Paraboea Martinii fenüületanoidglükosiidid kaitsevad roti feokromotsütoomi (PC12) rakke vesinikperoksiidist põhjustatud rakukahjustuse eest
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid
Oksüdatiivne stress mängib teadaolevalt olulist rolli mitmete haiguste patogeneesis. See on seotud Alzheimeri tõve (AD), Parkinsoni tõve (PD), epilepsia ja teiste haiguste etioloogiaga [1–3]. Praegu on AD, PD ja teiste haiguste patogeneesi uurimisel tehtud jätkuvaid edusamme. Kuid kuna AD, PD ja teiste haiguste aluseks olevate molekulaarsete mehhanismide kohta on vähe teadmisi, ei ole nende haiguste tõhusaid ennetus- või ravistrateegiaid rakendatud [4]. H2O2 on reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) oluline komponent. Sellest tulenevalt on H2O2-indutseeritud PC12 rakukahjustus oksüdatiivse stressi kõige sagedamini kasutatav mudel ja seda kasutatakse laialdaselt neuroprotektiivsete mõjude eksperimentaalsetes uuringutes [5]. Heemi oksügenaas 1 (HO-1) ja glutamaat-tsüsteiini ligaas-katalüütiline alaühik (GCLC) on olulised raku antioksüdantsed ensüümid ning mõlemat geeni reguleeritakse allavoolu tuumafaktorist erütroid 2 (Nrf2), mis on kujunemas paljulubavaks ravivahendiks. neuroprotektsiooni sihtmärk [6,7]. Fenüületanoidglükosiidid, mis on saadud ühikust C-6-C-3, sisaldavad palju fenoolseid hüdroksüülrühmi ning neil on märkimisväärne antioksüdantne ja vananemisvastane toime. Viimastel aastatel on uuringud näidanud, et paljud ravimtaimed sisaldavad fenüületanoidglükosiide, millel on märkimisväärne antioksüdantne toime. Näiteks fenüületanoidglükosiidid, mis on saadudHerba cistancheon teada, et need avaldavad AD kognitiivsetele puudujääkidele kaitsvat toimet. Selles uuringus uuriti seotud kaitsemehhanismi, kasutades AD vananemisega kiirendatud kalduv hiire 8 (SAMP8) mudelit. Tulemused näitasid, et fenüületanoidglükosiidide võime leevendada SAMP8 hiirte kognitiivseid puudujääke võib olla seotud sünaptilise plastilisuse edendamisega, mis hõlmab antioksüdantseid protsesse [8]. Selles uuringus eraldati ja puhastati Tectona grandis (tiikpuu) puidusõlmedest kaks fenüületanoidglükosiidi; need ühendid avaldasid märkimisväärset antioksüdantset toimet, mis määrati amperomeetrilise meetodi abil [9]. Lisaks avaldavad Lindernia ruellioides'i kofeoüülfenüületanoidglükosiidühendid annusest sõltuvat antioksüdantset ja superoksiidi aniooni vabu radikaale püüdvat toimet in vitro [10]. Fenüületanoidglükosiidide toimemehhanismid on seotud Nrf2/ARE signaaliraja reguleerimisega, mis mõjutab SOD, CAT, GSH-PX ja teiste antioksüdantsete ensüümide sünteesi [11]. Gesneriaceae perekond, mis sisaldab 150 perekonda ja ligikaudu 3700 liiki, on levinud peamiselt Ida- ja Lõuna-Aasia, Okeaania, Lõuna-Ameerika, Aafrika, Lõuna-Euroopa ja Mehhiko troopilistes ja parasvöötme piirkondades [12].
Gesneriaceae Hiinas. Teatati, et ligikaudu 100 liigil on meditsiiniline efektiivsus ja enamik neist on levinud peamiselt Guangxi ja Guizhou provintsides [13]. Viimastel aastatel on Gesneriaceae taimede uurimine maailma eri piirkondades järk-järgult suurenenud ja leitud on uusi füsioloogilise toimega koostisosi [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt kuulub paraboolide hulka (Gesneriaceae) ja on rohttaim. "The Chinese Traditional Medicine Resource Records" põhjal fikseeriti, et kogu taime kasutatakse ravimina. Lisaks võib see avaldada palju farmakoloogilisi toimeid selliste seisundite korral nagu hematemees, turse, düsenteeria, traumaatiline vigastus ja luumurd [15]. Bai tõestas, et fenüületanoidglükosiidid on Gesneriaceae taimede üks peamisi keemilisi koostisosi [16]. Mõned teadlased on ka leidnud, et fenüületanoidglükosiididel on märkimisväärne antioksüdantne toime [17]. Li näitas, et fenüületanoidglükosiididCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 protsenti) kaheksast fenüülpropanoidglükosiidist mõõdeti HPLC piigi pindala normaliseerimise meetodil. Näitena on joonisel 1 näidatud parabosiidi B ja parabosiidi II kromatograafiatabelid ning nende suhteline sisaldus oli vastavalt 98,23% ja 99,20%. Halvasti diferentseeritud roti neerupealiste feokromotsütoomi rakuliin (PC12) osteti Hiina Teaduste Akadeemia (Shanghai, Hiina) rakupangast. Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) ja hobuseseerum osteti firmalt Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Veise loote seerum (FBS) osteti firmast Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 saadi firmalt Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Hiina). Trizol osteti ettevõttest Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). PrimeScriptTM RT reaktiivikomplekt (Perfect Real Time) saadi ettevõttelt TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Hiina). HO-1, GCLC ja GAPDH praimerid sünteesis Sangon Biotech (Shanghai, Hiina). CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay komplekt (MTS) saadi ettevõttelt Promega Corp. (Madison, USA). HO-1 tsink protoporfüriini (ZnPP) inhibiitorid osteti ettevõttelt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Kasutati ka Thermo311 CO2 inkubaatorit (Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Blocki (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) ja xCELLigence RTCA DPlus Analyzerit ja E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA). .
Cistanche deserticola
Rakukultuur ja ravi
PC12 rakke kasvatati DMEM-is, mis sisaldas 5% FBS-i ja 5% hobuseseerumit, temperatuuril 37 kraadi niisutatud 5% CO2 atmosfääris. PC12 rakud jagati kolme rühma järgmiselt: kontrollrühm, mudelrühm ja ravirühm. Kaheksa fenüülpropanoidglükosiidi lahustati DMSO-s (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
H2O2 määramine
Reaalajas rakuanalüüsi (RTCA) abil määrasime sobiva H2O2 kontsentratsiooni. PC12 rakud külvati CIM-plaadi{5}} mikroplaadile mahuga 100 µL ja inkubeeriti seejärel 12 tundi 37 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris. PC12 rakud jagati kontroll- ja mudelrühmadesse. Järgmisena lisati mudelrühmadele 10 μL H2O2 (50, 100, 200 ja 400 μM) ning kontrollrühmi töödeldi 10 μL täieliku DMEM-iga, mis oli paigutatud kolme komplekssesse süvendisse. E-plaat 16 asetati xCELLigence RTCA-sse, seda jälgiti iga 15 minuti järel ja tulemused registreeriti 32 tundi. H2O2 mõju PC12 rakkudele analüüsiti andmeanalüüsi tarkvara xCELLigence RTCA abil. Optimaalse H2O2 kontsentratsiooni ja toime kestuse määramiseks kasutati rakuindeksi (CI) väärtust.
Ühendite ekstraheerimine ja eraldamine
Fraktsioonid eraldati nende polaarsuse alusel, kasutades eelnevalt kirjeldatud meetodeid. Õhukuivatatud pulbristatud P. martini (4 kg) ekstraheeriti kolm korda järjest 75-protsendilise etanooli vesilahusega [20]. Saadud ekstraktid kontsentreeriti etanooli eemaldamiseks rotaatoraurustiga ja saadi toorekstraktid. Proovid lahustati deioniseeritud vees ja seejärel ekstraheeriti järjestikku petrooleetri, etüülatsetaadi, n-butanooli ja veega. Butanooli ekstrakt (400 g) fraktsioneeriti, kasutades makropoorset vaigu AB-8 kolonni ja etanooli-H2O2 lahust (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 ja 95 protsenti). Lõpuks saadi kuus fraktsiooni (fraktsioonid 1–6). Fraktsioonid 3 ja 4 eraldati, kasutades MCI kolonni MeOH-H2O2 astmelise gradiendiga (10–100 protsenti). Järgmisena eraldati produktid, kasutades eluendina Sephadex LH{27}} 50% MeOH-d. Ühendid 1 (41,0 mg) ja 6 (15,6 mg) eraldati fraktsioonist 3. Ühendid 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) ja 8 (26,0 mg) saadi fraktsioonist 4, kasutades Sephadexi. LH-20 kromatograafia, eluendina 50% MeOH. Lõplikud isolatsioonid viidi läbi poolpreparatiivse pöördfaasi HPLC-ga (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) 50% MeOH ja UV-tuvastusega 280 nm juures, et saada ühendid 4 (39,0 mg) ja 5 (9,0 mg) [20].
Rakkude elujõulisuse test
PC12 rakud külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega 2 × 1{{10}}4 rakku süvendi kohta lõppmahuga 100 µL . PC12 rakke inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2-ga 12 tundi. Järgmisena töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga toorekstraktidega (0,025, 0,05, 0,1, 0,2 ja 0,4 mg/mL) ning ühenditega 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 viiel kontsentratsioonil (3,125, 6,25, 12,5, 25 ja 50 μM). Pärast 24-tunnist eeltöötlust määrati rakkude elujõulisus MTS-testidega. PC12 rakke eelinkubeeriti HO-1 inhibiitoriga või ilma ZnPPta (15 μM) 30 minutit, seejärel inkubeeriti koos kaleolariosiid B, parabosiidi B ja parabosiidi II (3,125 μM) või ilma nendeta 12 tundi ja lõpuks inkubeeriti 400 µM H2O2-ga veel 6 tundi. Pärast töötlemist määrati ellujäänud rakkude arv MTS-testiga [6].
Toorekstraktide ja monomeersete ühendite kaitsev toime H2O2-töödeldud PC12 rakkudele
Rakke kultiveeriti {{0}}süvendiga plaadil lõppmahuga 100 µL. Töödeldud rühmale lisati toorekstraktide seerialahjendused (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 ja 0,4 mg/ml). Pärast 12-tunnist eeltöötlust lisati töödeldud rühmale ja iga süvendi H2O2 rühmale 6 tunniks 400 μM H2O2 lahust (optimaalne kontsentratsioon). Seejärel lisati igasse süvendisse MTS-i lahus ja plaate inkubeeriti 3 tundi temperatuuril 37 °C. Plaate võngutati madalal kiirusel 5 minutit toatemperatuuril, kuni kõik kristallid olid täielikult lahustunud. Rakkude kaitse määrati MTS-testi tulemuste põhjal vastavalt tootja standardile 2204 X. GONG ET AL. Külaline laadis 27. augustil 2021 juhised saidilt https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 alla. Optiline tihedus määrati neeldumise lainepikkusel 490 nm. Lisaks jälgisime fraktsioonidest 3 ja 4 eraldatud ühendite 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 aktiivsust. Ühendite 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 seerialahjendused (3,125, 6,25, 12,5, 25 ja 50 μM) lisati töödeldud rühmale, et määrata nende vastav kaitsev toime H2O2-indutseeritud PC12 rakkudele.
Cistanche deserticola fenüületanoidglükosiidid: kaitseb neuroneid ja takistab vananemist
Kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR)
PC12 rakud koguti 12 tundi pärast töötlemist 3, 125 µM kaleolariosiid B, parabosiidi B ja parabosiid II-ga. Kogu RNA ekstraheeriti TRIzol-reagendiga ja kogu RNA alikvoodid pöördtranskribeeriti, kasutades Primescript RT Master Kitit vastavalt tootja juhistele. Vastavalt eelmisele aruandele [21] kasutati katsetes järgmisi praimereid. HO-1: edasi 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, tagurpidi 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: edasi 5′ – GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, tagurpidi 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: edasi 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, tagurpidi 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Saadud cDNA-de alikvoodid amplifitseeriti seejärel PCR-ga. Reaktsioonitingimused olid järgmised: esialgne denatureerimine 95 kraadi juures (30 s), millele järgnes 40 tsüklit 95 kraadi juures (5 s), 60 kraadi juures (34 s) ja 72 kraadi juures (35 s). Kõiki praimereid testiti ja tuvastati FL fluorestsentssignaal; seejärel arvutati △Ct väärtus ja suhtelisi väärtusi võrreldi kontrollrühma omadega, kasutades järgmist võrrandit: △Ct=Ct (proov) − Ct (endogeenne kontroll), △△Ct {{36} } △Ct (proov) −△Ct (töötlemata) ja kordne muutus=2−△△Ct. Sisekontrollina kasutati glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH).
Valkude ekstraheerimine
PC12 rakud külvati 100- mm tassidele 1 × 107 rakku tassi kohta. Pärast kinnitamist töödeldi rakke 12 tundi vastavalt kaleolariosiid B, parabosiidi B ja parabosiidi II (3, 125 uM). Seejärel glükosiidid eemaldati ja rakke inkubeeriti H202-ga veel 6 tundi. Pärast inkubeerimist pesti rakke kaks korda külma PBS-ga ja kaabiti 1 ml PBS-ga plaatidelt. Rakkude homogenaate tsentrifuugiti kiirusel 1500 p/min 10 minutit. Pärast töötlemist ekstraheeriti rakulised valgud, kasutades Beyotime RIPA rakulüüsipuhvrit 1 mM PMSF-iga vastavalt tootja juhistele. Lisaks eraldati tsütoplasmaatilised ja tuumavalgud, nagu on kirjeldatud Beyotime'i tuuma- ja tsütoplasmaatilise ekstraheerimise komplekti protokollis. Proovide valgukontsentratsioonid tuvastati Beyotime BCA valguanalüüsi komplekti abil ja kõiki proove säilitati Western blot analüüsi jaoks temperatuuril –80 kraadi [6].
Western blot analüüs
SDS-PAGE elektroforees viidi läbi pärast eri rühmade koguvalgu ekstraheerimist ja sellele järgnevat denatureerimist. Pärast elektroforeesi kanti valk PVDF-i membraanidele, mis seejärel blokeeriti 5-protsendilise lõssipulbriga 4 tundi. Pärast pesemist primaarne antikeha (küüliku polüklonaalne antikeha GAPDH (lahjendus 1:10,{5}}), küüliku polüklonaalne antikeha HO-1 (lahjendus 1:1000) või küüliku polüklonaalne antikeha GCLC (lahjendus 1:1000) membraanidele lisati, mida inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C. Järgmisel päeval pesti PVDF membraane kolm korda TTBS-s. Järgmiseks lisati sekundaarne antikeha (konjugeeritud afiinsusega puhas kitse küülikuvastane IgG (lahjendus 1:1000), mis oli märgistatud Membraanidele lisati mädarõika peroksidaas, mida inkubeeriti seejärel toatemperatuuril 2 h PVDF-i membraane pesti ja neile rakendati ECL kemoluminestsentsi tuvastamise reagenti, et anda märku kokkupuutest röntgenkiirtel, mis seejärel fikseeriti ja skaneeriti [22].
Statistiline analüüs
Andmeid analüüsiti SPSS 19.0 abil ja tulemused on esitatud kolme sõltumatu katse standardhälbega (SD) keskmistena. Väärtused p < 0,05="" viitavad="" statistiliselt="" olulistele="">
Tulemused H2O2 mudeli loomine
Nagu on näidatud joonisel 2, ei põhjustanud H2O2 kontsentratsioonis 50, 100 ja 200 μM sobival tasemel rakusurma. Kuid 400 μM H2O2 toimis PC12 rakkudele 2–6 tunni jooksul ja rakkude oksüdatiivne kahjustus kippus olema stabiilne. Seetõttu arvasime, et induktsioon H2O2-ga kontsentratsioonis 400 μM 6 tunni jooksul oli sobiv PC12 rakkude oksüdatiivsest stressist põhjustatud vigastuse jäljendamiseks.
Toorekstraktide kaitsev toime H2O2-ga töödeldud PC12 rakkudele
Võrreldes H2O2 mudelirühma omaga (joonis 3), n-butanooli ekstrakti kontsentratsioonides 0.05, 0.1, {{10} },2 ja 0,4 mg/mL parandasid oluliselt H2O2 poolt indutseeritud PC12 rakkude oksüdatiivset kahjustust (p < 0.05)="" kontsentratsioonist="" sõltuval="" viisil.="" need="" andmed="" viitasid="" sellele,="" et="" n-butanooli="" fraktsioon="" sisaldas="" tugevamat="" kaitset.="" siiski="" näitasid="" petrooleetri="" ja="" etüülatsetaadi="" ekstraktid="" kaitsvat="" toimet="" ainult="" kõrgetel="" kontsentratsioonidel="" (petrooleeter:="" 0,1="" ja="" 0,2="" mg/ml,="" p="">< 0).{31}="" }5;="" etüülatsetaat:="" 0,2="" ja="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" lisaks="" ei="" näidanud="" vesifaasi="" ekstraktide="" erinevad="" kontsentratsioonid="" kaitsvat="" toimet="" (p=""> 0,05). Lisaks oleme lisafaili lisanud andmeid valideerimisuuringust, milles kasutati inimese neuroblastoomi SH-SY5Y rakuliine (SH-SY5Y). Töötlemine 250 μM H2O2-ga põhjustas rakkude elujõulisuse vähenemise; ravi kaleolariosiid B, parabosiid B ja parabosiid II (3,125, 6,25, 12,5, 25 ja 50 μM) vähendas aga oluliselt SH-SY5Y rakusurma. Katse tulemused tõestasid, et kaleolariosiid B, parabosiid B ja parabosiid II kaitsesid SHSY5Y rakke H2O{52}}indutseeritud rakukahjustuse eest.
Butanooli fraktsioonist eraldatud ühendite struktuurid
Kinnitamaks, et n-butanooli ekstrakt sisaldas aktiivseid komponente, fraktsioneerisime ekstraheerimisest veel kaheksa ühendit. Ühendite 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 struktuurid identifitseeriti erinevate spektriandmetega (1H-NMR, 13C-NMR ja ESI-MS), mis põhinesid võrdlusel parabosiidi A kohta avaldatud andmetega. , vastavalt parabosiid B, parabosiid I, parabosiid II, parabosiid III, nuomiosiid A, kaleolariosiid B ja isonuomiosiid A [20]. Näiteks parabosiidi B kohta olid andmed järgmised: pruun kummi; ½ 20 D -55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm-1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm-1 [20] 1H ja 13C NMR spektroskoopiliste üksikasjalikud andmed on näidatud viites 20; HR-ESI-MS (negatiivne) m/z 741,2231 [MH]− (arvutatud C33H41O19 jaoks, 741,2242) [20]. Andmed parabosiidi II kohta olid järgmised: valged amorfsed pulbrid; ½ 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm-1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm-1 [20]; 1H ja 13C NMR spektroskoopiliste üksikasjalikud andmed on näidatud viites 20; ESI-MS (negatiivne) m/z 637
Eraldatud ühendite kaitsev toime H2O2-indutseeritud toksilisuse vastu PC12 rakkudes
MTS-teste kasutati selleks, et uurida eraldatud ühendite mõju H2O2-indutseeritud toksilisusele avatud PC12 rakkude elujõulisusele. Nagu on näidatud joonisel 5, olid PC12 rakud kontrollrühmaga võrreldes eeltöödeldud viie erineva kontsentratsiooniga kaleolariosiid B, parabosiidi B, parabosiid II või parabosiid A (3,125, 6,25, 12,5, 25 ja 5)0 μM) 24 tunni jooksul ei näidanud olulisi erinevusi rakkude elujõulisuses (p > 0,05). Seega ei põhjustanud PC12 rakkude eeltöötlemine kaleolariosiid B, parabosiid B ja parabosiid II-ga tsütotoksilisust. Nagu on näidatud joonisel fig 6, vähendas 400 uM H2O2 oluliselt rakkude elujõulisust võrreldes kontrollrühma elujõulisusega. Peale selle suurenes H2O2--ga töödeldud PC12 rakkude elujõulisus märgatavalt pärast PC12 rakkude eeltöötlemist kaleolariosiid B, parabosiid B ja parabosiid II erineva kontsentratsiooniga; peale selle oli rakkude elujõulisus kõrgeim pärast töötlemist 50 uM kaleolariosiid B, 50 uM parabosiid B ja 12,5 uM parabosiid II-ga. Ülejäänud viiel ühendil ei ilmnenud H2O2-töödeldud PC12-rakkudele olulist kaitsvat toimet. Selle leiu illustreerimiseks käsitleme ühte neist näitena, samas kui teisi ei ole käsikirjas kirjeldatud.
HO-1 ja GCLC transkriptsioonitasemed
Järgmisena testisime HO{{0}} ja GCLC transkriptsioonitasemeid PC12 rakkudes, mida töödeldi kaleolariosiid B, parabosiid B ja parabosiid II-ga. Kogu mRNA koguti töödeldud ja töötlemata PC12 rakkudest 12 tundi ja seejärel allutati ekspressioonianalüüsile qRT-PCR abil. Nagu on näidatud joonisel 7 (a, c, e), tõusid HO-1 transkriptsioonitasemed märkimisväärselt pärast seda, kui PC12 rakke töödeldi näidatud kontsentratsioonidega kaleolariosiid B, parabosiidi B ja parabosiid II 12 tundi (p < 0.05).="" nagu="" on="" näidatud="" joonisel="" fig="" 7="" (b),="" tõusid="" gclc="" transkriptsioonitasemed="" märkimisväärselt="" ka="" pc12="" rakkudes,="" mida="" oli="" eelnevalt="" töödeldud="" näidatud="" kaleolariosiid="" b="" kontsentratsioonidega="" 12="" tundi.="" kuid="" gclc="" tasemed="" pc12="" rakkudes,="" mida="" oli="" eelnevalt="" töödeldud="" parabosiid="" b-ga="" 12="" tundi,="" vähenesid="" oluliselt="" võrreldes="" mudelrühma="" omadega="" (p="">< 0,05;="" joonis="" 7(d)).="" lisaks="" ei="" erinenud="" parabosiid="" ii="" töötlemisel="" gclc="" tasemed="" pc12="" rakkudes="" oluliselt="" mudelrühma="" omadest="" (p=""> 0,05; joonis 7 (f)).
HO-1 ja GCLC väljend
HO{{0}} ja GCLC on olulised raku antioksüdantsed ensüümid ning mõlemad on Nrf2-reguleeritud allavoolu geenid. HO-1 ja GCLC valgu ekspressiooni täheldati ka pärast töötlemist [6]. Joonis 8 näitab HO-1 ja GCLC valgu taset PC12 rakkudes pärast töötlemist 400 µM H2O2-ga; tulemused näitasid, et HO-1 FL fluorestsentsi intensiivsused kaleolariosiid B ja parabosiid B rühmas olid suuremad kui H2O2- töödeldud rühmades (joonis 8(a, c)). Kuid ühendid, välja arvatud kaleolariosiid B, GCLC ekspressiooni oluliselt ei muutnud (joonis 8 (b)). Järgmisena kasutati HO-1 keemilisi inhibiitoreid, et hinnata täiendavalt antioksüdantsete ensüümide rolli kaleolariosiid B, parabosiid B või parabosiid II H2O2-indutseeritud tsütotoksilisuse vastu kaitsva toime reguleerimisel. Kaleolariosiid B, parabosiid B ja parabosiid II (3,125 µM) hoidsid ära H2O2-indutseeritud tsütotoksilisuse, kuid HO-1 inhibiitor ZnPP (p < 0,01)="" muutis="" sellised="" kaitsvad="" toimed="" 15="" µm="" juures="" (joonis="" 8).="">
Cistanche'i eelised: Suurendage meeste paljunemist
Arutelu
Rahvastiku vananemine on tõsine ülemaailmne probleem. Paljud haigused on seotud seniilsusega, näiteks AD ja PD, mis on tõsiseks ohuks rahvatervisele. AD ja PD on südame-veresoonkonna haiguste ja vähi järel tõusnud surmavamate haiguste seas maailmas kolmandaks. Seetõttu on neurodegeneratsioonist saanud kogu maailmas pakiline uurimisteema. Kesknärvisüsteemi neurodegeneratiivsete haiguste AD ja PD patogenees on aga jäänud siiani ebaselgeks. Lisaks on ainult mõned ravimid, mis suudavad tõhusalt ravida AD või PD nende keerukate patogeensete mehhanismide tõttu [23]. Varasemad uuringud näitasid, et ROS, nagu superoksiidi anioon (O2−) ja H2O2, on peamised neurodegeneratiivseid haigusi soodustavad tegurid. Patoloogilised muutused PD ajal hõlmavad neuronaalset degeneratsiooni ning substantia nigra ja striataalse dopamiini surma [24, 25]. Sellest tulenevalt on oluline välja töötada tõhusad antioksüdantsed ravimid PD raviks ja sellistest ravimite avastamisest on saanud oluline uurimissuund [26]. Praegu näib Nrf2 / ARE signaalirada olevat kõige olulisem endogeense antioksüdandi stressirada [27]. Ares asub geenide, nagu HO-1 ja GCLC [28,29], 5′-täituvates piirkondades. HO-1 ja GCLC on Nrf{15}}seotud geenid, mida reguleeritakse sellest valgust allavoolu [6]. ARE-d võivad seejärel mõjutada antioksüdantide taset ja aktiveerida HO-1 ja teiste kaitsvate geenide allavoolu ekspressiooni, mis võib suurendada raku kaitset [30,31]. Lisaks näitasid leiud, et resveratrooli kaitsev toime A {{2{{50}}}} põhjustatud toksilisuse vastu PC12 rakkudes ilmneb HO-1 ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu rakusisese Nrf2 aktiveerimise kaudu. signaalirada [32]. PC12 rakud on närvirakkude aktsepteeritud mudel ja neid kasutatakse laialdaselt neuroprotektiivse toime uuringutes [33]. H2O2 võib kergesti läbida rakumembraani ja ühineda rauaga, moodustades väga aktiivseid vabu radikaale, mis kutsuvad esile oksüdatiivse stressi ja rakukahjustusi [34]. H2O2 on oluline ROS ja vabad radikaalid on kergesti tekkivad ja suhteliselt stabiilsed, seega kasutatakse neid tavaliselt oksüdatiivse stressi mudeli loomiseks PC12 rakkude abil [5]. Selles uuringus kaitses PC12 rakkude eeltöötlemine taimeekstrakti mittetoksiliste kontsentratsioonidega rakke H2O2- indutseeritud tsütotoksilisuse eest, vähendades ROS-i teket. Fenüületanoidglükosiidid sisaldavad palju fenoolseid hüdroksüülrühmi, millel on antioksüdant ja vananemisvastane toime. Selles uuringus leidsime, et n-butanooli ekstraheerimine andis parema kaitse kui teised polaarsusega fraktsioonid (joonis 3). Seega sõelusime täiendavalt kaheksa n-butanooli fraktsioonist eraldatud ühendi kaitsvat toimet. Tulemused näitasid esimest korda, et joonis 8. HO-1 ja GCLC valgu tasemete analüüs PC12 rakkudel. (a) Laadimiskontrollina kasutati HO-1 ja GCLC ja GAPDH ekspressiooni Western blot analüüsi. (b) Western blot analüüs GCLC valgu ekspressioon. (c) Western blot analüüs HO-1 valgu ekspressioon. (d) HO-1 inhibiitor ZnPP vähendas neuroprotektiivset toimet. Andmed on esitatud keskmistena ± SD, n=3. ***p < 0.001="" versus="" kontrollrühm;="" #p="">< 0,05="" versus="" h2o2="" rühm="" (ilma="" znpp-ga="" töödeldud),="" ##p="">< 0,01="" versus="" h2o2="" rühm="" (ilma="" znpp-ga="" töödeldud),="" ###p="">< 0,001="" versus="" h2o2="" rühm="" (ilma="" znpp-ga="" töödeldud);="" ja="" p="">< 0,01,="" võrreldes="" h2o2="" rühmaga="" (töödeldud="" znpp-ga)="" ja="" &p="">< 0,001="" versus="" h2o2="" rühmaga="" (töödeldud="" znpp-ga).="" (kontrollrühm;="" mudelirühm:="" h2o2;="" znpp="" negatiivne="" rühm:="" kaleolariosiid="" b="" pluss="" h2o2,="" parabosiid="" b="" pluss="" h2o2,="" parabosiid="" ii="" pluss="" h2o2;="" znpp="" positiivne="" rühm:="" znpp="" pluss="" kaleolariosiid="" b="" pluss="" h2o2,="" znpp="" pluss="" parabosiid="" b="" pluss="" h2o2,="" znpp="" pluss="" parabosiid="" ii="" pluss="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" külaline="" 27.="" augustil="" 2021="" saidilt="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" alla="" laadinud="" kaleolariosiid="" b,="" parabosiid="" b="" ja="" parabosiid="" ii="" omavad="" märkimisväärset="" kaitset="" h2o2-="" indutseeritud="" oksüdatiivse="" toime="" eest="" pc12="" rakkude="" kahjustus.="" tulemused="" näitasid="" ka,="" et="" h2o2-ravi="" kutsus="" esile="" olulise="" pc12-rakkude="" vigastuse="" ja="" vähendas="" rakkude="" elujõulisust,="" samas="" kui="" ravi="" kaleolariosiid="" b,="" parabosiid="" b="" ja="" parabosiid="" ii="" leevendas="" neid="" mõjusid="" märkimisväärselt="" (joonis="" 6).="" eelmises="" uuringus="" teatati,="" et="" nrf2/are="" rada="" on="" üks="" olulisemaid="" endogeenseid="" antioksüdantide="" radu="" ja="" võib="" rakkude="" kaitsmiseks="" ülesreguleerida="" allavoolu="" markerite,="" nagu="" ho-1,="" ekspressiooni="" [7].="" qrt-pcr="" ja="" western="" blot="" analüüside="" tulemused="" näitasid,="" et="" kaleolariosiid="" b,="" parabosiid="" b="" ja="" parabosiid="" ii="" reguleerisid="" oluliselt="" ho-1="" taset.="" kuid="" gclc="" transkriptsioonitasemed="" tõusid="" märkimisväärselt="" kaleolariosiid="" b-ga="" eeltöödeldud="" pc12="" rakkudes,="" kuid="" langesid="" parabosiid="" b-ga="" eeltöödeldud="" rakkudes="" võrreldes="" mudelrühmaga.="" lisaks="" ei="" muutnud="" parabosiid="" ii="" selle="" markeri="" ekspressiooni="" võrreldes="" mudelirühma="" omaga="" (joonised="" 7="" ja="" 8="" (a–c)).="" lisaks="" muutis="" ho-1="" inhibiitor="" znpp="" kaleolariosiid="" b,="" parabosiid="" b="" ja="" parabosiid="" ii="" kaitsva="" toime="" h2o2-indutseeritud="" pc12="" rakukahjustuse="" vastu="" (joonis="" 8(d)).="" kokkuvõtteks="" võib="" öelda,="" et="" fenüületanoidglükosiidid="" kaleolariosiid="" b,="" parabosiid="" b="" ja="" parabosiid="" ii="" kaitsesid="" tõhusalt="" pc12="" rakke="" h2o{113}}indutseeritud="" oksüdatiivsete="" kahjustuste="" eest.="" seega="" võivad="" need="" p.="" martinist="" eraldatud="" ühendid="" olla="" potentsiaalsed="" ravimikandidaadid="" neurodegeneratiivsete="" haiguste="">
Cistanche'i eelised:neurodegeneratiivsete haiguste ravi
Viited
[1] Butterfield DA. Alzheimeri tõve oksüdatiivse stressi väljavaated ja tulevaste uuringute rõhuasetuste prognoosid. J Alzheimeri dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D jt. Oksüdatiivne stress ja amüloid-beeta peptiid Alzheimeri tõve korral. Redox Biol. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y jt. Dopamiinergiliste neuronite kahjustus Parkinsoni tõve oksüdatiivse stressi tõttu (ülevaade). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH jt. rs823128, rs1572931 ja rs823156 polümorfismide seos, mis vähendab Parkinsoni tõve riski. Neuroreport. 2017; 27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX jt. 7,8-dihüdroksüflavooni antioksüdantne toime kaitseb PC12 rakke 6-hüdroksüdopamiini poolt indutseeritud tsütotoksilisuse eest. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F jt. Nelja fenüületanoidglükosiidi neuroprotektiivne toime H2O2-indutseeritud apoptoosile PC12 rakkudel Nrf2/ARE raja kaudu. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E jt. Nrf2-ARE rada: esilekerkiv sihtmärk oksüdatiivse stressi ja neurodegeneratiivsete haiguste neuropõletiku vastu. Farmakoloogiline teraapia. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP jt. Fenüületanoidglükosiidide mõju, mis on saadudHerba cistanchekognitiivsete puudujääkide ja antioksüdantide aktiivsuse kohta isastel SAMP8 hiirtel. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE jt. Fenüületanoidglükosiidid tiikpuu oksadest ja nende antioksüdantne toime. J Biol Active Prod Nat. 2016; 6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ jt. Lindernia ruellioides'i kofeoüülfenüületanoidglükosiidühendite antioksüdantne toime in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L jt. Nrf2-ARE raja roll oksüdatiivse stressikahjustuse korral ja selle seos teiste signaaliradadega. Anim Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS jt. Edusammud Gesneriaceae uurimisel. Chin J Uus ravim. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Gesneriaceae taime uurimistöö edusammud. Chin Wild Plant Resource. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM jt. Gesneriaceae taimede triterpenoidide uurimise edenemine. Nat Prod Res Dev. 2012; 24:698–701.
[15] Hiina taimsete ravimite ettevõte. Hiina traditsioonilise meditsiini ressursi kirjed. Hiina: Science Press; 1994. aasta.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG jt. Fenüületanoidglükosiidide jaotus Gesneriaceae ravimtaimedes. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX jt. Brandisia hancei fenüületanoidglükosiidide antioksüdantne toime. J Etnopharmacol. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG jt. Uuring antioksüdantse toime kohtaCistanche deserticola fenüületanoidglükosiidid. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y jt. Kaitsev toimecistanche glükosiididPC12 rakkude kahjustuste kohta PARABOLA MARTINI PROTECT PC12 CELLS VEE EEST 2-PÕHJUSTATUD VIGASTUS 2211
