Nrf2 aktiveerimine nõrgendab kesknärvisüsteemi häirete korral neuropõletikku ja neurodegeneratsiooni [{{10] }}]. Kuigi meie leiud näitavad, et Nrf2 on floretiiniga töödeldud makrofaagide fenotüübi nihke aluseks, näitasid RNA sekveneerimise andmed, et Nrf2 aktiveerimise hulgas olid ka muud teed ülesreguleeritud. Eelkõige pakub huvi PPAR-raja ülesreguleerimine selle põletikuvastaste omaduste ja ristkõnede tõttu Nrf2-ga [41-45]. Lisaks, kuna floretiin on täpselt määratletud GLUT inhibiitor ja üleminek glükolüüsile on makrofaagide aktiveerimise jaoks ülioluline metaboolne sündmus, võib fenotüübi muutusi osaliselt esile kutsuda ka floretiini otsene metaboolne toime nendele glükoosi transporteritele [46, 47]. Rohkem uuringuid on vaja, et määratleda PPAR olulisus floretiini poolt indutseeritud Nrf2 aktivatsioonis ja mil määral mõjutavad floretiini poolt indutseeritud immunomodulatsiooni otsesed metaboolsed muutused. Üldiselt näitavad meie leiud selgelt, et Nrf2 aktiveerimine mängib olulist rolli floretiini vahendatud fenotüübi lülitus.

Meie leiud näitavad, et Nrf2 aktiveerimist floretiini poolt vahendab AMPK aktiveerimine. AMPK mängib olulist rolli raku energia homöostaasi taastamisel pingete korral, mis kahandavad ATP-d, mille tulemuseks on suurenenud ADP: ATP suhe, lülitades seeläbi sisse alternatiivsed kataboolsed teed, mis genereerivad ATP-d, lülitades samal ajal välja ATP-d tarbivad anaboolsed teed [48]. Vastavalt sellele on floretiin väljakujunenud GLUT-i inhibiitor ja alandab rakkude glükoosisisaldust [49-51]. Mitmed uuringud näitasid, et AMPK aktiveerimine makrofaagides kutsub esile immunosupressiivse fenotüübi, mis kinnitab meie tulemusi, mis näitavad, et AMPK aktiveerimine on floretiini jaoks põletiku vähendamiseks hädavajalik [52, 53]. Meie andmed on kooskõlas ka varasemate uuringutega, milles on näidatud, et floretiin aktiveerib AMPK-d teistes rakutüüpides, sealhulgas adipotsüütides ja endoteelirakkudes [50, 54-56]. Floretiin võib aktiveerida AMPK kaudselt, suurendades AMP ja alandades ATP taset, kuna AMP ja ATP stimuleerivad või pärsivad vastavalt AMPK aktivatsiooni allosteeriliselt [48, 57]. Sellegipoolest võib CaMKK, mis on AMPK-st ülesvoolu asuv kinaas, soodustada AMPK aktivatsiooni vastusena suurenenud raku Ca2 plusstasemetele ilma AMP/ATP taseme muutusteta [58]. Lisaks, arvestades AMPK ja üles- ja allavoolu radade vastastikuse mõju laia võrgustikku, on vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada välja floretiini poolt indutseeritud AMPK aktiveerimise mehhanism.

Meie andmed viitavad sellele, et floretiini vahendatud AMPK aktiveerimine stimuleerib makrofaagides autofagiat. Nagu eespool mainitud, on AMPK aktiveerimine enesekaitseprotsess, mille eesmärk on taastada raku energiabilanss [48]. Kuigi ükski uuring pole kunagi näidanud, et floretiin oleks võimeline stimuleerima makrofaagide fenotüüpi autofaagiat soodustades, on mõned uuringud siiski näidanud floretiini mõju autofagia radadele vähirakkudes ja hepatotsüütides [59-61]. Lisaks näitavad mitmed uuringud, et AMPK aktiveerimise allavoolu kataboolsed protsessid võivad aktiveerida autofagiat [60, 62, 63]. Huvitav on see, et vastusena glükoosinälgimisele indutseerib AMPK-vahendatud autofagia olulise autofagia initsiaatori unc-51 fosforüülimisega, nagu autofagiat aktiveeriv kinaasi [64,65]. Sellega seoses oletame, et AMPK stimuleerib autofagiat, et taastada rakukomponentidest ATP vastuseks floretiinist põhjustatud glükoosisisalduse vähenemisele. Glükoosinälg võib aga aktiveerida autofagiat ka AMPK-st sõltumatul viisil [66-68]. Seetõttu on vaja rohkem uuringuid, et teha kindlaks, kas autofagia aktiveerimine floretiini poolt toimub ka osaliselt AMPK-st sõltumatult.

Hiljutised uuringud näitasid autofagia tähtsust funktsionaalse makrofaagi fenotüübi juhtimisel. Selles kontekstis on autofagia düsregulatsioon makrofaagides märkimisväärselt seotud ateroskleroosi ja neuroloogiliste haiguste tekkega [69-72]. Siin pakume seost floretiinravi, autofagia induktsiooni ja Nrf2 aktiveerimise vahel, näidates, et floretiin soodustab Nrf2 aktivatsiooni Keap1 p62-vahendatud lagunemise kaudu. Kuni viimase ajani peeti p62 puncta suurenemist autofagia vähenemise märgiks, kuna p62 laguneb autofagosoomides autofagia aktiveerimisel [34]. Seoses sellega on p62 akumuleerumine seotud autofagia düsfunktsiooniga aterosklerootiliste kahjustuste korral [73]. Kuid see arusaam on viimastel aastatel vaidlustatud ja nüüd arvatakse, et p62 on autofagosoomide moodustamiseks vajalik ja et p62 taseme tõus paralleelselt LC3Il puncta suurenemisega võib olla märk autofagia esilekutsumisest [74]. Seetõttu näitavad meie tulemused koos floretiini võimega aktiveerida AMPK-d ja selle teadaolevat rolli autofagia aktiveerimisel, et P62 ja LC3 akumuleerumine bafilomütsiin A1-ga ravimisel floretiin-stimuleeritud makrofaagides on tingitud suurenenud autofaagilisest voost, mitte kahjustatud autofagia. Huvitav on see, et Lee Y et al. näitas hiljuti, et lisaks Nrf2 aktiveerimisele on p62 seondumine Keapliga seotud ka autofagosoomide moodustumisega, mis viitab sellele, et floretiini poolt vahendatud autofagia aktiveerimine on ühelt poolt otseselt seotud suurenenud p62 aktiivsusega, aga teiselt poolt ka suurema Keapl-p62 interaktsiooniga. 75]. Keapl on Cullin-3-põhise ubikvitiini ligaasi adapter, mis moodustab homöostaatilistes tingimustes homodimeeri koos Nrf2-ga, soodustades seeläbi Nrf2 ubikvitinatsiooni ja proteasoomide lagunemist [76]. Keapl-Nrf2 kompleksi katkestamine viib Nrf2 stabiliseerumiseni ja translokatsioonini tuuma [77, 78]. On hästi dokumenteeritud, et selle kompleksi katkemine toimub kas Keapli tsüsteiinijääkide modifitseerimisel elektrofiilsete molekulide poolt, väikeste molekulide otsesel interaktsioonil Keapliga või p62-vahendatud Keapli lagunemisega [35]. Ying Y jt soovitavad in silico katsete põhjal floretiini ja Keapli otsest koostoimet, mis seejärel viib Nrf2 raja aktiveerumiseni kardiomüotsüütide rakuliinis [79]. Siin lõime täiendava autofagiaga seotud mehhanismi, mille abil floretiin aktiveerib Nrf2.

EAE mudelit kasutades tuvastasime, et floretiin leevendab neuropõletikku in vivo. Meie andmed viitavad kindlalt sellele, et floretiin leevendab EAE-d, pärssides makrofaagide poolt vahendatud põletikulist vastust ja aktiveerides Nrf2 rada. Teistes haigusmudelites avaldas floretiin ka neuroprotektiivseid ja immuunmoduleerivaid omadusi. Eelkõige leiti, et floretiin aktiveerib ajuisheemia korral ajus Nrf2 raja ja vähendab beetaamüloidi akumulatsiooni roti Alzheimeri tõve mudelis [80-84]. Floretiin võib mõjutada ka teisi immuunrakke in vivo, kuna on leitud, et see ühend pärsib T-rakkude ja dendriitrakkude aktivatsiooni in vitro [85, 86]. Arvestades, et EAE mudeli neuropõletik ei sõltu puhtalt makrofaagidest, oleks huvitav määratleda, mil määral vahendavad neuroinflammatsiooni vähenemist teised immuunrakud. Sellega seoses, kuigi meie andmed viitavad sellele, et EAE paranemine on peamiselt makrofaagide poolt juhitud ja see sõltub vähem mikrogliia modulatsioonist, on vaja täiendavaid katseid, et selgitada välja, mil määral mõjutab floretiin neuropõletikuliste haiguste mikrogliat. Üldiselt näitavad meie leiud, et floretiin vähendab neuropõletikku, mõjutades makrofaagide fenotüüpi, näidates floretiini terapeutilist potentsiaali neuroinflammatoorsete häirete korral.

Järeldused

Meie uuring näitab, et floretiin on tugev immunomoduleeriv aine, mis moduleerib makrofaagide põletikulisi omadusi neuroinflammatoorsete häirete korral. Selle fenotüübi nihke juhtimiseks määrati kindlaks Nrf2 raja aktiveerimine, mida vahendab AMPK-sõltuv autofagia aktiveerimine ja sellele järgnev Keapli lagunemine. Seega on floretiin paljulubav looduslikult esinev aine, mida saab kasutada neuropõletikuliste haiguste, nagu MS, põletikulise koormuse vähendamiseks.

Viited

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY jt. Dihüdromürtsetiin parandab vahurakkude moodustumist LXRalpha-ABCA1/ABCG1-sõltuva kolesterooli väljavoolu kaudu makrofaagides. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q jt. Antotsüaniinid kutsuvad esile kolesterooli väljavoolu hiire kõhukelme makrofaagidest: peroksisoomi proliferaatori poolt aktiveeritud retseptori {gamma}-maksa X-retseptori {alfa}-ABCA1 raja roll. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.{11}}/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Kvertsetiin suurendab ABCA1 ekspressiooni ja kolesterooli väljavoolu ap38-sõltuva raja kaudu makrofaagides. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Vahuliste fagotsüütide füsioloogia hulgiskleroosi korral. Acta Neuropathol Commun. 2018; 6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Makrofaagide alamhulgad ja mikrogliia hulgiskleroosi korral. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Sclerosis multiplex: mehhanismid ja immunoteraapia. Neuron. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S jt. Stearoüül-CoA desaturaas-1 kahjustab aju makrofaagide ja mikrogliia reparatiivseid omadusi. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Müeliini fagotsütoosivad makrofaagid moduleerivad autoreaktiivset T-rakkude proliferatsiooni. J Neuropõletik. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA jt. Müeliinist pärinevad lipiidid moduleerivad makrofaagide aktiivsust maksa X-retseptori aktiveerimise kaudu. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T jt. Müeliin muudab PPAR-e aktiveerides makrofaagide põletikulist fenotüüpi. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.