Cistanche Tubulosa fenüületanoolglükosiidid pärsivad maksa tähtrakkude aktivatsiooni ja blokeerivad signaaliradade juhtimist TGF{0}}/smad-is kui potentsiaalsed maksafibroosivastased ained
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang ja Tao Liu
Abstraktne: Cistanche tubulosaon traditsiooniline Hiina taimne ravim, mida kasutatakse laialdaselt immuunsuse reguleerimiseks jafenüületanoidglükosiidid(CPhG-d) on selle tegevuse eest vastutavate peamiste komponentide hulgas. Varasemad uuringud on näidanud CPhG-de ennetavat ja terapeutilist toimet veise seerumi albumiini (BSA) poolt indutseeritud maksafibroosile rottidel. Uuringu eesmärk oli hinnata CPhG-de ja monomeeride maksafibroosivastast toimet.ehhinakosiidjaakteosiidinhibeerides hepatic stellate cell (HSC) aktivatsiooni, blokeerides kasvufaktori p1 (TGF-p1)/smad transformeerimisel signaaliradade juhtivuse ja määrates kindlaks nende in vitro hepatoprotektiivne aktiivsus. HSC proliferatsioon oli ilmselgelt pärsitud pärast töötlemist CPhG-dega (100,50 ^g/ml)/ehhinakosiidiga (500 250,125 ^g/ml)/akteosiidiga (6,3 ^g/ml), IC50 väärtustega 119,125,520,999 ja g/6,345 ml, vastavalt MTT testis. CPhG-de erinevad kontsentratsioonid /ehhinakosiid/akteosiidlaktaatdehüdrogenaasi (LDH) mõõtmiste kohaselt ei mõjutanud HSC rakulist toksilisust. CPhG-de erinevad kontsentratsioonid /ehhinakosiid/akteosiidsuurendas smad7 mRNA taset ja valgu ekspressiooni ning vähendas smad2, smad3 mRNA taset ning smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) valgu ekspressiooni HSC-s. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et CPhG-d /ehhinakosiid/akteosiidvõib blokeerida TGF-p1/smad signaaliradade juhtivust ja pärssida HSC aktivatsiooni, mis viitab sellele, etC. tubulosavõib seega olla potentsiaalne taimne ravim maksafibroosi raviks.
Märksõnad: Cistanche tubulosa; fenüületanoolglükosiidid alatesCistanche(CPHG-d);ehhinakosiid; akteosiid; maksa tähtrakud (HSC); TGF-p1/smad
1. Sissejuhatus
muutuvad proliferatiivseks ja fibrogeenseks, koguvad seejärel ECM-i ja diferentseeruvad lõpuks fibrogeenseteks müofibroblastilaadseteks rakkudeks. Transformeerivat kasvufaktorit .1 (TGF-p 1) peetakse peamiseks profibrogeenseks vahendajaks. TGF-&1-ga seotud signalisatsioonirada on oluline maksafibroosi mehhanism ja see hõlmab peamiselt Smad-sõltuvat ja Smad-sõltumatut signaaliülekannet ning Smad-sõltuv signaaliülekande rada arvatakse olevat TGF-p1 signaaliülekande peamine kanal. . Seetõttu võib TGF-p1/smad signaaliraja blokeerimine pärssida kollageeni tootmist ja lõpuks leevendada maksafibroosi, mis on muutnud selle raja viimastel aastatel oluliseks sihtmärgiks maksafibroosivastaste ravimite uurimisel.
Vaatamata maksafibroosi kõrgele esinemissagedusele maailmas, ei ole üldiselt aktsepteeritud antifibrogeenset ravi saadaval [2–4]. Traditsioonilised hiina taimsed ravimid (TCHM) pakuvad maksahäirete ravis suurt huvi, kuna mõnda neist saab kasutada maksafibroosi ravis ja ennetamisel. Praegu on paljud uuringud keskendunud potentsiaalsetele antifibrogeensetele ravimitele, mida on TCHM-idena kasutatud tuhandeid aastaid [5].
Cistanche tubulosa W (perekond Orobanchaceae) fa parasiittaim, mida kasvatatakse laialdaselt Hiinas Xinjiangi lõunaosas [6]. Inimesed kasutavad seda neerude turgutamiseks, vere toitmiseks, soolte lõdvestamiseks ja vananemise edasilükkamiseks ilma kõrvaltoimeteta ning see on ametlikult loetletud Hiina farmakopöas [7]. C. tubulosa sisaldab mitmesuguseid aktiivseid komponente, sealhulgas fenüületanoidglükosiide (CPhG), iridoide ja polüsahhariide. Paljude C. tubulous aktiivsete komponentide hulgas on CPhG-d, millel on mitmeid bioaktiivsusi (antioksüdant, väsimust vähendav, radioresistentsus jne), selle taime peamised iseloomulikud komponendid. Viimastel aastatel on teatatud, et CPhG-del on ülemäärane Hent hepatoprotektiivne toime ja need võivad hävitada puu radikaale, kaitsta maksamembraane ja avaldada immunoregulatoorset toimet, apoptoosi pärssimist, B-hepatiidi pinnaantigeeni (HBs Ag) ja B-hepatiidi ekspressiooni pärssimist. e antigeeni (HBeAg) ja B-hepatiidi viiruse (HBV) DNA replikatsiooni aktiivsus jne. HBV DNA tase on kõige usaldusväärsem indeks, mis peegeldab otseselt viiruse replikatsiooni aktiivsust, mis on võtmetegur krooniliste HBV infektsioonide loomuliku ajaloo määramisel, oP viirusevastase ravi mõju jälgimine ning ägedate ja krooniliste HBV infektsioonide prognoosi hindamine. HBV seroloogilised avastamisindeksid hõlmavad peamiselt HBsAg, HBeAg jne [8–11]. Siiski on kirjanduses vähe teateid CPhG-de maksafibroosivastase toime kohta. Varasemad uuringud on näidanud CPhG-de ennetavat ja terapeutilist toimet veise seerumi albumiini (BSA) poolt indutseeritud maksafibroosile rottidel, kuid CPhG-de ja selle peamiste monomeeride (ehhinakosiid ja akteosiid, joonis 1) antifibrogeenset toimet ei ole kunagi in vitro hinnatud.
orgaaniline Cistanche tubulosa
2. Tulemused
2.1. CPhG-de kvantitatiivne määramine
CPhG-d sisseC. tubulosasisaldavad kahte fenüületüülalkoholi glükosiidi: ehhinakosiidi ja akteo-poolt ning nende sisaldus CPhG-des tuvastati HPLC analüüsiga (joonis 1) 42,71 protsenti 土 0,42 protsenti ja 14,27 protsenti 土 0.18 protsenti vastavalt.
2.2. CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi inhibeeriv toime HSC-T6-le
CPhG-d, ehhinakosiid ja akteosiid (62.5-500 卩g/mL) pärssisid HSC rakkude elujõulisust kontsentratsioonist sõltuval viisil. CPhG-d ja akteosiid näitasid märkimisväärset inhibeerivat toimet HSC rakkudele, 50-protsendiline rakukasvu aktiivsuse inhibeerimine (IC50) olid vastavalt 119,125 µ/mL ja 6,999 µ/mL. Ehhinakosiidil oli mõõdukas inhibeeriv toime (IC50 520,345 µ/mL; tabel 1 ja joonis 2).
2.3. CPhG-de, Echin acoside ja Acteorida rakutoksilisus HSC-l
Laktaatdehüdrogenaas (LDH), kõigis rakkudes esinev stabiilne tsütoplasmaatiline ensüüm, vabaneb plasmamembraani kahjustuse korral kiiresti rakukultuuri supernatanti. Ensüümi aktiivsus kultuuri supernatandis korreleerub lüüsitud rakkude osakaaluga [12]. Nagu on näidatud tabelis 2, ei olnud C PhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi erinevate kontsentratsioonidega ravimisel, kuigi LDH aktiivsus näitas raku koirtrooli rühmaga võrreldes kerget tõusu, ei olnud erinevus statistiliselt oluline (p > 0.05). ), mis näitab, et enamik rakumembraane säilitab oma terviklikkuse ja CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi inhibeerimine HSC-l ei ole tingitud mittespetsiifilisest raku toksilisusest.
2.4. CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi mõju TGF-^i poolt indutseeritud HSC proliferatsioonile
HSC proliferatsiooni, aktiveerimist ja diferentseerumist reguleerivad mitmed tegurid. Maksafibroosiga seotud mitmesugustest teguritest peetakse TGF-i {{0}} kõige olulisemaks, kuna see võib aktiveerida HSC, soodustada müofibroblastide diferentseerumist, suurendada ECM-i sünteesi ja pärssida ECM-i lagunemist ning vabastada kemokiine ja maksafibroosiga seotud tsütokiinid [13]. Selles uuringus, välja arvatud kontrollrühm, stimuleeriti statsionaarseid HSC-sid in vitro TGF-P1-ga, et simuleerida varajase maksafibroosi teket ning uurida CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi mõju TGF-p-le1- indutseeritud HSC proliferatsioon. Nagu on näidatud tabelis 3, soodustas TGF-61 rühm kontrollrühmaga võrreldes oluliselt HSC proliferatsiooni (p < 0.01).="" võrreldes="" tgf-p1="" rühmaga="" on="" tgf-p1="" pluss="" cphg-d="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" pluss="" ehhinakosiid="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" pluss="" akteosiid="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05)="" inhibeerivad="" kõik="" märkimisväärselt="" vohamist="" tgf-|3="" 1="" poolt="" erineval="" määral="" indutseeritud="">
2.5. Smad2) smad3 ja smad7 mRNA ekspressioonid pärast CPhG-de, ohmakosiidi ja akteasiidi sekkumist HSC-dele
Smad3 ja smad2 on TTGF-p signaaliraja peamised allavoolu efektorid [14,15] ja smad7 on smad-signalisatsiooni inhibiitor. Teoreetiliselt võib smad7 suurenenud ekspressioon või smad2/smad3 vähenenud ekspressioon blokeerida TGF-p1/smad signaaliradade juhtivust. Nagu on näidatud joonisel 3, näitas reaalajas kvantitatiivne PCR analüüs, et smad2 ja smad3 mRNA ekspressioon näitas madalamat taset, samas kui smad7 näitas kõrgemat taset kontrollrühmas võrreldes TGF-|31 rühmaga. TC (25, 50, 75,100 |dg/mL) rühmas smad2 mRNA tase (p < 0).{37="" }}5)="" ja="" smad3="" (p="">< 0,01)="" olid="" oluliselt="" vähenenud="" võrreldes="" tgf-pf="" rühmaga="" ja="" olid="" isegi="" sarnased="" kontrollrühmaga;="" mina="" samal="" ajal="" oli="" smad7="" mrna="" tase="" oluliselt="" suurenenud="" tc="" (50,="" 75="" 100="" 卩g/ml)="" rühmas="" (vastavalt="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01).="" kuid;="" smad7="" ekspressioon="" näitas="" tõusutendentsi="" tc="" 25="" µg/ml="" rühmas="" võrreldes="" tgf-p1="" rühmaga="" (joonis="">
Võrreldes TGF-p1 rühmaga, vähenes smad2 ja smad3 mRNA ekspressioon samal ajal TE-s oluliselt (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) rühmas (p < 0.01)="" ja="" smad7="" mrna="" ekspressioon="" suurenes="" oluliselt="" te="" (125,="" 250="" 500="" 昭/ml)="" rühmas="" (p="">< 0,01)="" (joonis="" 4)="" .="" sarnaselt="" näitas="" sama="" suundumus="" ka="" ta="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" µg/ml)="" rühmas="" (joonis="">
2.6. CPhG-de, ehhinakosiidide ja Ac)eosiidide mõju T GF-^i/smad signaalirajale HSC-s
TGF-p 1/smad signaalirada sõltub smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) ja smad7, kus p-smad2, p-smad3 on smad2 ja smad2 aktiveeritud vormid. smad3. Selles uuringus analüüsiti omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 ja smad7 valgu taset. Western blot analüüs tuvastas smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 taseme tõusu TGF-p1 poolt ning nende tõusu pärssimist CPhG-de, ec hinakosiidi ja akteosiidi poolt; vahepeal näitas wesierni blotanalüüs CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi poolt ülesreguleeritud smad7 taset. (joonised 6—8).
Nagu on näidatud joonisel 6, võrreldes c on2rol rühmaga (smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 valgu ekspressioonid suurenesid oluliselt ja smad7 valgu ekspressioon vähenes TGF-p1 rühmas. TC (25) , 50, 75, 100 昭/mL) ravimirühmad, smad/ (joonis 6A), p-smad2 (joonis 6B), smad 3 (joonis 6C), p -smad3 (Joonis 6D) ekspressioonid olid oluliselt madalamad kui TGF-p1 rühmas (卩 < 0,01) ja smad7 (joonis 6E) valgu ekspressioon oli kõrgem kui TGF-S1 rühmas (p < 0,01) (joonis 6).
Samal ajal mõõdeti pärast ehhinakosiidi ja akteosiidi sekkumist HSC-sse ekspressioone ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 ja smad7. Nagu on näidatud joonistel 7 ja 8, olid smad2, smad3, p-smad2 ja p-smad3 valgu ekspressioonitasemed oluliselt inhibeeritud (p < 0.05="" või="" p="">< 0.01="" ),="" oli="" smad7="" valgu="" ekspressioonitase="" kõrgem="" (p="">< 0,01),="" võrreldes="" tgf-p1="" rühmaga="" (joonised="" 7="" ja="">
3. Arutelu
Maksafibroos on üks peamisi haigestumuse ja suremuse põhjuseid kogu maailmas, kuid praegu on selle seisundi jaoks saadaval väga piiratud ravivõimalused, mistõttu on meie jaoks väga oluline otsida potentsiaalseid sihtmärke terapeutiliseks sekkumiseks, et vältida maksafibroosi teket. 16]. Hiljuti on teadlased leidnud, et erinevatel taimsetel ravimitel on hepatoprotektiivne ja fibroosivastane toime. Paljusid TCHM-e, nagu Fufang Biejia Ruangani pillid [17] ja Xiao-chai-hu keetmine (shosaiko to Jaapanis) [18,19], on Hiinas, Koreas ja Jaapanis laialdaselt kasutatud maksafibroosi raviks tuhandeid aastaid. C. tubulosa sisaldab mitmesuguseid aktiivseid komponente, sealhulgas CPhG-sid, iridoide ja polüsahhariide. Kuna CPhG-d on C. tubulosa üks tõhusaid materiaalseid aluseid, on neil suurepärane hepatoprotektiivne toime, kuid GPhC-de ja sellega seotud ühendite fibroosivastase toime kohta on vähe teavet. Selles uuringus uurisime, kuidas CPhG-d, ehhinakosiid ja akteosiid pärsivad HSC aktiveerumist ja blokeerivad signaaliülekande teekonna TGF-p1/snaad-is kui potentsiaalseid heptilise fibroosivastaseid aineid in vitro.
Mis tahes etioloogiaga maksakahjustus viib lõpuks HSC-de aktiveerumiseni, mis transdiferentseeruvad fibrogeenseteks müofibroblastilaadseteks rakkudeks [20]. See tähendab, et müofibroblastid
on saadud HSCs-de aktiveerimisest ja proliferatsioonist [21] ning seda peetakse maksafibroosi moodustumise vahendajaks. Sel põhjusel teostasime in vitro uuringuid, et võrrelda CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidiga kokku puutunud HSC-de rakkude elujõulisuse määra. Tulemused näitasid, et akteosiidi inhibeeriv toime HSC-le oli tugevaim ja CPhG-de toime oli parem kui ehhinakosiidil. CPhG-d, ehhinakosiidi ja akteosiidiga ravitud seerumid inhibeerisid kõik HSC proliferatsiooni annusest sõltuval viisil.
LDH on elusrakkudes tsütoplasmaatiline ensüüm ja see ei suuda normaalsetes tingimustes läbi rakumembraani tungida. Kui rakud on kahjustatud, suureneb membraani läbilaskvus ja LDH vabaneb raku välispinnale. Tavaliselt suudab LDH tuvastada rakukahjustuse astme [{{0}}]. Uurimine näitas, et CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidiga ravitava seerumi LDH aktiivsus tõusis raku kontrollrühmaga võrreldes vaid veidi ning erinevus ei olnud statistiliselt oluline (p > 0,05), mis näitab, et suurem osa rakumembraanist säilitas oma terviklikkuse , ja HSC-de inhibeerimine CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi poolt ei ole tingitud mittespetsiifilisest raku toksilisusest.
Maksakahjustuse korral võivad aktiveeritud hepatotsüüdid vabastada TGF-pi, mis omakorda aktiveerib HSC-T6, mistõttu on TGF-pi-l tihe seos fibroosiga [25-27]. Selles uuringus võib CPhG-sid, ehhinakosiidi ja akteosiidi pidada atraktiivseks terapeutiliseks strateegiaks HSC proliferatsiooni pärssimiseks pärast seda, kui HSC-sid stimuleeriti wTGF-pi-ga in vitro. Me oletame, et CPhG-sid, ehhinakosiidi ja akteosiidi võib kasutada maksafibroosi omamoodi raviks ja/või ennetamiseks ning need pärsivad varajase maksafibroosi teket. Maksafibroosi moodustumine on mitmefaktorilise ja mitmerakulise osaluse keeruline protsess. Selles patoloogilises protsessis moodustavad raku-raku, raku-tsütokiinide ja raku-maatriksi interaktsioonid tülika võrgu. Selles võrgus saab maksafibroosi arengut reguleerida erinevate signaaliradade ja vahenditega. TGF-pi on klassikaline HSC aktivaator ja peamine vahendaja maksafibroosi patogeneesis [28]. CPhG-d, ehhinakosiid ja akteosiid võivad pärssida TGF-pi/smad rajaga seotud mRNA ja valkude ekspressiooni HSC-des.
TGF-pi avaldab oma rakulist toimet smad-signalisatsiooniraja kaudu ja seda on peetud maksafibroosi ja põletiku arengu peamiseks vahendajaks. TGF-pi seondumisel TGF-p-tüüpi II retseptoriga fosforüülib II tüüpi retseptorkinaas TGF-p I tüüpi retseptori GS domeeni, mis viib I tüüpi retseptori aktiveerimiseni [29]. P-smad2 ja p-smad3 toimel nende C-terminali SSXS motiivi kahele seriinijäägile aktiveeritakse I tüüpi retseptori aktiveerimine [30]. P-smad2 ja p-smad3 moodustavad smad4-ga oligomeerseid komplekse, sisenevad seejärel tuuma ja avaldavad oma bioloogilist transkriptsiooniaktiivsust. Seega edastavad smad valgud signaale otse retseptorkinaasilt tuuma [3i]. Teisest küljest on smad7 kindlalt ühendatud TGF-pi retseptoriga, mis viib smad 2/3 aktiveerimise võimetuseni ja signaaliülekanderadade pärssimiseni [32]. Smad7 võib inhibeerida p-smad2 ja p-smad3, aktiveeritud smad-komplekside tuuma translokatsiooni ja (CAGA) (9)-MLP-Luc aktiveerimist, mille tulemuseks on kollageeni I ekspressiooni vähenemine ja TGF-p signaaliülekande täielik inhibeerimine. [33,34]. Meie tulemused näitasid, et CPhG-d, ehhinakosiid ja akteosiid võivad vähendada smad2 ja smad3 mRNA ekspressiooni ning suurendada smad7 mRNA ekspressiooni; inhibeerivad smad2, p-smad2, smad3 ja p-smad3 valgu ekspressiooni ning reguleerivad üles smad7 valgu ekspressiooni, mis viitab sellele, et CPhG-d, ehhinakosiid ja akteosiid mängivad samuti rolli HSC aktivatsiooni pärssimisel ja seega maksafibroosi pärssimisel, tuues esile potentsiaalse fibroosivastase toime mehhanism.
Näidati, et kolme testitava aine hepatoprotektiivsete toimete järjestus oli akteosiid > CPhGs > ehhinakosiid. CPhG-de, ehhinakosiidide ja akteosiidide maksafibroosi eest kaitsmise mehhanismi erinevuste põhjuste täiendavaks selgitamiseks analüüsiti nende keemilisi struktuure. Fenetüülalkoholi glükosiidi fragment näib olevat hepatoprotektiivse toime oluline struktuur [35]. Akteosiid (C29H36Oi5) on topeltglükosiid ja ehhinakosiid (C35H46O20) on triglükosiid, st ehhinakosiidi struktuuris on akteosiidiga võrreldes ekstra glükosiidi, mis põhjustab selle ruumilise suuruse suurenemist. Akteosiidi hepatoprotektiivne toime või HSC aktiivsuse pärssimine on parem kui ehhinakosiidil, mis võib olla tingitud steerilisest takistusest.
kaitsta maksa: cistanche ekstrakt
4. Eksperimentaalne osa
4.1. Kemikaalid ja reaktiivid
TGF-pi osteti firmalt Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). HSC-T6 rakuliin osteti ettevõttelt Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Hiina). Dimetüülsulfoksiid (DMSO) osteti firmalt Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Smad2, smad3 ja smad7 praimereid tootis Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Hiina). Revert Aid esimese ahela cDNA sünteesikomplekt osteti ettevõttest Thermo Scientific (Shanghai, Hiina). Quantifast SYBR roheline PCR komplekt osteti ettevõttelt QIAGEN GmbH (Hilden, Saksamaa). p-smad2 (ser465/467) antikeha, Smad3 (C67H9) küüliku mAb ja p-smad3 (ser423/425) küüliku mAb osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Smad7 antikeha osteti firmalt Boster (Wuhan, Hiina). Smad2 polüklonaalne antikeha ja p-aktiini monoklonaalne antikeha osteti ettevõttelt Proteintech (Wuhan, Hiina). Primaarse antikeha tuvastamiseks kasutati 2-kraadist antikehalahust (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) ja 2-kraadist antikehalahust (Alk-Phos. Conjugated, Anti-Mouse), mis osteti ettevõttest Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Laktaatdehüdrogenaasi testikomplekt pärines Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute'ist (Nanjing, Hiina).
4.2. Taimne materjal
C. tubulosa koguti Hiinas Xinjiangi Uirghuri autonoomses piirkonnas Tulufanis 2006. aasta mais. Taimse materjali tuvastas C. tubulosa Xinjiangi Materia Medica instituut Jiang He. Vautšeri näidis deponeeriti Hiinas Xinjiangi Materia Medica instituuti.
4.3. CPhG-de ja selle ühendite eraldamine ja puhastamine
Kuivatatud ja viilutatud C. tubulosa (60 kg) risoomid ekstraheeriti kolm korda järjest tagasijooksul 70 protsendilise etanooliga (4,8 L) ja seejärel eemaldati lahusti kombineeritud ekstraktidest. etanooliekstrakti (1,146 kg) saamiseks. Etanooliekstraktid puhastati AB-8 vaiguga, et saada fenüületanoolglükosiidide (CPhGs) toorekstrakt. Pärast vees lahustamist puhastati ekstrakt AB-8 adsorptsiooniga makropoorse vaigu kromatograafiaga, et saada C. tubulosa (CPhGs, 210 g) fenüületanooli glükoosi küljed. CPhG-sid kanti ODS OP{{10}} kolonnile ja elueeriti järjestikku MeOH-H2 (0:1 -^1:0) segudega. Eluaadid ühendati viieks alamfraktsiooniks vastavalt TLC käitumisele, kasutades lahustisüsteemi CHCh-MeOH-H2 (6:4:0,5). Laigud visualiseeriti pärast pihustamist 1% FeCih-ga. Erinevaid fraktsioone puhastati korduvalt Sephadex LH-20 kolonnkromatograafiaga, kasutades eluendina metanooli ja CPhG-dest eraldati kaks fenüületanoolglükosiidi. Nende struktuurid kinnitati ehhinakosiidina (C35H46O20) ja akteosiidina (C29H36O15), kasutades MS, 1H- ja MC-NMR [35], mille puhtus määrati UV-HPLC abil vastavalt 99,17% ja 98,92%. Ehhinakosiidi ja akteosiidi struktuurid on näidatud joonisel 9.
4.5. CPhG-de kvantitatiivne määramine
Vedelikkromatograafiat (HPLC) (LC{{0}}HPLC seadet, Shimadzu Co., Kyoto, Jaapan) kasutati ehhiinakosiidi ja cteosiidi sisalduse analüüsimiseks CPhG-des. Phenomenex Gemini ODS kolonni (250 x 4,6 mm, 5 µm) kasutati 30 kraadi juures. Isokraatset liikuvat faasi, mis koosnes metanool-atsetonitriil-1 protsendist äädikhappest (15:10:75, v/v/v), kasutati 40-minutise voolukiirusega 0,6 ml/min UV-kiirgusega. tuvastamine 334 nm juures.
4.6. Rakukultuur
HSC rakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (kõrge glükoosisisaldus) (DMEM, Peking, Hiina), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/mL penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini (HyClone, Logan, UT, USA) niisutatud inkubaatoris 37 kraadi juures 5% CO2-ga. Neid rakke subkultuuriti regulaarselt trüpsiini 0,25% (1x) lahusega (HyClone, Logan, UT, USA) ja söödet vahetati iga 2 päeva järel. Algselt kultiveeriti rakke DMEM-iga, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i, 48 tundi. Seejärel asendati sööde DMEM-iga ilma FBS-ita, et rakud näljutada 12 tundi. Neid rakke paljundati 48 tundi ja 48 tunni pärast näljutati seerumit 0,5% FBS-iga 12 tundi, enne kui lisati 5 ng/ml TGF-&1,
4.7. IC50 väärtuste määramine
Pärast üleöö inkubeerimist nälgimissöötmes, mis sisaldas {{0}},5 protsenti FBS-i, külvati HSC rakud 96-süvendiga plaadile tihedusega 5 x 104 rakku/ml 24 tunniks. HSC rakke töödeldi CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidiga erinevates kontsentratsioonides (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 ja 500 µg/mL) 48 tundi. Igal kontsentratsioonil oli neli auku. Ravi lõpus 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid] (Sigma; Lisati 5 mg/ml) ja rakke inkubeeriti veel 4 tundi. Pärast supernatandi eemaldamist lisati igasse süvendisse DMSO (200 rL). Pärast plaadi 10-minutilist loksutamist loksutil saadi IC50 väärtused, mõõtes neeldumist lainepikkusel 490 nm, kasutades ensüümimärgistusseadet (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), see analüüs tehti kolmes korduses. CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi IC50 väärtused olid vastavalt 119,125, 520,345 ja 6,999 Rg/ml.
4.8. Rakkude proliferatsiooni pärssiv toime ja rakkude elujõulisus
HSC rakke eksponeeriti erineva kontsentratsiooniga CPhG-dega (25 50 100 Rg/ml), ehhinakosiidiga (125 250 500 Rg/ml) ja akteosiidiga (1,5, 3, 6 Rg/ml). Erinevates kontsentratsioonides CPhG-sid, ehhinakosiidi ja akteosiidi kanti plaadile neljas järjestikuses süvendis ja inkubeeriti 48 tundi. Rakkude proliferatsiooni pärssivad toimed ja rakkude elujõulisuse tase (põhineb kahjustatud rakkudest supernatanti vabanenud LDH aktiivsuse mõõtmisel [36]) määrati MTT testiga. Inhibeerimise määr arvutati järgmise valemiga [37]:
Inhibeerimise määr ( protsenti ) " [1 — (katserühma keskmine neeldumine / tühikatserühma keskmine neelduvus)] x 100 protsenti
Vastavalt komplekti juhistele,
LDH (U/L) {{0}} (mõõdetud OD – kontroll-OD)/(standardne OD – tühi OD) x 0,2 mmol/L x 1000
Meie esialgne uuring näitas, et CPhG-d, ehhinakosiid ja akteosiid ei mõjutanud rakkude elujõulisust.
4.9. TGF-^1 proliferatsioonivastased tegevused
TGF-p1 poolt aktiveeritud HSC-d on pikka aega peetud seotuks maksafibroosiga ja maksafibroosi ravimeetodina on pakutud välja HSC kasvu pärssimine [36,38]. CPhG-de, ehhinakosiidi ja akteosiidi proliferatsioonivastane toime TGF-p1 poolt aktiveeritud HSC-dele määrati MTT testiga [39]. Kasutades kirjeldatud protseduure ja ravimikontsentratsioone,
katserühmad hõlmasid kontrollrühma, TGF-pi rühma, TGF-pi pluss erineva kontsentratsiooniga ravimirühmi. Kõiki rakurühmi peale kontrollrühma kultiveeriti DMEM-iga, mis sisaldas 50 ng/ml TGF-p1 (ilma FBS-ita) 24 tundi. Rakkude proliferatsiooni inhibeeriv toime arvutati kui 100 x (töödeldud ühendi neeldumine – taustvalguse neeldumine)/(mudeli neeldumine – taustvalguse neeldumine).
4.10. Pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsioon (RT-PCR)
Smad2, smad3 ja smad7 mRNA ekspressioonitase määrati reaalajas PCR abil. MRNA ekspressiooni määramiseks HSC rakkudes külvati rakud (5 x 104 rakku) kuue süvendiga plaatidele 30 ml DMEM-iga 10% FBS-iga ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 37 kraadi ja 5 protsenti CO2. Pärast söötme vahetamist seerumivaba DMEM-i vastu lisati süvenditesse CPhG-sid (100,50,25 µg/ml), ehhinakosiid (500,250,125 µg/mL) ja akteosiid (6, 3,1,5 µg/mL). Pärast 48-tunnist inkubeerimist CPhG-de ja monomeerikompositsioonidega ekstraheeriti kogu RNA, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja loksutati tugevalt kloroformiga 15 sekundit. Pärast 3-minutilist toatemperatuuril seismist tsentrifuugiti lüsaati 12,000 xg juures 15 minutit 4 kraadi juures. Vesifaasis olev RNA sadestati isopropanooliga ja ülemine vesifaas viidi üle uude mikrotsentrifuugi katseklaasi. RNA sadestati 0,75% etanooli lisamisega, misjärel mikrotsentrifuugitoru ja tsentrifuugiti 12,000 xg 4 kraadi juures mitte rohkem kui 5 minutit. Supernatant eemaldati ja RNA-d kuivatati toatemperatuuril 5-10 min. Praimerid (Sangon) kavandati, kasutades Batch Primer 3, ja need on loetletud tabelis 4. Tulemused normaliseeriti sisekontrollina majapidamisgeeni p-aktiini mRNA-ga ja esitati suhteliste mRNA tasemetena. Reaktsioonid viidi läbi 8 |^L iQ SYBR Green Supermixi, 1 10 pM praimeripaari, 8,5 ui destilleeritud vee ja 2,5 rL cDNA-ga.
Iga polümeraasi ahelreaktsioon viidi läbi järgmistel tingimustel: 95 kraadi 3 minutit, seejärel 40 tsüklit 10 s 95 kraadi juures, 30 s 55 kraadi juures ja 10 s 55 kraadi -95 kraadi pikendamiseks, millele järgnes üks fluorestsentsi mõõtmine. Lõplikke tulemusi kirjeldati suhteliste väärtustega (2_AACt). Arvutused ja analüüsid viidi läbi iQ5 reaalajas PCR-tuvastussüsteemiga.
4.11. Western blot analüüs
Täisrakuekstraktid valmistati, kasutades Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) puhvrit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 1% Halt proteaasi inhibiitori ja 1% Halt fosfataasi inhibiitori kokteilidega (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Kogu valku kasutati smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 ja smad7 tuvastamiseks. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti ja kvantifitseeriti Bradfordi meetodil. Valk (10-30 Rg) eraldati 10% SDS-PAGE geelil ja kanti üle polüvinülideenfluoriid- (PVDF) membraanidele (Millipore, Boston, MA, USA). Membraanid blokeeriti 1 tund toatemperatuuril 5% veise seerumi albumiini ja primaarsete antikehadega (smad2 polüklonaalne antikeha, p-smad2 antikeha, smad3 küüliku mAb ja p-smad3 küüliku mAb, lahjendus 1:1000; küüliku mAb smad7, 1 :200 lahjendus, p-aktiini monoklonaalne antikeha, 1:5000 lahjendus) inkubeeriti 4 kraadi juures üleöö. Vastav Alk-Phos. konjugeeritud sekundaarseid antikehi inkubeeriti toatemperatuuril. Lõpuks pesti membraane kolm korda 1 x Tris-HCl soolalahusega, mis sisaldas 0,1 protsenti Tween 20, ning signaalid skaneeriti ja visualiseeriti GEL DOC XR Imaging Systemiga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Huvipakkuvate valkude densitomeetriline analüüs viidi läbi ja normaliseeriti p-aktiiniks tarkvaraga GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-aktiini kasutati sisekontrollina.
4.12. Statistiline analüüs
Andmed väljendati keskmisena 土 standardhälbe (SD). Statistilised analüüsid viidi läbi tarkvara SPSS 16.{1}} (Xinjiang Medical University) abil. IC50 väärtuste analüüsimiseks kasutati probitanalüüsi. Erinevuste olulisus arvutati ühesuunalise ANOVA testiga ja statistiliselt oluliseks loeti väärtused, mille p <>
5. Kokkuvõtted
Kokkuvõtteks võib öelda, et C. tubulosa ja selle komponentide ehhinakosiidi ja akteosiidi CPhG-d näitavad märkimisväärset fibroosivastast toimet. Nende hulgas on akteosiidi aktiivsus kõige võimsam, samas kui CPhG-de aktiivsus jääb kahe ühendi vahele. TGF-p1/Smad signaaliülekande aktiveerimise inhibeerimine võib olla aluseks mehhanismiks, mille abil CPhG-d kaitsevad kroonilise maksahaiguse eest, mis on seotud fibroosiga, ning ehhinakosiid ja akteosiid on C. tubulosa tõhusaks fibroosivastaseks materjaliks.
Tänuavaldused:Seda uurimistööd toetas Hiina riiklik loodusteaduste fond (81260624). Autorid soovivad avaldada siirast tänu professor Tao Liule selle töö kirjutamise täiustamise eest.
Autori kaastööd:TL, JZ, S.-PY, LM ja S.-LZ kavandasid ja kavandasid katsed. S.-PY, TL ja JZ analüüsisid andmeid. S.-PY ja JZ kirjutasid käsikirja. TL, LM ja JZ vaatasid käsikirja üle. Kõik autorid lugesid lõpliku käsikirja läbi ja kiitsid selle heaks.
Huvide konfliktid:Autorid ei kinnita huvide konflikti.
Viited
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Maksahaiguste fütomeditsiini väljatöötamine. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.
2. Friedman, SL Haiguse mehhanismid: maksafibroosi mehhanismid ja terapeutilised tagajärjed. Nat. Clin. Harjuta. Gastroenterool Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Rull, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Maksa lipotsüüdid: normaalse roti maksa peamised kollageeni tootvad rakud. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Maksafibroosi pöördumine一Fakt või fantaasia? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Maksafibroosi mehhanismi ja võimalike raviviiside mõistmine. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peeter, H.; Vares; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. In Flora of China, 23. väljaanne; Hiina taimestiku toimetuskomitee: Hiina Teaduste Akadeemia, Peking, Hiina, 2013; lk 1-16.
7. Hiina Rahvavabariigi sanitaarministeeriumi Hiina farmakopöa komisjon. Hiina farmakopöa; 1. osa; Keemiatööstuse kirjastus: Peking, Hiina, 2010; lk. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Roucongrongi (Herba Cistanches Deserticolae) mõju Leigongtengi (Radix et Rhizoma Tripterygii) glükosiidi poolt indutseeritud hiirte reproduktiivtoksilisusele. J. Tradit. Lõug. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. Xinjiangis kasvavalt Tamarix hohenackeri Bunge (Herba Cistanchesi peremeestaim) AKE ja trombotsüütide agregatsiooni inhibiitorid. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Dekstraansulfaadist naatriumi põhjustatud koliidi parandamine hiirtel ehhinakosiidiga rikastatud Cistanche tubulosa ekstraktiga. Fütoter. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimuleerib raku glutatiooni redokstsüklit reaktiivsete hapnikuliikide poolt, mis tekivad H9c2 kardiomüotsüütide mitokondriaalsel hingamisel. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Happeline fosfataas: in vitro toksilisuse testide lõpp-punkt. Vitro rakk. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 moduleerib maatriksi metalloproteinaasi-13 ekspressiooni maksa tähtrakkudes keeruliste mehhanismide abil, mis hõlmavad p38MAPK, PI3- kinaasi, AKT ja p70S6k. Olen. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load reguleerib luu moodustumist ja sklerostiini ekspressiooni TGFp-st sõltuva mehhanismi kaudu. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun seostub onkoproteiiniga Ski ja pärsib Smad2 transkriptsiooni aktiivsust. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Tema, M.; Scott, C.; et al. D-vitamiini retseptor / SMAD genoomne ahel takistab maksa fibrootilist vastust. Cell 2013, 153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Fufang Biejia Ruangani pillide mõju maksafibroosile in vivo ja in vitro. Maailm J. Gastroenterool. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Taimne ravim Sho-saiko-to (TJ-9) suurendab ekspressioonimaatriksi metalloproteinaase (MMP), vähendades metalloproteinaaside (TIMP) koeinhibiitori ekspressiooni roti tähtrakkudes. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY TGF-01 ja tsütokiinide roll maksafibroosi moduleerimisel Sho-saiko-to poolt roti/sapijuha ligeeritud mudelis. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biokeemilised markerid, ekstratsellulaarsed komponendid maksafibroosi ja tsirroosi korral. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Müofibroblastide allikas ja roll maksafibroosis. Lõug. Pharmacol. Bull. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Isheemia-reperfusioonimudel roti seljaajus: rakkude elujõulisuse ja apoptoosi signaalimise uuring. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Nanoosakeste toksilisus ja ülevaade praegustest eksperimentaalsetest mudelitest. Iraan Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
