Osa nr
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
3-metüülbutenüülrühma, aglükooni alamstruktuuri, viitasid H-2 COZY korrelatsioonid H-1a ja H-1b ning HMBC korrelatsioonid H{{ vahel. 4}} ja H-5 ning olefiinsed süsinikud kC juures 120,7 (C-2) ja 136,4 (C-3). Kaks suhkruosa määrati happe hüdrolüsaadi NMR spektri analüüsi ja HPLC spektri analüüsiga MS fragmendi mustriga. Happelise hüdrolüsaadi HPLC analüüsi abil määrati nende absoluutseks konfiguratsiooniks D-glükoos ja L-ramnoos [17]. Anomeersete prootonite konstantide sidestamise teel määrati need suhkruosad -glükoosiks ja a-ramnoosiks. 1H-1H COZY spekter näitas järjestikuseid korrelatsioone H-13-st H-63-ni ja H-133-st H-633-ni (joonis 4).
Alla nihutatud glükoosi prooton kH 4,70 (H-43) juures viitas glükoosil atsüülasendajale. HMBC spektri põhjal kinnitas korrelatsioon H-43 ja C-9333 vahel kofeoüülasendaja asukohta. HMBC korrelatsioonid H-13 ja C-1 (kC 64,5) ning H-33 (kH 3,68) ja C-133 (kC 101,2) vahel näitasid iga asendaja asukohti . Vastavalt sellele määrati ühendi 6 struktuur kui 3-metüülbutenüül-O- -L-ramnopüranosüül-(1→3)-4-O-(E)-kofeoüül- -D- glükoos-püranosiid ja nimega tsistansalsiid B.
Tsistansalsiid C (12), pruun amorfne pulber, määrati (pluss )-HR-ESI-QTOF-MS abil oma molekulvalemiks C26H38O13, mis näitas piiki m/z juures 581,2213 [M pluss Na] pluss (arvut. C26H38O13Na jaoks, 581,2205). Iseloomulik ioon m/z 163 juures viitas sellele, et struktuuris oli kofeoüülasendus. Fragmendi ioonid m/z 325 ja m/z 471 juures viitasid ramnoosiühiku ja glükoosiühiku olemasolule.
NMR spektrite 12 võrdlus 6 omadega näitas, et need olid sarnased, välja arvatud aglükooni struktuur. NMR-spektrites 12 täheldati kahe olefiinse süsiniku asemel kahte parafiinset süsinikku temperatuuril kC 38.0 (C-2) ja 24,4 (C-3) kahe olefiinse süsiniku asemel temperatuuril kC 12{{16 }},7 (C-2) ja 136,4 (C-3) 6 aglükoonis. Idu metüülrühmad (kH 0,88) 12 aglükoonis nihutati ülespoole. H-4 ja H-5 (kH 1,71 ja 1,63) suhtes 6 aglükoonis (tabel 2). Ühendi 12 aglükooniks arvati olevat 3-metüülbutüülrühm, mida kinnitasid 1H ja COZY NMR spektrid. 3-metüülbutüülrühma piigid täheldati 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m) juures. , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) ja 0,88 (H-4, 5).
Happe hüdrolüsaadi HPLC analüüsi ja NMR spektri analüüsi ning MS fragmendi mustri abil kinnitati veel kord kahte suhkruosa. Suhkrute absoluutsed konfiguratsioonid identifitseeriti D-glükoosi ja L-ramnoosina, kasutades happehüdrolüsaadi HPLC analüüsi [17]. A-glükoosiosa ja a-ramnoosi fragmenti kinnitati anomeersete prootonite sidestuskonstantide abil. 1H-1H COZY spekter näitas järjestikuseid korrelatsioone vahemikus H-13 kuni H-53, H-133 kuni H-333 ja H{{11} } kuni H-433 (joonis 4).
Asendajate asukohta kinnitati HMBC analüüsi abil. HMBC spektris korrelatsioonid H-13 ja C-1 (kC 67,2), H-33 (kH 3,68) ja C-133 (kC 101,2) vahel ning korrelatsioonid Tuvastati H-43 (kH 4,70) ja C-9333 (kC 165,7). Järelikult määrati 12 struktuuriks 3-metüülbutüül-OaL-ramnopüranosüül-(1→3)-4-O-(E)-kofeoüül- -D-glükoosipüranosiid ja nimega cistansalside C.
Tsistansalsiid D (17), amorfne pruun pulber, määrati positiivse režiimi kõrge eraldusvõimega ESI-QTOF-MS abil, mille molekulvalem on C31H38O14, mis näitas aduktioonide piiki m/z juures 657,2147 [M pluss Na] pluss (arvutatud C31H38O14Na jaoks, 657,2154). Fragmendi ioonid, sealhulgas [M pluss H x Aglükoon x Rha x Atsetüül Glc] pluss ioon m/z 147 juures, [M pluss H x Aglükoon x Rha] pluss ioon m/z 351 ja [M pluss H x Aglükoon] Lisaks tuvastati ka ioon m/z 497 juures. Iseloomulik ioon m/z 147 juures viitas sellele, et selle struktuuris oli kumaroüülasendus. Fragmendi ioonid m/z 351 ja m/z 497 juures viitasid ramnoosiühiku ja atsetüülasendatud glükoosiühiku olemasolule.
Cistansalside alatescistanche ürt
13C-NMR spekter näitas 31 süsinikuaatomi olemasolu. 1H ja HSQC spektris täheldati kahte anomeerset prootonit kH 4,61 (1H, m, H-13) ja 4,60 (1H, s, H{{10}}) juures . 1H-NMR spekter näitas metüülrühma olemasolu 1,97 juures (3H, s, atsetüül-CH3), trans-olefiini olemasolu kH juures 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) ja 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) ning kaks paraasendatud benseenitsüklit kH 7,53 (2H, d, J=6 juures). 9 Hz, H-3333, 5333) ja 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, d, J {{5) 0}},0 Hz, H-2, 6) ja 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (tabel 2) . HMBC NMR spektri korrelatsioonid karbonüülsüsiniku vahel kc 165,5 (C-9333) ja H-8333 ning H-2333, 6333 ja C-7333 (kc) vahel 145,4) soovitas (E)-kumaroüülrühma. HMBC korrelatsioon metüülprootoni piigi ja karbonüülsüsiniku vahel kc 169,0 juures kinnitas atsetüülrühma olemasolu.
4-hüdroksüfenüülrühm pakuti välja HMBC korrelatsioonide põhjal H-3, 5 ja kvaternaarsete aromaatsete süsiniku vahel kC 155,6 (C-4) ja 128,6 (C-1) juures. . Hüdroksüülitud etüülrühm kinnitati COZY NMR signaalide järgi kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1 H, m, H-8) juures. ) ja 3,54 (1 H, m, H-8b). HMBC korrelatsioonid H-7 ja C-1 (kC 128,6) ja C-2, 6 (kC 129,7) vahel viitasid 4-hüdroksüfenüületüülrühmale aglükooni alamstruktuurina.
Happe hüdrolüsaadi ja NMR spektrite HPLC analüüsiga kinnitati kaks suhkruosa, mis on välja pakutud MS fragmendi mustri põhjal. D-glükoosi ja L-ramnoosi selgitamiseks kasutati happehüdrolüsaadi HPLC analüüsi [17]. Glükoosiosa ja a-ramnoosi fragment määrati anomeersete prootonite konstantide sidestamisel. 1H-1H COZY spekter näitas järjestikuseid korrelatsioone H-13-st H-53-ni ja H-133-st H-633-ni (joonis 4).
1H-NMR spektri põhjal viitas H-23 (kH 4,69) ja H-43 (kH 4,80) nihe allapoole, et glükoosil on atsüülasendatud asend. Glükoosi ja kahe atsüülrühma vahelisi seoseid kinnitasid HMBC korrelatsioonid H-43 (kH 4,80) ja C-9333 ning H-23 ja atsetüülrühma karbonüülsüsiniku (kC 169,0) vahel. ). Aglükooni ja ramnoosi asukohad määrati HMBC korrelatsioonide abil H-33 (kH 3,95) ja C-1333 ning H-8 ja C-13 vahel. Vastavalt sellele määrati ühendi 17 struktuur 4-hüdroksüfenüületüül-2-O-atsetüül-O- -L-ramnopüranosüül-(1→3)-4-O-(E)- kumaroüül- -D-glükopüranosiid ja nimega tsistansalsiid D.
Tsistansalsiid E (18) eraldati amorfse pruuni pulbrina. Selle molekulaarvalemiks määrati 13C-NMR andmetel C31H38O14 ja positiivse režiimi kõrge eraldusvõimega ESI-QTOF-MS piik m/z juures 657,2166 [M pluss Na] pluss (arvutatud C31H38O14Na jaoks, 657,2154). Lisaks tuvastati ka fragmendi ioonid, sealhulgas kofeoüülioon m/z 163 juures, [M pluss H x Aglükoon x Rha] pluss ioon m/z juures 367 ja [M pluss H x Aglükoon]ioon m/z 513 juures. Fragmendi ioonid viitasid ramnoosiühiku ja atsetüülasendatud glükoosiühiku olemasolule.
1H-NMR spekter viitas kahe anomeerse prootoni olemasolule kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) ja 4,60 (1H, s, H{11}} juures) ) ja kaks atsüülasendatud glükoosi prootonit kH 4,71 (1 H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) ja 4,81 (1 H, dd, J=9,7) juures , 9,5 Hz, H-43). 1H ja HMBC spektrid viitasid atsetüülrühma olemasolule kH 1,94 juures (3H, s, atsetüül-CH3), (E)-kofeoüülrühma olemasolule kH 7,48 (1 H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1 H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1 H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1 H, d, J=8,1 Hz, H-5333) ja 6,21 (1 H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) ja monoasendatud benseenitsükkel kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) ja 7,20 (1 H, m, H-4) (tabel 2). Fenüülmetüülrühma, aglükooni alamstruktuuri, viitasid HMBC korrelatsioonid H-7 (2H, kH 2,80, m) ja C-1 (kC 138,8) ning H-7 ja C vahel. -2, 6 (kC 128,9) ja H-7 COZY NMR signaalid koos H-8a (1H, kH 3,99, m) ja H-8b (1H, kH 3,63, m).
Happe hüdrolüsaadi HPLC analüüsi ja NMR spektri analüüsiga kinnitati veel kord kaks suhkruosa. Suhkrute absoluutsed konfiguratsioonid selgitati happehüdrolüsaadi HPLC analüüsi abil, milleks kinnitati D-glükoosi ja L-ramnoos [17]. Glükoosiosa ja -ramnoosi fragment määrati anomeersete prootonite konstantide sidestamisel. 1H-1H COZY spekter näitas järjestikuseid korrelatsioone vahemikus H-13 kuni H-53, H-133 kuni H-233 ja H{{11} } kuni H-333 (joonis 4).
HMBC spektrist korrelatsioonid H{{0}} ja C-8 (kC 69,4), H-23 ja atsetüülrühma karbonüülsüsiniku (kC 169,1) vahel H-33 (kH 3,95) ja C-133 (kC 102,0) ning H-43 (kH 4,81) ja C-9333 (kC 165,6) vahel kinnitasid asendajate positsiooni struktuur. Seetõttu määrati ühendi 18 struktuuriks fenüületüül-2-O-atsetüül-OaL-ramnopüranosüül-(1→3)-4-O-(E)-kofeoüül- -D-glükopüranosiid ja nimega cistansalside E.
Enamik trans-cinnamoüülasendajaid isomeeriti in vitro cis-isovormiks. On teatatud, et valgus muudab trans-kaneelhappe derivaadid cis-isovormideks [18, 19]. Täheldati, et kanemoüülasendajate trans-cis-konversiooni tasakaal säilitas ligikaudu 70 protsenti isolaatidest trans-isovormis. Cis-vormi olefiini prootonite puhul on piigid ligikaudu 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) ja 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) olid määratavad 1H-NMR spektrites, kusjuures piigid olid ligikaudu 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) ja 6,40 ppm (d, J {) juures. Teisenduse [20] puhul täheldati {28}},8 Hz, H-8333). Trans-cis segude 1H-NMR spektris täheldati kahe olefiinse prootoni (H-7333 ja H-8333) piike vahekorras 7:3 (trans:cis). Cis-vormi13C-NMR piigid olid sarnased transformatsiooni omadega.
Tsistanche'i tõhusad koostisosad: akteosiidid
Kõiki isolaate testiti nende inhibeeriva toime suhtes LPS-indutseeritud NO tootmisele RAW-s
Kõiki isolaate testiti nende inhibeeriva toime suhtes LPS-indutseeritud NO tootmisele RAW 264.7 rakkudes. Positiivse kontrollina kasutati deksametasooni ja selle IC50 oli 7.0 uM. Testitud ühenditest ühendid 5 (IC50 42,7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37,3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) ja 18 (IC50 27,9 o 0,8 uM) näitasid mõõdukat inhibeerivat toimet indutseeritava NO süntaasi suhtes, samas kui teised ühendid olid selles testis inaktiivsed (IC50). väärtused > 100 uM). Et kontrollida, kas neil ühenditel oli tsütotoksilisust, mõõdeti rakkude elujõulisust MTT testiga. Selle tulemusena ei ilmnenud ühelgi neist märkimisväärset tsütotoksilisust (täiendav joonis S6-1). Need neli ühendit valiti välja, et hinnata nende inhibeerivat toimet NF-λB raja vastu LPS-stimuleeritud RAW 264.7 rakkudes. RAW 264.7 rakkude stimuleerimine LPS-ga kutsus esile I΅B ja NF-΅B (p65) fosforüülimise pärast 0,5 tundi kestnud inkubeerimist. NF-入 B (p65) fosforüülimist vähendas märkimisväärselt eeltöötlemine ühenditega 11, 13 ja 18, nagu näitas Western blot analüüs (joonis 5). Seetõttu võivad ühendid 11, 13 ja 18 avaldada NF-΅B inhibeerimise kaudu makrofaagides põletikuvastast toimet.
Joonis 5.Nelja ühendi mõju I΅B ja NF-΅B (p65) fosforüülimisele LPS-stimuleeritud RAW 264.7 rakkudes. (A) Western blot analüüsid viidi läbi LPS ja prooviga töödeldud RAW 264.7 rakkudes; (B, C) Immunobloti signaalid kvantifitseeriti, kasutades Molecular Analyst/PC densitomeetria tarkvara (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Teatatud on fosforüülitud isovormide densitomeetrilisest analüüsist. NF-入 B RAW 264.7 rakus normaliseeriti -aktiini sisaldusele.
3. Materjalid ja meetodid
3.1. Üldine eksperiment Menetlus
Optilisi pöördeid mõõdeti Jasco P-2000 digitaalse polarimeetriga (Jasco, Tokyo, Jaapan). UV-spektrid registreeriti spektromeetril Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). IR-spektrid registreeriti Jasco FT/IR-4200 spektrofotomeetriga. Kõrge eraldusvõimega elektropihustusionisatsiooni kvadrupool-lennuaja massispektromeetria (HR-ESI-qTOF-MS) viidi läbi Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS-ga, mis oli varustatud Agilent 1260 Infinity seeriaga (Agilent Technologies, Inc. Technologies). , Palo Alto, CA, USA) ja kasutatud kolonn oli Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4,6 mm, 5 um). Andmete kogumiseks kasutati tarkvara MassHunter Workstation.
1D (1H ja 13C) ja 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR spektrid saadi seadmega Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Jaapan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 ja Bruker AVANCE 800 HD spektromeetrid koos krüosondiga (Bruker, Ettlingen, Saksamaa). NMR lahusti ja võrdluspiikidena (kH 2,50 ja kC 39,5) kasutati DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Cistanche Andover, MA, USA). Kolonnkromatograafia (CC) viidi läbi, kasutades Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Rootsi) või Kieselgel 60 silikageeli (40–63 um, 230–400 võrgusilma, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Saksamaa). Õhukesekihikromatograafia (TLC) viidi läbi eelnevalt kaetud Kieselgel 60 silikageeliga F254 plaatidel (Art. 5715; Merck). Laigud TLC-l tuvastati UV-lambi abil lainepikkustel 254 nm ja 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Prantsusmaa). Keskrõhu vedelikkromatograafia (MPLC) viidi läbi RediSep 120 g ränidioksiidi kiirkolonnis (Isco, Lincoln, NE, USA) ja Kiesegel 60 silikageelil (40–63 um, 230–400 mešši, art. 9385; Merck), kasutades Combiflashi kaaslane (Isco). Kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) süsteem oli Gilson HPLC, mis oli varustatud Gilson 321 pumba ja UV.VIS 151 detektoriga (Gilson, Middleton, WI, USA), kasutades poolpreparatiivseid ODS kolonne (Luna 5 um C18 (2)) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Saksamaa; Inno C018 kolonn Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Analüütiline RP-HPLC süsteem oli Waters 2695 alliance süsteem 996 Photodiode Array (PDA) detektoriga (Waters Corp, Milford, MA, USA) ja kolonn oli Hypersil™ BDS C18 kolonn (130 Å, id 150: 4,6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). Sipelghape osteti ettevõttelt Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Soul, Korea). HPLC puhtusastmega lahustid osteti ettevõttelt Fisher Scientific Korea Ltd. (Soul, Korea). H2SO4, Na2CO3 ja esimese klassi lahustid ekstraheerimiseks, fraktsioneerimiseks ja isoleerimiseks osteti ettevõttelt Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Soul, Korea). L- ja D-tsüsteiini metüülestri vesinikkloriid ja o-tolüülisotiotsüanaat osteti ettevõttest Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Jaapan).
3.2. Taim Materjal
Kogu taimedCistanche salsa, mis koguti Shinjang Uiguurilt, imporditi läbi Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). Need tuvastas prof dr Jehyun Lee (Dongguki ülikool, Soul, Korea). Vautšeri näidis (SNUPH2016-03) deponeeriti Souli riikliku ülikooli farmaatsiakolledži Herbarium of Medicinal Plant Gardenis.
3.3. Ekstraheerimine ja Isolatsioon
Kuivatatud terved taimedCistanche salsa(5,7 kg) tükeldati ja ekstraheeriti kolm korda MeOH-ga (20 L) toatemperatuuril ultraheliga 99 minutit. Pärast lahusti eemaldamist vaakumis suspendeeriti toorekstrakt (1,35 kg) vees (5 L), seejärel jaotati EtOAc-ga (5 L). EtOAc jääk (55,3 g) eraldati silikageeli kromatograafias 16 fraktsiooniks (E01-16), elueerides CHCl3/MeOH-ga (50:1–0:1, astmeline gradientsüsteem).
E08 (611,7 mg) töödeldi keskmise rõhuga vedelikkromatograafiaga silikageelil (25 g) ja elueeriti CHCl3/MeOH-ga (18:1–0:1, astmeline gradientsüsteem) ja andis 11 murdosa (E08a-k). E08g-st puhastati ühendid 13 (0,7 mg) ja 18 (0,6 mg), kasutades Luna 5 um HPLC kolonni ja isokraatilist elueerimist 28% vesilahusega. MeCN. E08h (138,5 mg) HPLC puhastamine (Hypersil GOLD, 25% MeCN vesilahus) andis ühendid 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) ja 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) puhastati täiendavalt ränidioksiidi-MPLC kolonnis (20 g), elueerides CHCl3/MeOH-ga (10:1–0:1, etapp- gradientsüsteem), et saada 11 alamfraktsiooni (E09a-k). E09e (398,7 mg) töödeldi Sephadex LH-20-ga (MeOH) ja saadi kaheksa alamfraktsiooni (E09e1-8). Seejärel puhastati E09e6, kasutades Hypersil GOLD HPLC kolonni (22% MeCN vesilahus), et saada ühend 11 (0,4 mg). E09e7-st puhastati ühend 5 (0,6 mg) isokraatliku elueerimisega Luna 5 um HPLC kolonnist 40% vesilahusega. MeOH.
E10 (1,20 g) jaotati üheksaks fraktsiooniks (E10ai) Sephadex LH-20 kolonnis, elueerides MeOH-ga. Ühendid 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) ja 15 (5,0 mg) eraldati ühendist E10g (147,5 mg) HPLC eraldamisega (Inno, 23% MeCN vesilahus). Fraktsioon E10h (470,0 mg) puhastati Hypersil GOLD kolonnis isokraatliku elueerimisega (40% MeOH vesilahus), saades ühendid 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) ja 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) töödeldi Sephadex LH-20-ga, elueerides MeOH-ga, et saada üheksa fraktsiooni (E11a-i). E11e eraldati Sep-Pak C18 kassetiga, elueerides astmeliselt 10%, 20%, 30%, 50% ja 100% vesilahusega. MeOH, et saada seitse fraktsiooni (E11e1-7), millele järgnes Luna 5 um HPLC (28% MeCN vesilahus), et saada ühendid 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) ja 12 (1,2 mg).
E12 (19.{2}} g) töödeldi ränidioksiidi MPLC-ga (120 g), kasutades CHCl3/MeOH astmelise gradiendi süsteemi, et saada kuus fraktsiooni (18:1–0:1). , E12a-f). E12f kromatografeeriti Sephadex LH-20 kolonnis (MeOH), saades seitse fraktsiooni (E12f1-7). E12f7 HPLC puhastamine (Hypersil GOLD, 25% MeCN vesilahus) andis ühendi 2 (3,3 mg). Kõik HPLC jaoks kasutatud lahustid olid 0,05% sipelghappepuhver. HPLC ja MPLC kromatograafia tavaline voolukiirus oli vastavalt 3 ja 40 ml/min.
3.4.Iseloomustus
Tsistansalsiid A (5): pruun amorfne pulber; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (puhas) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 'H-NMR (800 MHz) ja13C-NMR (200 MHz) andmed, vt tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 645,2146 (arvutatud C30H38O14Na jaoks, 645,2154).
Tsistansalsiid B (6): pruun amorfne pulber; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (puhas) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 'H-NMR (500 MHz) ja13C-NMR (125 MHz) andmed, vt tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 579,2054 (arvutatud C26H36O13Na jaoks, 579,2048).
Tsistansalsiid C (12): pruun amorfne pulber; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (puhas) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 'H-TMR (800 MHz) ja13C-NMR (200 MHz) andmed, vt tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 581,2213 (arvutatud C26H38O13Na jaoks, 581,2205).
Tsistansalsiid D (17): pruun amorfne pulber; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (puhas) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 'H-NMR (400 MHz) ja13C-NMR (75 MHz) andmed, vt tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 657,2147 (arvutatud C31H38O14Na jaoks, 657,2154).
Tsistansalsiid E (18): pruun amorfne pulber; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (puhas) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 'H-NMR (800 MHz) ja13C-NMR (200 MHz) andmed, vt tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 657,2166 (arvutatud C31H38O14Na jaoks, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analüüs
Kromatograafiline-massispektromeetria analüüs viidi läbi Agilent 1260 Infinity seeria LC-süsteemiga (Agilent Technologies, Inc., USA). Analüütiline kolonn oli SFCpak Crest C18T-5 kolonn (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Jaapan). Liikuv faas koosnes 0,1 mahuprotsendist (maht/maht) sipelghappest MeCN-is (A) ja vees (B), kasutades gradientelueerimist 0–35 min (23 protsenti A), 35–45 min ( 23–28 protsenti A), 45–75 min (28 protsenti A) ja 75–80 min (90 protsenti A). Voolukiirust hoiti 0,3 ml/min juures. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 320 nm. ESI allika tingimused olid järgmised: kuivatusgaasi (N2) voolukiirus, 10 l/min; kuivatusgaasi temperatuur, 350 kraadi ; nebulisaator, 30 psig; mantligaasi voolukiirus, 12,0 l/min; mantli gaasi temperatuur, 350 kraadi; kapillaar, 4000 V; skimmer, 60 V; kaheksapoolne RF, 750 V; fragmentori pinge, 180 V; positiivne režiim. Süsteemi kasutati Masshunteri tööjaama tarkvara all. Massivahemikuks määrati m/z 50–1000.
3.6.Hape Hüdrolüüs
Ühendid hüdrolüüsiti 1 N H2SO4-ga (100 uL), mida kuumutati veevannis 90 kraadi juures 2 tundi, seejärel neutraliseeriti Na2CO3 küllastunud vesilahusega. Pärast lahuste kuivatamist N2 voolu all lahustati saadused ja standardsuhkrud (D-Glc, L-Glc, L-Rha) püridiinis (100 uL), mis sisaldas L-tsüsteiini metüülestri vesinikkloriidi (0,5 mg). L-ramnoosi proov lahustati püridiinis (100 ui), mis sisaldas D-tsüsteiini metüülestri vesinikkloriidi (0,5 mg). Pärast seda kuumutati neid 1 h 60 kraadi juures. Lahuseid töödeldi 1 uL (1,11 mg) o-tolüülisotiotsüanaadiga, mida kuumutati uuesti 60 kraadi juures 1 tund. Iga lõplikku segu analüüsiti otse analüütilise RP-HPLC abil (Hypersil™ BDS C18 kolonn, 17% MeCN vesilahus, 0,8 ml/min, 40 min, 35 kraadi). Piigi tR 21,9 ja 40,4 minuti juures langes kokku D-glükoosi ja L-ramnoosi tiokarbamoüültiasolidiini derivaadi omaga.
3.7. Kamber Kultuur
Hiire makrofaagid, RAW 264.7, saadi Korea Bioteaduste ja Biotehnoloogia Uurimisinstituudist (Daejeon, Korea) ja neid kasvatati RPMI söötmes, mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit ja 100 U/ml penitsilliini/streptomütsiinsulfaati. Rakke inkubeeriti niisutatud 5% CO2 atmosfääris 37 kraadi juures.
3.8. Narkootikumid ja kemikaalid
RPMI, penitsilliin ja streptomütsiin osteti ettevõttest HyClone (Logan, UT, USA). Veise seerumi albumiin ja LPS osteti firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA).
3.9. NO toodangu mõõtmine
Nitriti kontsentratsioon söötmes mõõdeti NO tootmise indikaatorina vastavalt Griessi reaktsioonile. Rakud külvati 96-süvendiga kultuuriplaatidele vahekorras 2:105 rakku süvendi kohta. Pärast RAW 264.7 rakkude eelinkubeerimist 18 tundi töödeldi rakke eelnevalt ühenditega (50 uM, 10 uM, 5 uM või 1 uM) ja stimuleeriti LPS-ga (500 ng/mL) 24 tundi. h. DMSO-s lahustatud testitavad ühendid. Rakke töödeldi ka 0,05% DMSO-ga vehiikli kontrollina. RAW 264.7 rakke (2: 105 rakku süvendi kohta) kultiveeriti 96-süvendiga plaatidel, kasutades RPMI-d ilma fenoolpunaseta, ja eeltöödeldi proovidega 0,5 tundi. Raku NO tootmine indutseeriti 500 ng/ml lõppkontsentratsiooniga LPS-i lisamisega ja 24-tunnise inkubeerimisega. Pärast inkubeerimist segati 100 uL konditsioneeritud söödet sama koguse Griessi reagendiga ja inkubeeriti 15 minutit. Segu neeldumist 540 nm juures mõõdeti ELISA mikroplaadilugejaga (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Saadud väärtusi võrreldi RPMI-s lahustatud naatriumnitriti standardkontsentratsioonide väärtustega ja arvutati nitriti kontsentratsioonid prooviga töödeldud rakkude konditsioneeritud söötmes.
3.10.3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) rakkude elujõulisuse test
Rakud külvati {{0}}süvendiplaatidele tihedusega 5:104 rakku süvendi kohta ja inkubeeriti seerumivaba söötmega proovide juuresolekul. DMSO-s lahustatud testitavad ühendid. Rakke töödeldi ka 0,05% DMSO-ga vehiikli kontrollina. Pärast 24-tunnist inkubeerimist lisati 10 uL MTT-d (5 mg/ml soolalahuses) ja inkubeerimist jätkati veel 4 tundi. Mitokondriaalne suktsinaatdehüdrogenaas elusrakkudes muudab MTT inkubeerimise ajal nähtavateks formazaani kristallideks. Formasaani kristallid solubiliseeriti seejärel dimetüülsulfoksiidis ja neeldumist mõõdeti 540 nm juures, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) mikroplaadilugejat (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Rakkude suhteline elujõulisus arvutati võrreldes töötlemata kontrollrühma neeldumisega. Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris.
3.11. Immunoblotanalüüs
Valgu ekspressiooni hinnati standardsete protseduuride kohaselt Western blot analüüsiga. Lühidalt, RAW264.7 rakke kultiveeriti 6{{20} mm kultuuritassides (2:106/ml), millele järgnes eeltöötlemine 50 uM ühenditega. . Rakke pesti kaks korda jääkülmas PBS-is (pH 7,4), rakusademed resuspendeeriti lüüsipuhvris jääl 15 minutiks ja rakujäänused eemaldati seejärel tsentrifuugimisega. Valgu kontsentratsioon määrati Bio-Rad valguanalüüsi reagendiga vastavalt tootja juhistele. Valk (20–30 ug) segati 1:1 2: proovipuhvriga (20 protsenti glütserool, 4 protsenti SDS, 10 protsenti 2- ME, 0,05 protsenti bromofenoolsinist ja 1,25 M Tris [pH 6,8]), laaditi 8 või 15 protsenti SDS-PAGE geelidele ja töötati 150 V juures 90 minutit. Rakuvalgud kanti üle Immunoblot polüvinülideendifluoriidmembraanidele (Bio-Rad), kasutades Bio-Rad poolkuivat ülekandesüsteemi vastavalt tootja juhistele. Seejärel inkubeeriti membraane üleöö vastavate p-NF-入B, NF-入B, pI 入B ja -aktiini primaarsete antikehadega (Abcam, Cambridge, UK) Tris-puhverdatud soolalahuses, mis sisaldas 5 protsenti lõssi ja 0,1 protsenti Tweeni. 20. Järgmisel päeval pesti blotte kolm korda Tris-puhverdatud soolalahusega (0,1 protsenti Tween 20) ja inkubeeriti 1 tund HRP-ga konjugeeritud sekundaarse anti-IgG antikehaga (lahjendatud 1:2000–1). :20 000). Blotte pesti uuesti kolm korda Tris-puhverdatud soolalahusega (0,1 protsenti Tween 20) ja immunoreaktiivsed ribad töötati välja, kasutades kemoluminestsentssubstraati ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
3.12.Statistiline analüüs
Katseandmed on esitatud keskmisena o SEM. Statistilise olulisuse tase määrati dispersioonanalüüsiga (ANOVA), millele järgnes Dunnetti t-test mitme võrdluse jaoks. P Väärtusi, mis olid väiksemad kui 0,05, peeti oluliseks.
Cistanche salsa ekstrakt
4. Järeldused
Selles uuringus eraldasime ja selgitasime välja viie uue fenüülpropanoid-asendatud glükosiidi, nimega tsistansalsiid AE (5, 6, 12, 17 ja 18), struktuurid, lisaks 13 teadaoleva ühendi eraldamisele ja tuvastamisele, kasutades dereplikatsioonistrateegiat. Teadaolevateks ühenditeks määrati lipedosiid AI (1) [21], 23-atsetüüllakteosiid (2) [22], isotsistanosiid C (3) [15], osmantusiid B (4) [21], epimeridinosiid A ( 7) [15], tsistanosiid D (8) [23], salsasiid B (9) [6], tubulosiid E (10) [16], tsistanosiid M (11) [15], isomartynosiid (13) [24], salsasiid C (14) [6], jionosiid C (15) [25] ja salsasiid F (16) [6]. Nende struktuurid määrati kindlaks ulatuslike spektroskoopiliste andmete analüüsi ja kirjanduses esitatud andmete võrdlemise kaudu. Kinnitati, et fenüülpropanoid-asendatud glükosiidide esialgselt ennustatud struktuurid sobitati õigesti nende tegelike struktuuridega.
Cistanche salsa ekstrakti eelised
Viited
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Trp-P-1 SOS-indutseeriva toime allasurumine Cistanche salsa rasvhapete poolt Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu testis. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Cistanches salsa proliferatsioonivastane toime eesnäärme healoomulise hüperplaasia progresseerumisele. Saab. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Herba Cistanches'i kiire eristamine mitmeastmelise infrapuna-makro-sõrmejälje abil kombineerituna pehme sõltumatu klassianaloogia modelleerimisega (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Herba Cistanche'ide diferentseerimine sõrmejälje järgi suure jõudlusega vedelikkromatograafia-dioodide massiivituvastus-massispektromeetriaga. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Cistanchis Herba koostisainete uuringud. V. Kahe uue fenüülpropanoidglükosiidi, tsistanosiidide E ja F isoleerimine ja struktuurid. Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Uued Cistanche salsa glükosiidid. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbajeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsaljamova, EN; Ternynko, II Kasahstani Vabariigis kasvava Cistanche salsa (CA Mey) G. Becki fenoolsete ühendite koostisuuring. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Parem fenüületanoidglükosiidide akumuleerumine Cistanche salsa suspensioonikultuuri eelkäija söötmise teel. Biochem. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsa ekstrakt toimib sarnaselt valkudega seotud
polüsahhariid-K (PSK) erinevat tüüpi rakuliinidel. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Cistanches salsa fenüületanoidglükosiidid inhibeerivad neuronites 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumiooni poolt indutseeritud apoptoosi. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Uued kontseptsioonid, eksperimentaalsed lähenemisviisid ja dereplicatsioonistrateegiad looduslikest allikatest pärit uudsete fütoöstrogeenide avastamiseks. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Depsides theaflaviinide ST ja lecanora DF dereplication-guided isolation endofüütilisest seenest Setophoma sp. Fütokeemia 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferatiivsed ja antiplasmodiaalsed ühendid valitud Streptomycese liikidest. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Uute hepatoprotektiivsete triterpenoidsaponiinide eemaldamine Celosiae spermast kõrgsurvevedelikkromatograafia abil, mis on ühendatud elektropihustus-ionisatsiooni tandem-kvadrupool-lennuaja massispektromeetriaga. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. LTQ-Orbitrapil põhinev traditsioonilise hiina meditsiini strateegia, mis on suunatud klasside avastamisele, identifitseerimisele ja tema oomika uurimisele: juhtumiuuring fenüületanoidglükosiidide kohta kolmes erinevas Herba Cistanches liigis. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Cistanche tubulosa (Schrenk) konksu koostisosad. f. II. Uue fenüületanoidglükosiidi ja uue neolignani glükosiidi eraldamine ja struktuurid. Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Aldoosi enantiomeeride lihtne eristamine pöördfaasi HPLCistancheChem. Pharm. Bull. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Uuring cis-kaneelhappe kohta Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Hüdroksükaneelhapete trans-Cis-tasakaal vesilahuste kiiritamisel erineva pH juures. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
