Dieedi kakao flavanoolid suurendavad mitokondriaalset funktsiooni skeletilihastes ja muudavad tervetel hiirtel kogu keha ainevahetust
Mar 14, 2022
lisateabe saamiseks võtke ühendust:tina.xiang@wecistanche.com
Abstraktne: Mitokondriaalset düsfunktsiooni on laialdaselt kirjeldatud mitmesuguste haiguste puhul ja see aitab kaasa nende patogeneesile. Hindasime selle mõjukakao flavanoolidmitokondriaalse funktsiooni ja kogu ainevahetuse täiendamine ning uurisime, kas mitokondriaalne deatsetülaas sirtuiin -3 (Sirt3) on seotud või mitte. Uurisime 15-päevase CF-i lisamise mõju metsiktüüpi ja Sirt3-/hiirtele. Kogu keha ainevahetust hinnati kaudse kalorimeetria abil ja selle hindamiseks viidi läbi suukaudse glükoositaluvuse test.glükoosi metabolism. Mitokondriaalset hingamisfunktsiooni hinnati permeabiliseeritud kiududes ja püridiini nukleotiidide sisaldus (NAD pluss ja NADH) kvantifitseeriti. Metsiktüübi puhul muutis CF lisamine märkimisväärselt kogu keha ainevahetust, soodustades süsivesikute kasutamist ja parandades glükoositaluvust. CF-i lisamine kutsus esile mitokondriaalse massi olulise suurenemise, samas kui H2O2 tootmise ja raku oksüdatiivse stressi säilitamiseks toimus oluline kvalitatiivne kohanemine. CF-i lisamine kutsus esile NAD pluss ja NADH sisalduse olulise suurenemise. Kõik ülalmainitud mõjud olid Sirt3-7hiirtel nüristunud. Kollektiivselt suurendas CF-i lisamine NAD-i metabolismi, mis stimuleerib sirtuiinide ainevahetust ja parandas mitokondriaalset funktsiooni, mis tõenäoliselt aitas kaasa täheldatud kogu keha ainevahetuse kohanemisele, suurendades süsivesikute kasutamist, vähemalt osaliselt Sirt3 kaudu.
Märksõnad: kakao flavanoolid; NAD metabolism; mitokondriaalne mass; glükoosi metabolism; skeletilihased
1. Sissejuhatus
Mitokondrid on subtsellulaarsed organellid, mis osalevad mitmetes rakufunktsioonides, nagu energia ülekandmine mitokondriaalse oksüdatiivse fosforüülimise kaudu ja mitokondriaalses vesinikperoksiidi tootmises või mitokondriaalses rakusurma aktiveerimises [1-3]. Uued tõendid näitavad, et mitokondriaalne düsfunktsioon on seotud paljude patoloogiatega ja mängib nende patogeneesis keskset rolli [4]. Meie rühm teatas mitokondriaalsest kahjustusest I tüüpi diabeediga patsientidel juba ammu enne kliinilisi tüsistusi [5]. Veelgi enam, mitokondriaalne oksüdatsioonivõime väheneb vananedes isegi tervetel inimestel [6]. Seetõttu on nende düsfunktsioonide leevendamise või mitokondriaalse massi suurendamise strateegiate kindlaksmääramine võimalused paljude häirete esinemissageduse ennetamiseks või vähemalt vähendamiseks või tervete isikute aeroobse võimekuse suurendamiseks.
Selles kontekstis pakub huvi selliste ohutute ja looduslike ühendite tuvastamine, mis suurendavad mitokondriaalset funktsiooni ja kogu keha ainevahetust koos piiratud kõrvaltoimetega või ilma. Looduslike ühendite hulgaskakao flavanoolid(CF) peetakse paljutõotavateks molekulideks, kuna on näidatud, et nende tarbimine mõjutab positiivselt südame-veresoonkonna tervist, insuliiniresistentsust või immuunfunktsiooni [7]. Tõepoolest, CF parandas glükoosi metabolismi ja CF lühiajalisele manustamisele järgneb insuliinitundlikkuse suurenemine isegi glükoositalumatusega hüpertensiivsetel patsientidel [8, 9].
Flavanoolidest on (-)-epikatehiin (EPI) CF-s kõige sagedamini leitud monomeer ning EPI-d peetakse CF-i peamiseks biosaadavaks ja bioaktiivseks molekuliks [10]. Järjekindlad tõendid näitavad, et EPI lisamine parandab mitokondriaalset funktsiooni ja/või skeletilihaste sisaldust [11]. EPI lisamine stimuleerib mitut rada, mis lähenevad peroksisoomi proliferaatori poolt aktiveeritud retseptori gamma koaktivaatorile 1-alfa(PGCl) ja peamistele tuuma transkriptsioonikompleksidele. EPI suurendab otseselt lämmastikoksiidi teket, mis stimuleerib mitokondriaalset biogeneesi [11]. Samal ajal stimuleerivad sirtuiinid 1 ja 3 ka EPI lisamisega [11]. Proantotsüanidiinide kasutamine, oligomeerneflavonoididOn näidatud, et need, mis sisaldavad EPI-d, suurendavad rakusisese nikotiinamiidadeniini dinukleotiidi (NAD pluss) taset, suurendades NAD-biosünteesi eelkäijaid ja suurendades sirtuiini-1 mRNA taset roti maksas [12]. Sirtuiini perekond (Sirt), NAD-sõltuv deatsetülaas, koosneb seitsmest liikmest, mis erinevad oma rakusisese jaotuse, substraadi spetsiifilisuse ja rakuliste funktsioonide poolest [13]. Sirt1, selle perekonna põhjalikult uuritud liige, stimuleerib mitokondriaalset biogeneesi, soodustades PGCl deatsetüülimist, suurendades seeläbi selle transkriptsioonilist aktiivsust [14]. Sirte, peamine metaboolne andur, stimuleeriti pärast EPI manustamist [12, 15-17]. Siiski ei ole EPI mõju teistele sirtuiinidele uuritud. EPI efekti hindamine on eriti huvitav mitokondrites asuvate sirtuiinide puhul (Sirt3, Sirt 4 ja Sirt5), mis teadaolevalt moduleerivad Krebsi tsükli ja hingamisahela ensüümide aktiivsust [18]. Sirt3, mis ekspresseerub kõrgelt kõrge metaboolse ringluse ja mitokondriaalse sisaldusega kudedes, pakub erilist huvi seoses oma kriitilise rolliga normaalse mitokondriaalse funktsiooni säilitamisel pöörduva valgu lüsiini deatsetüülimise kaudu [19-21]Peale selle mängib Sirt3 olulist rolli kogu keha ainevahetuse reguleerimine [20. Näidati, et Sirt3 on muutunud 1. ja 2. tüüpi diabeedi ja südame-veresoonkonna haiguste mudelite skeletilihastes [22, 23]. Lisaks tehti ettepanek, et Sirt3 aktiveerimine võib olla paljulubav terapeutiline strateegia mitokondriaalse funktsiooni ja metabolismi parandamiseks [23, 24]. Seetõttu pakub huvi kindlaks teha, kas Sirt3 on osa CF-i lisamise kasulikest mõjudest kogu keha ainevahetusele ja mitokondriaalsele funktsioonile.
Selles uuringus kasutasime integreerivat lähenemisviisi, et uurida hiirtel 15-päevase CF-lisandi mõju. Me oletasime, et CF lisamine: (i) muudab kogu keha ainevahetust jaglükoosi metabolism, (ii) suurendab mitokondriaalset funktsiooni oksüdatiivses ja glükolüütilises lihases permeabiliseeritud kiududes ja (ii) suurendab NAD metabolismi. Samuti uurisime Sirt3 oletatavat osalust CF-indutseeritud mitokondriaalses biogeneesis ja kogu keha ainevahetuses. Meie hüpoteesid olid, et CF mõju kogu keha ainevahetusele ja mitokondriaalsele massile on Sirt{4}}hiirtel nüri.
2. Meetodid
2.1. Loomad ja toitumine
Selle uuringu jaoks osteti ettevõttest Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) 129S1/SvlmJ 10-nädalased isased hiired. Et teha kindlaks, kas sirtuiinid on seotud CF-i manustamisest tingitud mitokondriaalse massi ja funktsioonide kohanemisega, kasutasime ka 10-nädala vanu Sirt3 kogu keha knock-out isaseid hiiri samal tüvega kui metsiktüüpi [25]. Sirt3 / hiiri kasutati Sirt3 osalemise uurimiseks CF-indutseeritud mitokondriaalses biogeneesis ja kogu keha metabolismi kohanemises. Hiiri hoiti ruumis reguleeritud temperatuuril 23-25 kraadi ja kontrollitud valgustusega (12-h valguse ja pimeduse tsüklid). Loomadel oli ad libitum juurdepääs näriliste toidule ja kraaniveele.
Pärast vähemalt nädalast harjumust loomarajatistes said katseloomad suukaudse sondiga CF-i lisandina looduslikku ekstrakti (302,1 mg/kg kehamassi kohta kaks korda päevas 15 päeva jooksul), mis oli resuspendeeritud karboksümetüültselluloosis (Sigma-Aldrich, St. Louis). , Mo, USA). Kakaopulbri koostist on kirjeldatud tabelis 1 ja see on saadud ettevõttest Naturex (Quart de Poblet, Hispaania). Koostis on kindlaks tehtud kõrgfektiivse vedelikkromatograafia meetodil ja 100 mg ekstrakti vastab keskmiselt 475 mg kuivadele kakaoseemnetele. Kontrollhiired said suukaudse sondiga vehiiklit, mis koosnes sarnase teobromiini ja kofeiini sisaldusega, mis oli lahustatud karboksümetüültselluloosis. Päevane annus määrati vastavalt tööstusharu juhistele, mis teisendab inimese doosi kehapindala alusel loomade ekvivalentdoosiks, ja me korrutasime inimese doosi 12,3-ga [26]. Suusondi tegi kogenud tehnik.
2.2. Kudede kogumine1
Kakskümmend neli tundi pärast viimast suukaudset sondimist tuimastati tühja kõhuga loomad, kasutades ketamiini ja ksülasiini (vastavalt: 100 ja 10 mg/kg). Kudede kogumine viidi läbi kohe pärast anesteesia saavutamist. Gastrocnemius'e tald ja valge osa lõigati välja. Proovid külmutati kohe vedelas lämmastikus ja säilitati järgnevaks analüüsiks temperatuuril -80 või kasutati nülitud lihaskiudude ettevalmistamiseks.
2.3. Ainevahetuse ja kehalise aktiivsuse hindamine
Kaudset kalorimeetriat ja spontaanset füüsilist aktiivsust mõõdeti Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA) abil. Hiiri hoiti eraldi kambrites 28 kraadi juures, valgusega 07 h00 kuni 19 h00 ja ad libitum juurdepääs näriliste toidule ja kraaniveele. Hiired aklimatiseeriti metaboolsete puuridega kolm päeva enne andmete kogumise esimest päeva. Andmete kogumine viidi läbi viieteistkümnendal täiendamise päeval. Hapnikutarbimist (VO2), süsinikdioksiidi tootmist (VCO2) ja hingamisteede vahetussuhet (RER) mõõdeti õhuvooluga 0,5 l/min ja prooviõhuga 0,4 l/ min. RER-i suhtelise kumulatiivse sageduse protsent (PCRF) määrati 24-h perioodi jooksul, nagu on eelnevalt kirjeldanud Riachi et al. (2004). Lühidalt, PCRF määrati iga andmepunkti sageduse lisamisega eelmisele juurdekasvu jadale (0,65-lt 1,20-le juurdekasvuga 0,01)[27]. Metaboolne paindlikkus määrati kindlaks Hilli tõusu (H väärtus) ja PRCF kõvera 50. protsentiili (EC50) ning RER amplituudi mõõtmisega 24 tunni jooksul (Riachi et al. 2004). Üldist füüsilist aktiivsust jälgiti infrapunakiirega juhitava andurisüsteemi abil, mis tuvastas x- ja z-telje aktiivsust. Hinnati nii üldloendeid (iga kord, kui kiir puruneb) kui ka ambulatoorseid loendusi (iga kord, kui uus kiir puruneb). X-total (X-TOT) loendus registreeritakse, kui loom liigub horisontaalselt rohkem kui 0,5 tolli ja see esindab väikesemahulisi korduvaid tegevusi, nagu kriimustamine ja hooldamine. X-ambulatoorne loendus (X-AMB) mõõdab tegelikku liikumist, registreerides loenduse ainult siis, kui loom katkestab uue kiire. Z-summa (Z-TOT) arv registreeritakse, kui toimub 1,5 tolli vertikaalne liikumine, st kasvatamine (Abreu-Vieira 2016). Süsivesikute ja rasvade hindamiseksoksüdatsioonVO2-st ja VCO2-st kasutasime Péronnet'i ja Massicotte'i valguvaba hingamisteede jagatise tabelit, mida varem kasutati hiirtel [28, 29].
2.4. Kogu keha ja rasva mass
Kogu rasvamass ja kogu lahja mass määrati tuimastamata hiirtel kvantitatiivse resonantsi interferentsi analüüsiga, kasutades EchoMRI kogu keha magnetresonantsanalüsaatorit (Echo Medical System, Houston, TX, USA). Rasva kogumass esindas kogu kehas leiduva rasva summat. Kogu lahja mass hõlmas peamiselt lihaseid ja siseorganeid. Skeletilihaste mass moodustab teadaolevalt suurima osa kogu lahja massist.
2.5. Suukaudne glükoositaluvuse test (OGTT)
Glükeemiat mõõdeti sabast glükomeetriga kogutud veretilgaga (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT viidi läbi hiirtel, kes olid tühjad 5 kuni 6 tundi. Mõõtmine viidi läbi CF-i lisamise viimasel päeval. Pärast basaalglükeemia (aeg O) mõõtmist süstiti hiirtele suukaudselt 20% glükoosi lahust steriilses vees annuses 1,5 g glükoosi · kg kehamassi kohta -1. Glükeemiat mõõdeti 15, 30, 60, 90 ja 120 minutit pärast glükoosilahuse süstimist. Seejärel arvutati glükoositaluvuse mõõduna glükoosikõvera kasvav pindala.
2.6.qRT-PCR analüüs
The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA sünteesiti kogu RNA-st (2 μL), kasutades iScripti pöördtranskriptsiooni supermiksi RT-qPCR jaoks (Biorad, Hercules, CA, USA). Kogu RT-tooteid analüüsiti kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil, kasutades 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-d vastavalt tootja spetsifikatsioonidele (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Jalgrattasõit saavutati CFX96 tsikliga (Biorad, Hercules, California; tingimused: 95 kraadi C 10 minutit ja 40 tsüklit 95 kraadi 30 sekundit, 55 kraadi 45 sekundit ja 72 kraadi 45 sekundit). Iga katse lõpus kinnitati sulamiskõvera abil praimer-dimeeri moodustumise puudumine ja ainulaadse amplikoni olemasolu. Lävitsükli (Ct) väärtusi kasutati qPCR andmete analüüsimiseks 2-A△Ct meetodil, kus majapidamisgeenina oli kas ß-Actin või HPRT1【30】. Kvantitatiivsed RT-PCR väärtused olid seotud kontrollrühma väärtustega, mis määrati väärtusele 1.
2.7. Ensüümi aktiivsus
Elektronide transpordiahela komplekside ja tsitraadi süntaasi spetsiifilise aktiivsuse mõõtmine viidi läbi spektrofotomeetriliselt, nagu eelnevalt kirjeldatud [31]. Pulveriseeritud külmutatud valged gastrocnemius lihased (~30 mg) homogeniseeriti vibreeriva mikrohelmeste homogenisaatoriga 500 uL homogeniseerimispuhvris (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA ja 5 mg·mL-I BSA , pH 7,4), millele järgnes 500 µl hüpotoonilise söötme (25 mM kaaliumfosfaat ja 5 mM MgCl, pH 7,2) lisamine. Seejärel viidi proovid läbi kolm külmutus-sulatustsüklit vedelas lämmastikus. Proove tsentrifuugiti 10 minutit 600 x g juures 4 kraadi juures ja supernatanti hoiti kuni analüüsimiseni jääl. Valgusisaldus määrati supernatandis kolmes eksemplaris, kasutades Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Tsitraadi süntaasi (CS) aktiivsus määrati spektrofotomeetriliselt 412 nm juures pärast 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobensoehappe) redutseerimist 0,1 mM atsetüüli juuresolekul. -CoA ja 12 mM oksaloäädikhapet 200 mM Tris puhvris (pH 7,4). Rotenoonitundlik NADH-detsülubikinoonoksidoreduktaasi (I kompleksi) test viidi läbi lainepikkusel 340 nm, kasutades aktseptor 2,3-dimetoksü-5-metüül-6-n-detsüül-14-bensokinooni. 80 μM) ja NADH elektronidoonorina (200 μM) 10 mM Tris puhvris (pH 8,0). Rotenoonitundliku aktiivsuse kvantifitseerimiseks kasutati 4 μM rotenooni lisamist. Tsütokroomoksüdaasi (kompleks IV) aktiivsus viidi läbi 550 nm juures, kasutades doonoriks 10 μM redutseeritud tsütokroom c ja 2,5 mM n-dodetsüül-ß-maltosiidi, et muuta mitokondri membraanid läbilaskvaks 100 mM kaaliumpuhvris.0pH (0pH).
Kõik ensüümianalüüsid määrati kolmes korduses ja tulemused olid seotud kontrollrühma tulemustega, mille väärtus oli 100.
2.8. Mitokondriaalne hindamine
Mitokondriaalset hingamist ja mitokondriaalset H2O2 tootmist uuriti in situ saponiiniga läbilaskvates kiududes, kasutades valgeid gastrocnemius ja tallalihaseid|1]. Lühidalt, kiud eraldati binokulaarse mikroskoobi all lahuses A 4 kraadi juures (mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 tauriinid, 0,5 DTT,5{ {50}} K-metaansulfonaadid, 20 imidasooli, 5,7 Na2 ATP ja 15 kreatiinfosfaati, pH 7,1) ja permeabiliseeriti lahuses A 50 ug·mL-Iof saponiiniga 30 minutit 4 kraadi juures. Mitokondriaalne hingamisfunktsioon määrati Clarki tüüpi elektroodiga varustatud oksümeetris (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Kamber täideti 1 ml lahusega B (mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 ui tauriini, 0,5 DTT, 50 K-metaansulfonaate ja 20 imidasooli, pH 7,1) ja pärast registreerimist hapnikusisaldus kambris, pandi kambrisse üks kimp 1-2 mg kuivmassiga permeabiliseeritud müokiude, mis seejärel suleti. Pärast algtaseme näitu lisati järjestikku järgmised lisandid: palmitoüülkarnitiin ja malaat (160 μM∶5 mM), glutamaat (10 mM), suktsinaat (25 mM), rotenoon (1,5 CC μM, uni -A (8 uM) ja N,N',N'-tetrametüül-p-fenüleendiamiindivesinikkloriid ja askorbaat (0,9:9 mM). Pidevalt segades mõõdeti hingamist 23 kraadi juures. Iga katse lõpus eemaldati kiud ettevaatlikult ksülograafilisest rakust, kuivatati ja kuivatati kiu massi määramiseks vähemalt 24 tundi temperatuuril ~ 80 °C. O2 tarbimise määrad (JO2) väljendati nmol O2 min -1.(mg kuivmass)-I. Kõik mõõtmised viidi läbi vähemalt kahes eksemplaris.
H2O2 netoeraldumist hingavate mitokondrite poolt mõõdeti permeabiliseeritud kiukimpudes fluorestsentssondiga Amplex Red (20 μM∶ergastus-emissioon∶563-587 nm), nagu eelnevalt kirjeldatud [32]. Pärast permeabiliseeritud kiudude valmistamist proovid
H2O2 mõõtmiseks mõeldud tooteid loputati kolm korda puhvris Z (mM:110 K-Mes, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3MgCl, 6H2O ja 0,5 mg:mL{ {14}} BSA, pH 7,3 4 kraadi juures). Kiukimpusid ({{20}}.3-1,0 mg kuivmass) inkubeeriti 37 kraadi juures kvartsmikroküvetis pideva magnetsegamisega 600 uL puhvris Z (pH 7,3 temperatuuril 37 °C). millele on lisatud 1,2 U·mL-I mädarõika peroksidaas. Fluorestsentsi algnäidud võeti eksogeensete hingamisteede substraatide puudumisel. Seejärel lisati järjestikku järgmised lisandid: glutamaat (5 mM), suktsinaat (5 mM), rotenoon (0,5 uM), ADP (10 mM) ja antimütsiin-A (8 μM). Iga testi lõpus lisati kiud. eemaldatakse ettevaatlikult küvetist, kuivatatakse ja kuivatatakse kiu massi määramiseks. H2O2 tootmise kiirust väljendati AU·min-1.(mg kuivmass)-I ja oksfossi võimsuse kohta, mis vastas maksimaalsele mitokondriaalsele hingamisele fosforüülimise olekus. Kõik mõõtmised viidi läbi vähemalt kahes eksemplaris.
Mitokondriaalset kaltsiumi retentsioonivõimet (CRC) hinnati valge gastrocnemius'e lihase kummituskiududes, nagu eelnevalt kirjeldatud [33]. Lühidalt, kiude inkubeeriti kvartsmikroküvetis pidevalt segades 600 µl CRC puhvris (mM∶250 sahharoosi, 10 MOPS, 0,005 EGTA ja 10P;-Tris, pH 7,3). Seejärel eksponeeriti kiud ühekordse 20 nM Ca2 plus impulsiga. Ekstramitokondriaalse kaltsiumi kontsentratsiooni muutusi jälgiti fluoromeetriliselt, kasutades Calcium Green 5N (1 mM: ergastus-emissioon: 505-535 nm). Läbilaskvuse ülemineku pooride tundlikkust (PTP) hinnati PTP avamiseks vajaliku aja mõõtmisega ja CRC-d võeti mitokondrite poolt enne selle vabanemist kogunenud Ca2 kogusummaks. Iga katse lõpus eemaldati kiud ettevaatlikult küvetist, kuivatati ja kuivatati kiu massi määramiseks. CRC väärtused väljendati nM Ca2 pluss ühe mg kuivmassi kohta.
2.9. Western blot analüüs
Valgete gastrocnemius- ja tallalihaste valgud lahjendati Laemmli puhvris ja eraldati Mini-PROTEAN TGX plekivabadel 10% monteeritavatel polüakrüülamiidgeelidel (Biorad); igale geelile laaditi sisestandard. Elektroforeetiline eraldamine viidi läbi pingel 200 V 35 minutit migratsioonipuhvris (25 mM TrisBase, 0.2 M glütsiin ja 1% SDS (p/v)). Stain-Free(SF) tehnoloogia sisaldab patenteeritud trihalo ühendit, mis reageerib valkudega, muutes need UV-kiirguse kaudu tuvastatavaks. SF-kuvamine viidi läbi ChemiDoc MP Imageri ja Image Lab4.{45}}.1 tarkvara (Biorad, Hercules, California, USA) abil 5-min pleki aktiveerimisajaga ja seetõttu visualiseeriti valgu kogumustrid. Seejärel kanti valgud 0,2 um nitrotselluloosilehel, kasutades Trans-Blot Turbo Transfer Systemi (Biorad). Ülekande kvaliteeti kontrolliti SF-tehnoloogiat kasutavate pildimembraanidega. Pärast ülekandeetappi derivatiseeriti karbonüülvalgud dinitrofenüülhüdrasiiniga, lahjendades 2N HCl-s, ja lõpuks pesti põhjalikult metanooliga. Membraanid blokeeriti 5% rasvavaba kuiva piimaga Tris-puhverdatud soolalahuses, mis sisaldas Tween-20 (TBST: 15 mM Tris/HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl ja 0,05% Tween{28}}). 1 h toatemperatuuril. Seejärel inkubeeriti membraane 4 kraadi juures üleöö või 2 tundi toatemperatuuril järgmiste primaarsete antikehadega: valgu karbonüül primaarne antikeha (Anti-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) ja SOD2 (#Ab13533, Abcam). Pärast kolme 10-minutilist pesemist TBST-s testiti membraane sekundaarsete antikehadega valgu karbonüüli (HRP-konjugaat; #STA-308, Cell Biolabs) ja SOD2 (küülikuvastane IgG-HRP seotud; #7074, rakusignalisatsioon) jaoks. blokeerimislahuses 2 tundi toatemperatuuril ja lõpuks pesti põhjalikult TBST-ga. Primaarsete ja sekundaarsete antikehade lahjendus optimeeriti iga antikeha jaoks. Kemiluminestsentsi tuvastamine viidi läbi kasutades ECL Clarity (Biorad) ja pildid tehti ChemiDocMP-ga. Kõiki pilte analüüsiti Image Lab 4.0.1 tarkvara abil. Valgu signaali intensiivsuse normaliseerimine viidi läbi pärast vastavate valgu kogutasemete kvantifitseerimist SF-piltidel, proovikontrollil ja sisestandarditel.
2.10. NAD mõõtmine
NAD ja NADH üldtasemeid mõõdeti homogeniseeritud valges gastrocnemius'es, kasutades kaubanduslikku komplekti (#K337-100, Biovision, USA) ja järgides tootja juhiseid. Lühidalt, kogu NAD (NADt= NADt ja NADH) kogum ekstraheeriti. Iga ekstraheeritud proovi puhul kuumutati pool proovi 60 kraadini 30 minutit, et lagundada NADt, hoides NADH puutumata. Nii NADt kui ka NADH proovid segati NAD tsüklilise ensüümiga ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures. NADt ja NADH kvantifitseeriti, võrreldes NADH standardkõveraga ja normaliseerides valgu mg-ni. Lõpuks arvutati NAD pluss (NADt-NADH) ja NADH suhe. Kõik analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris.
2.11. Statistika
Andmed on esitatud kui keskmine ± standardhälve (SD). Andmete normaalsust hinnati D'Agostino-Pearsoni normaalsuse testi abil. Andmete analüüs viidi läbi, kasutades korduvate mõõtmiste jaoks Studenti t-testi ja kahesuunalist ANOVA-d (rühm ja aeg), millele järgnes Bonferroni post hoc test, kasutades Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). I tüüpi vea puhul rakendati kahepoolset taset 5 protsenti.
3. Tulemused
3.1. Keha koostis ja kogu keha ainevahetus
Viieteistkümnepäevane CF lisamine metsiktüüpi (WT) hiirtel ei muutnud kehakaalu (p=0.091), lahja massi (p=0).{24} }73) ja EchoMRI abil hinnatud rasvamass (p=0.89; joonis 1A). O2 tarbimise määrad lahja massi kohta olid pimedas tsüklis oluliselt kõrgemad (8±8 protsenti , p=0.042), samas kui valgustsüklis jäi see sarnaseks (p =0 0,392; joonis 1B). Lokomotoorses aktiivsuses muutusi ei toimunud (andmeid pole näidatud). CF-hiirtel suurenes kogu keha energiakulu märkimisväärselt 15±15 protsenti (p =0.042; joonis 1C) ja toidu tarbimine (0,08 ± 0,01 vs. 0,11 ± 0,01 g lahja kehakaalu kohta, vastavalt CF rühm ja WT, p=0,013, joonis 1D).
CF-i lisamine muutis oluliselt kogu keha ainevahetust: CF-rühmas täheldati kõrgema RER-i peamist mõju 24 tunni jooksul (p=0.023, joonis 2A) ja keskmine RER 12 tunni jooksul oli suurem. CF rühmas valguse ja pimeduse tsüklites (pluss 5±3 protsenti ,p=0.0vastavalt 35 ja pluss 9±4 protsenti, p=0.026). Lisaks soodustas CF lisamine süsivesikute (CHO) kasutamist (51 ± 13 protsenti energiatarbimisest sõltus CHO oksüdatsioonist CF rühmas vs. 37 ± 12 protsenti kontrollrühmas valgustsükli ajal, p=0.108 ja 71 ± 21 protsenti CF rühmas vs. 47 ± 24 protsenti kontrollrühmas pimeda tsükli ajal, p=0,004; joonis 2B.). Kuid kJ-des väljendatuna ei olnud erinevusi CHO oksüdatsiooni ega rasvhapete oksüdatsiooni osas (CHO oksüdatsioon: 3,7±1,4 kcal·d-1 kontrollrühmas vs. 4,4±1,7 kcal.lahja kehamass-1. d-1 CF-s,p=0.33 ja rasvhapete oksüdatsioon: 2,3±1,0 kcal·d-Iin kontroll vs.2,6±0,87 kcal.lahja kehamass-1.d{{ 50}}CF-is, p=0.608). RER-i PRCF-i analüüs näitas CF-i rühmas EC50 väärtuste suurenemist (p=0,009; joonis 2D), mis tähendab, et CF kutsub esile nihke süsivesikute suurema kasutamise suunas. Hilli kalde langust täheldati CF rühmas (H väärtused: 25,16±4,44 kontrollides vs.12,79±3,96 CF rühmas, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">
3.2. Mitokondriaalne bioenergeetika
Testisime CF-i lisamise mõju mitokondrite energeetikale WT hiirtel valge gastrocnemius ja tallalihases. Täheldati suuremat mitokondriaalset hingamist, kasutades kompleksseid IV substraate valges gastrocnemius ja tallalihastes (vastavalt p=0.004 ja p=0.028; joonis 3A, B). CII/CI ja CIV/CI hingamissuhete muutusi ei täheldatud (p =0.899 ja p =0.701 valge gastrocnemius ning p=0.693 ja p{{ 11}}.912 tallalihaste kohta, andmeid pole näidatud). Veelgi enam, kompleksi, I, IV ja tsitraadi süntaasi aktiivsus suurenes märkimisväärselt valges gastrocnemius lihases (vastavalt: pluss 31 ± 27 protsenti ,p=0.004; pluss 28 ± 38 protsenti ,p=0 0,027; pluss 35±38 protsenti ,p= 0.009; pluss 14±13 protsenti ,p=0.040;Joonis 3C).Mitokondrite võime palmitoüülkarnitiini oksüdeerida kipub suurenema valge gastrocnemius (pluss 24±12 protsenti ,p =0.096; joonis 3D), samas kui talla osas erinevust ei täheldatud (p =0.363). Palmitoüülkarnitiini poolt stimuleeritud hingamise suhteline kiirus ei muutunud, kui seda väljendati kompleksi I hingamise funktsioonina (62 ± 11 kontrollrühmas vs. 64 ± 20 CF rühmas valge gastrocnemius'e korral ja 70 ± 18 vs. 72 ± 16 tallaosas). Järgmisena uurisime tundlikkust Ca pluss-indutseeritud PTP avanemise suhtes valges gastrocnemius. Nagu on näidatud joonisel 3E, ei muutunud PTP avanemiseni kuluv aeg ega Ca² retentsioonivõime pärast CF lisamist (vastavalt p=0.608 ja p{52}}.943).
Mitokondriaalses biogeneesis osalevate geenide mRNA hindamine näitas NRF1 mRNA 70-protsendilist ülesreguleerimist, samas kui PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa ja Cox2 puhul erinevusi ei täheldatud (tabel 3). Uurisime mõne proovi puhul CF-i lisamise mõju mitokondriaalsetele superkompleksidele (joonis S1, täiendavad materjalid). Densitomeetriline analüüs viitab sellele, et CF-i lisamine suurendas üldist superkomplekside sisaldust ilma kvalitatiivse kohandamise või ümberkorraldusteta. Tõepoolest, hingamistihedus paranes 58 protsenti, kasutades kompleksseid I ja kompleksⅡ sonde ning 93 protsenti kasutades kompleksset I sondi. Samamoodi oli superkompleksidesse manustatud kompleksi I ja kompleksi III sisaldus kõrgem CF-rühmas.
CF-i lisamine vähendab mitokondriaalset ROS-i emissiooni. Kui H2O2 emissioon jäi kuivmassi kohta väljendatuna muutumatuks nii valges gastrocnemius kui ka soleus (vastavalt joonis 4A, B), vähenesid määrad, kui väljendati mitokondriaalse sisalduse kohta (joonis 4C). CF-lisandi peamist positiivset mõju täheldati valges gastrocnemius'es erinevates tingimustes (lk<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">
3.3. Oksüdatiivse stressi markerid skeletilihastes
CF-i täiendamine ei mõjutanud WT hiirte rakuvalgu oksüdatiivse stressi taset, kuna SOD2 rakusisaldus oli valge gastrocnemius ja talla katse- ja kontrollrühmades sarnane (joonis 4E). Veelgi enam, valges gastrocnemius ja soleus valgu karbonüülimises ei täheldatud erinevusi (joonis 4F). Lisaks ei täheldatud pärast CF-i lisamist katalaasi ja MnSod mRNA ekspressiooni erinevusi (tabel 3).
3.4.NAD ainevahetus
Püridiini nukleotiidide kogusumma suurenes pärast CF-i lisamist 36 ± 33 protsenti (p=0,012). Täpsemalt suurenes NAD ja NADH sisaldus valges gastrocnemius (vastavalt 69 ± 60 protsenti ,p{{6). }}.026 ja 29±42 protsenti ,p=0.017;Joonis 5A,B)ja NAD pluss/NADH suhe kippus CF rühmas suurenema (p =0.084).Ei. olulist mõju täheldati Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094) ja Sirt1 mRNA (p =0.869) puhul; tabel 3. ).
3.5. Terve keha ja raku ainevahetusreaktsioon pärast CF-i lisamist Sirt3-/hiirtel
Uurisime CF-i lisamise mõju Sirt{{0}}hiirtel. Keha koostis, nagu kaal, lahja mass ja rasvamass, ei erinenud CF-i ja kontrollrühmade vahel (vastavalt p= 0,52, p=0,66, p=0,45; Joonis 6A).Samamoodi ei mõjutanud CF lisamine igapäevast energiakulu ({{10},38±0.{{40}}1 Kcal.lahja keha mass-1.päev-1 kontrollides vs. 0,39 ± 0,01 Kcal·lahja kehamass-1.päev-1 CF, p=0.502; joonis 6B). RER oli mõlemas rühmas valguse ja pimeduse tsüklis sarnane (p=0.301; joonis 6C) ja CF lisamine ei mõjutanud substraadi oksüdatsiooni (44 ± 17 protsenti energiatarbimisest sõltus CHO oksüdatsioonist kontrollrühmas vs. 50 ± 11 protsenti CF-rühmas heledas faasis, p=0.209 ja 65±19 protsenti kontrollrühmas vs. 77±21 protsenti CF-rühmas pimedas faasis, p=0.395; joonis 6D). Metaboolne paindlikkus, mida hinnati RER-i amplituudiga 24 tunni jooksul, jäi kahe rühma vahel sarnaseks (0,19±0,05 kontrollrühmas vs.0,20±0,03 CF-s,p{48}}.604), samas kui PRCF-i kalle vähenes CF-rühmas. (H väärtused: 17,77±4,38 kontrollrühmas vs. 12,79±3,93 CF-s, p=0,039).
Järgmisena võrdlesime CF-i lisamise mõju mitokondriaalsete ensüümide aktiivsusele. CF-i lisamine ei suurendanud kompleksi I, I, IV ja CS ensüümi aktiivsust Sirt3-/hiirtel, nagu varem täheldati WT puhul (vastavalt: p=0.623,p=0 0,629, p=0.283 ja p=0.791, joonis 6E). Pärast CF-i lisamist täheldati WT-s võrreldes Sirt{10}}hiirtega suuremat kompleksi ja IV ensüümi aktiivsust ( vastavalt:p=0.027 ja P=0.045)
4. Arutelu
Selles uuringus pakume integreerivat analüüsi CF-i allaneelamise mõju kohta. Me täheldasime, et krooniline CF-i allaneelamine parandas mitokondriaalset hingamist ja vähendas H2O2 tootmist, hinnates nende müokiudkeskkonnas, samas kui PTP avanemise tundlikkus ei muutunud. CF-i allaneelamine suurendas NAD-metabolismi, toetades sirtuiini radade kaasamist täheldatud mitokondriaalsetesse kohanemistesse. Samuti täheldasime kogu keha ainevahetuse muutusi suurema võime suunas kasutada peamise substraadina süsivesikuid, mis viitab sellele, et mitokondriaalsed kohandused aitasid tõenäoliselt kaasa täheldatud kogu keha ainevahetuse kohanemisele.
4.1.Ainevahetus
Kakao flavanoolide dieeti manustamist on peetud tõhusaks strateegiaks glükoositalumatuse leevendamiseks, mis annab võimaluse leevendada ainevahetushaigusi [34]. Meie tulemused on kooskõlas varasemate uuringutega, mis teatasid suurenenud glükoositaluvusest pärast flavanoolide tarbimist [35, 36]. Selle efekti jaoks välja pakutud mehhanismid hõlmavad GLUT4 translokatsiooni suurenemist rakumembraani suunas, AMPK fosforüülimise suurenemist ja UCP-2 geeniekspressiooni ülesreguleerimist skeletilihastes [8,37] . Lisaks seostati CF-i allaneelamist inimestel insuliinitundlikkuse paranemisega[8]. Pärast 15-päevast tumeda šokolaadi tarbimist täheldati tervetel katsealustel insuliiniresistentsuse indeksi homöostaasimudeli hinnangu langust koos kvantitatiivse insuliinitundlikkuse kontrolli indeksi ja insuliinitundlikkuse indeksi suurenemisega [8]. Samuti täheldasime WT hiirtel glükoositaluvuse ja metaboolse paindlikkuse samaaegset suurenemist, mis viitab organismi võimele kohandada kütuse oksüdatsiooni kütuse kättesaadavusega [38]. Huvitav on see, et kuigi mitokondriaalset oksüdatsioonivõimet ja sellega seotud substraadi oksüdatsiooni seostati insuliiniresistentsusega 39, siis vastupidavustreening suurendas mitokondriaalset sisaldust, insuliinitundlikkust ja metaboolset paindlikkust [38]. Seetõttu on praegused tulemused spetsiifilised CF-i lisamise kohta ja neid ei mõjuta spontaanne aktiivsus.
CF positiivne mõju metaboolsele paindlikkusele ja mitokondriaalsete komplekside aktiivsuse suurenemine olid Sirt{0}}hiirtel nõrgad, mis näitab, et CF positiivne mõju avaldub vähemalt osaliselt Sirt3 kaudu. Need tulemused toetavad varasemaid leide ja Sirt3 keskset rolli metaboolse paindlikkuse reguleerimisel [24]. Meie tulemused näitavad, et mitokondriaalse funktsiooni suurenemine võib suurendada metaboolset paindlikkust. Kuid lisaks mitokondriaalsele funktsioonile tuvastati metaboolse paindlikkuse määravate teguritena ka hingamise basaalkoefitsient, glükoosi kõrvaldamise määr, rasvkoe lipiidide säilitamise võime ja vabade rasvhapete kontsentratsioon plasmas ning neid tuleks arvesse võtta [40]. Tulevased uuringud peaksid sügavamalt hindama metaboolse paindlikkuse rakulisi determinante, et süvendada meie arusaamist metaboolse paindlikkuse suurenemise põhjustest pärast CF-i lisamist.
Kogu keha metabolismi hindamine näitas suhtelise CHO oksüdatsiooni suurenemist pärast CF-i lisamist. See tulemus on vastuolus varasema uuringuga, milles teatati lipolüüsi suurenemisest pärast ägedat flavanoolide allaneelamist või kahenädalast flavan{2}oolide lisamist hiirtel [36]. Lisaks ekstrakti koostise erinevustele võivad need vastuolulised leiud tuleneda NO pleiotroopsest mõjust. On üldtunnustatud, et CF-i allaneelamine stimuleerib NO metabolismi tootmist või biosaadavust [7]. Ühelt poolt stimuleerib NO glükoosi transporti ja omastamist skeletilihastes. NO tootmise stimuleerimine rakuliinist pärinevates müotorudes insuliini või vesinikperoksiidiga põhjustas GLUT4 translokatsiooni suurenemise, mis vähenes nNOS-i inhibeerimisega [41]. Lisaks võib NO suurendada glükoosi transporti insuliinist sõltumatul rajal, mis viib tsüklilise GMP ja AMPK taseme tõusu [42], mis soodustab glükoosi oksüdatsiooni roti skeletilihastes, sõltumata rasvhapete saadavusest ja oksüdatsioonist [43]. Teisest küljest soodustab NO rasvhapete oksüdatsiooni, vähendades malonüül-CoA taset atsetüül-CoA karboksülaasi inhibeerimise ja malonüül-CoA dekarboksülaasi aktiveerimise kaudu skeletilihastes[44]. Kuigi me täheldasime nihet madalama suhtelise osa suunas, et kasutada rasvhapet substraadina CF-ga, ei olnud erinevusi kJ-des väljendatud absoluutväärtuste osas. See viitab sellele, et CF-i lisamisega täheldatud energiakulu suurenemine sõltub glükoosi oksüdatsiooni suurenemisest. Seetõttu toetavad need tulemused ideed, et CF tarbimine suurendab insuliinitundlikkust ja soodustab glükoosi oksüdatsiooni, ilma et see mõjutaks rasvhapete oksüdatsioonivõimet. Need tulemused tõstatavad küsimuse kakao flavanoolide kasutamise olulisusest kõrge rasvasisaldusega dieedi kontekstis. Tulevased uuringud peaksid hindama CF-i lisamise ja kõrge rasvasisaldusega dieedi võimalikku kahjulikku mõju.
4.2.Mitokondrite funktsioon
On näidatud, et kakao flavanoolide toiduga manustamine parandab mitokondriaalset funktsiooni, sealhulgas (i) mitokondriaalset hingamist ja elektronide transpordiahela ensüümide aktiivsust; (i) mitokondriaalset H2O2 vabanemist, mis peegeldab mitokondriaalset reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist; ja (i) mitokondriaalse kaltsiumi retentsioonivõime, mis peegeldab vastuvõtlikkust mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupooride (mPTP) avanemise suhtes (ülevaadet vt [11]. Meie tulemused on kooskõlas varasemate uuringutega; sellegipoolest oli meie uuring esimene, mis hindas CF-i täiendamine mitokondriaalse funktsiooni kohta, mida hinnati in situ permeabiliseeritud kiududes ja erinevates lihastüüpides Erinevalt varasematest uuringutest isoleeritud mitokondrite kohta säilitab mitokondriaalse funktsiooni hindamine permeabiliseeritud kiududes mitokondriaalse morfoloogia, funktsionaalsed interaktsioonid teiste rakusiseste komponentidega [1] ja väldib mitokondriaalset struktuuri katkestus mitokondriaalse isolatsiooniprotsessi ajal [32] Seetõttu on oluline uurida mitokondriaalset funktsiooni koepreparaatides, kus mitokondriaalne struktuur on säilinud ja esindatud on kogu mitokondrite kogum, et paremini hinnata ravivastust.
Varasemad rakukultuuris või in vivo hiirtel tehtud uuringud on näidanud, et EPI lisamine, mida peetakse CF peamiseks bioaktiivseks molekuliks, suurendab maksimaalset ADP-stimuleeritud hingamist (nt 3. oleku hingamine), kui mitokondrid saavad energia kombinatsiooni energiast. substraadid, mis toidavad hingamisahela erinevaid kohti [45-49]. Kooskõlas nende tulemustega täheldasime CF-i lisamise peamist mõju mitokondriaalsele hingamisele oksüdatiivsetes ja glükolüütilistes lihastes. Et teha kindlaks, kas see suurenemine on seotud mitokondriaalse massi suurenemise või mitokondriaalsete hingamisteede komplekside ümberkujunemisega, hindasime nelipealihase mitokondriaalseid superkomplekse. Arvatakse, et need supramolekulaarsed struktuurid vähendavad ROS-i tootmist, stabiliseerivad või aitavad kaasa üksikute komplekside moodustamisele, reguleerivad hingamisahela aktiivsust ja takistavad valkude agregatsiooni valgurikkas sisemises mitokondriaalses membraanis [50-52]. Vaatamata piiratud arvule meetmetele viitab tulemuste visuaalne analüüs (täiendavad materjalid), et CF-i lisamine kutsub esile mitokondriaalse massi suurenemise, mida peegeldab kõigi superkomplekssete liikide suurenemine, mitte spetsiifilised hingamisahela komplekside ümberkorraldused. Need tulemused viitavad ühiselt sellele, et CF soodustab mitokondriaalse massi suurenemist ilma hingamisahela komplekside korralduste kvalitatiivse kohandamiseta.
Mitokondriaalse hingamise käigus moodustuvad erinevad kogused superoksiidi, mida saab metaboliseerida teist tüüpi ROS-i moodustamiseks [53]. Kuigi ROS-i liigne tootmine mitokondritest on seotud paljude patoloogiatega, võivad ROS-i madalad füsioloogilised kontsentratsioonid avaldada kasulikku mõju, näiteks kaitsta nakkusetekitajate eest ja osaleda raku signaaliülekandes [2,54]. Varasemad närilistel ja inimestel in vivo läbiviidud uuringud ning rakukultuurimudelid teatasid kasulikest CF-lisandite mõjudest ROS-i tootmisele ja erinevatele antioksüdantsüsteemidele [11]. Näiteks suurendab EPI-ga suukaudne sond 15 päeva jooksul SOD2 ja katalaasi aktiivsust hiirte nelipealihastes [17]. Kuigi mitokondriaalset ROS-i tootmist ei ole laialdaselt hinnatud, täheldasime, et ROS-i tootmistasemed olid sarnased, kui väärtusi väljendati lihasmassi kohta, samas kui produktsioon vähenes, kui väljendati mitokondriaalse massi kohta, mis viitab sellele, et ROS-i füsioloogiliste kontsentratsioonide säilitamiseks toimuvad kvalitatiivsed kohandused. Veelgi enam, me ei täheldanud CF-i mõju SOD2-le ega ROS-i põhjustatud kahjustusi, mida hinnati valgu karbonüülimisega. Kuigi CF suurendab antioksüdantide valkude kogumit, sealhulgas laialdaselt teatatud SOD2 ja katalaasi taset [16, 17, 55], ei olnud see kohanemine alati seotud ROS-i põhjustatud kahjustuste vähenemisega [56-59]. Need andmed toetavad teooriat, et normaalse raku homöostaasi jaoks on vaja madalat ROS-i tootmist [2]. Need tulemused viitavad ühiselt sellele, et samaaegselt mitokondriaalse massi suurenemisega soodustab CF kvalitatiivseid mitokondriaalseid kohanemisi, et suurendada selle antioksüdantset võimekust ja säilitada madalat ROS-i tootmist.
4.3.Mitokondrite biogenees
Mitokondriaalne mass on mitokondriaalse biogeneesi ja mitofagia koosmõju tulemus. Meie uuring keskendus mitokondriaalsele biogeneesile, mida aktiveerib polüfenoolide tarbimine [60]. Mitokondriaalne biogenees on rakuline protsess, mis parandab mitokondriaalset massi. See keeruline ja kõrgelt reguleeritud protsess hõlmab mitmeid transkriptsioonifaktoreid, tuumahormooni retseptoreid ja transkriptsiooni koaktivaatoreid, mis toimivad ühiselt, et koordineerida muutusi tuuma ja mitokondriaalse DNA kodeeritud geenide ekspressioonis [61]. Varasemad uuringud on püüdnud tuvastada, milline rada võib olla CF-i lisamisest põhjustatud mitokondriaalse biogeneesi aluseks. NO-sõltuva signaaliülekande stimuleerimine on kujunenud mitokondriaalse biogeneesi keskseks rajaks. CF lisamine suurendab NO teket, inhibeerides arginiini lagundavat ensüümi arginaasi, mis suurendab L-arginiini kättesaadavust NO biosünteesi jaoks [62, 63]. Veelgi enam, eNOS-i inhibiitorit kasutades nõrgenes osaliselt epikatehhiini stimuleeriv toime mitokondriaalsele biogeneesile [17]. Need tulemused viitavad muude signaaliradade kaasamisele mitokondriaalse biogeneesi stimuleerimiseks.
Hiljuti avaldasid Aragones et al. (2016) teatasid, et toidust saadavad proantotsüanidiinid, polüfenoolide perekonna liikmed, suurendavad NAD-i ja maksa metabolismi, suurendades rottidel annusest sõltuval viisil de now o NAD pluss biosünteesi rada ja Sirte aktiivsust [12]. Lisaks ekspordib maks NADt prekursoreid teistesse organitesse, näiteks skeletilihastesse, millel on väiksem võime NAD-i sünteesida, mis suurendab võimalust laiendada maksas täheldatud mõjusid kogu organismile [64]. Kuigi mõned uuringud teatasid CF-i lisamise mõjust Sirt1 valgu sisaldusele, aktiivsusele või mRNA-le [12, 15-17, 65, 66], osaleb NAD metabolism mitokondriaalses biogeneesis pärast CF-i täiendamist, kasutades valgu kaotust või suurenemist. funktsiooni pole kunagi testitud. Kuigi meie uuringus kasutatud kogu keha Sirt3 KO hiirte suhtes oleks olnud eelistatavam lihasespetsiifiline väljalöömine, näitavad meie tulemused, et CF parandab NAD metabolismi ja Sirt3 osaleb selles toidulisanditest põhjustatud mitokondriaalse elektronide transpordiahela aktiivsuse paranemises. Sirt{17}}hiirtel ei täheldatud positiivseid mõjusid mitokondriaalsete komplekside aktiivsusele pärast CF-i lisamist ning kompleksi I ja IV aktiivsust täheldati pärast CF-i lisamist ainult WT-s. Need tähelepanekud laiendavad varasemaid töid, mis näitavad, et Sirt3 mängib mitokondriaalses funktsioonis keskset rolli ]67. Need leiud viitavad ühiselt sellele, et sirtuiinid on NAD-i metabolismi moduleerimise kaudu seotud mitokondriaalse massi paranemisega, mida täheldatakse pärast CF-i lisamist. 4.4.Piirangud
Kakaooad koosnevad monomeersete, oligomeersete ja polümeersete flavanoolide segust. Flavanoolide hulgas näib EPI olevat kakaotoodetes kõige enam leitud polüfenoolmonomeer, mis moodustab kuni 35 protsenti polüfenoolide sisaldusest [68]. EPI määrati kindlaks kui peamine bioaktiivne molekul, mis on kakao ja šokolaadi lisamisega seotud eelised [47, 69]. Siiski võivad EPI metaboliidid (EPIm) olla seotud in vivo uuringutes täheldatud EPI-indutseeritud bioloogiliste mõjudega. EPIm võib saavutada kõrgema plasmakontsentratsiooni kui EPI[70]. Lisaks täheldati liikide lõikes suuri erinevusi EPI-des. Tõepoolest, 80 protsenti inimestel esinevatest EPI-dest ei tuvastatud rottidel, samas kui hiirte ja inimeste sarnasus leiti olevat veidi soodsam, kuna tuvastati kaks peamist inimese metaboliiti [70]. Kasutasime rikastatud CF ekstrakti, mis sisaldas kuni viis korda rohkem EPI-d kui fermenteerimata kakaooad[71]. Veelgi enam, EPI sisaldus vähenes kääritamise tõttu 10-20 protsenti ja röstimise ajal temperatuurist sõltuval viisil [71,72]. Need andmed viitavad ühiselt sellele, et EPI lisamise eeliste hindamisel inimeste tervisele tuleks tähelepanu pöörata ainult EPI sisule ning praeguseid tulemusi tuleks enne inimestel täheldatud aluseks olevate mehhanismide ekstrapoleerimist kaaluda ettevaatlikult.
5. Kokkuvõtted
Igapäevane CF-i lisamine 15 päeva jooksul viib mitokondriaalse funktsiooni paranemiseni oksüdatiivsetes ja glükolüütilistes lihastes. Käesolevad tulemused viitavad sellele, et suurenenud mitokondriaalne hingamine põhjustab mitokondriaalse massi suurenemist, samal ajal kui ROS-i tootmise raku tase säilis, mis viitab kvalitatiivsetele kohanemistele mitokondrites. Samaaegselt eelnevalt kirjeldatud rakulise mõjuga NO metabolismile [73] moduleerib CF NAD metabolismi, mis stimuleerib sirtuiinide aktiivsust. Sirt3 mängib keskset rolli mitokondriaalses kohanemises ja metaboolses paindlikkuses pärast CF-i lisamist. Kuna sirtuiinid on hiljutised sihtmärgid mitmesuguste haiguste patogeneesis, nagu diabeet või astma [74,75 l, siis täiendavad uuringud uurivad potentsiaalset huvi kasutada CF-d sirtuiinide loodusliku aktivaatorina.
Viited
1. Kuznetsov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Mitokondriaalse funktsiooni analüüs in situ permeabiliseeritud lihaskiududes, kudedes ja rakkudes. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]
2. Sena, LA; Chandel, NS Mitokondriaalsete reaktiivsete hapnikuliikide füsioloogilised rollid. Mol. Cell 2012, 48, 158–167. [CrossRef]
3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Intratsellulaarse Ca2 pluss võnkumiste ja Ca2 pluss-stimuleeritud mitokondriaalse ainevahetuse vastastikune mõju. Sci. Vabariik 2016, 6, srep19316. [CrossRef]
4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitokondriaalsed haigused: organellide stressireaktsioonide panus patoloogiasse. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]
5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Lihaste hapnikuga varustamine ja kasutamine 1. tüüpi diabeedi korral välisõhust mitokondriaalse hingamisahelani: kas on olemas piirav samm? Diabeedihooldus 2020, 43, 209–218. [CrossRef]
6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Mitokondritest sarkopeeniani: põletiku roll ja RAGE-ligandi telje mõju. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]
7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao ja šokolaad inimeste tervises ja haigustes. Antioksüd. Redokssignaal. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Tumeda šokolaadi lühiajalisele manustamisele järgneb tervetel inimestel insuliinitundlikkuse märkimisväärne tõus ja vererõhu langus. Olen. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]
9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Glükoositalumatusega ja hüpertensiivsetel isikutel väheneb vererõhk ja suureneb insuliinitundlikkus pärast 15-päevast kõrge polüfenoolisisaldusega tumešokolaadi tarbimist. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]
10. Ottaviani, JI; Ema, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Flavanoolide stereokeemiline konfiguratsioon mõjutab flavanoolide taset ja metabolismi inimestel ning nende bioloogilist aktiivsust in vivo. Vaba Radik. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]
