Isa nikotiin suurendab hirmumälu, vähendab nikotiini manustamist ja muudab hipokampuse geneetilist ja närvifunktsiooni järglastel

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|István Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1 Bio-käitumusliku tervise osakond, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2 Farmakoloogia osakond, Vanderbilti meditsiinikool, Nashville, Tennessee

3 Farmaatsia kolledž, Kentucky Ülikool, Lexington, Kentucky

4 California ülikooli neurobioloogia ja käitumise osakond Irvine, Irvine, California

5 Bioinformaatika, biokeemia ja molekulaarbioloogia, Penn State University, University Park, PA

6 Psühholoogia osakond, Temple'i ülikool, Philadelphia, Pennsylvania

Abstraktne

Nikotiini tarbimine on kogu maailmas tarbitavate tubaka- ja e-sigarettide puhul endiselt laialt levinud. Üha enam tõendeid põlvkondadevahelise epigeneetilise pärandi kohta viitab aga sellele, et nikotiini kasutamine võib järgmiste põlvkondade käitumist ja neurobioloogiat muuta. Testisime kroonilise isa nikotiiniga kokkupuute mõju C57BL6/J hiirtel F1 ja F2 järglaste hirmu konditsioneerimisele, samuti konditsioneeritud hirmu väljasuremist ja spontaanset taastumist, nikotiini isemanustamist, hipokampuse kolinergilist funktsioneerimist, RNA ekspressiooni ja DNA metüülimist F1-s. järglased. Isa kokkupuude nikotiiniga oli seotud kontekstuaalse ja vihjatud hirmu tugevdamisega ning kustunud hirmumälestuste spontaanse taastumisega. Lisaks vähenes nikotiini tugevdamine nikotiiniga hiirtel, mida hinnati isemanustamise paradigmas. Need käitumuslikud fenotüübid olid seotud muutunud vastusega nikotiinile, ülesreguleeritud hipokampuse nikotiini atsetüülkoliini retseptori seondumisega, vähendatud esilekutsutud hipokampuse kolinergiliste vooludega ning muutunud neuraalse arengu ja plastilisusega seotud hipokampuse geenide metülatsiooni ja ekspressiooniga. Geeniekspressiooni analüüs viitab mitme põlvkonna mõjudele laiematele geenivõrkudele, mis võivad olla seotud neuroplastilisuse ja vaimsete häiretega. Hirmu konditsioneerimise muutused viitavad samamoodi fenotüüpidele, mis on analoogsed posttraumaatilise stressiga sarnaste ärevushäiretega.

MÄRKSÕNAD: kolinergiline, hipokampus, õppimine, mitu põlvkonda, nikotiin, põlvkondadeülene

cistanche mõju

1. SISSEJUHATUS

Kogunev tõendusmaterjal viitab sellele, et uimastitega kokkupuute mõju ulatub üksikisikust kaugemale, mõjutades füsioloogilisi ja käitumuslikke fenotüüpe eksponeerimata järglastel.{0}} Nikotiini põlvkondadevahelise mõju iseloomustamine on tubakatoodete tarbimise levimust4 ja dramaatilist kasvu arvestades ülioluline. e-sigareti kasutamisest.5 Mõjudes aju kolinergilistele süsteemidele, põhjustab kokkupuude nikotiiniga märkimisväärseid muutusi ajufunktsioonis, mis võib olla nikotiinisõltuvuse aluseks ja suurendada psühhiaatriliste häirete, sealhulgas depressiooni6 ja ärevuse riski.7 Kolinergilise aktivatsiooni järel toimuvad epigeneetilised modifikatsioonid võivad võimaldavad püsivat mõju raku ja ahela funktsioonidele.8,9 Kuni viimase ajani arvati, et need epigeneetilised modifikatsioonid kustutati idutee loomisel ja eraldati seega järgmistest põlvkondadest. Ühe põlvkonna jooksul omandatud epigeneetilised modifikatsioonid, sealhulgas DNA metüülimine, histooni posttranslatsioonilised modifikatsioonid ja mittekodeerivad RNA-d, võivad aga pärida ka järgmises põlvkonnas.10,11 Need epigeneetilised modifikatsioonid võivad vahendada vanemate nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelisi mõjusid järglaste käitumisele ja neurobioloogiale. .

Mitmete sõltumatute laborite näriliste uuringud on hakanud tuvastama vanemate nikotiiniga kokkupuute mitut põlvkonda ja põlvkondadevahelisi tagajärgi. See töö on seni tuvastanud vanemate nikotiiniga kokkupuute mõju depressiivsetele ja ärevuselaadsetele fenotüüpidele,1 kognitiivsele paindlikkusele,2 tähelepanupuudulikkuse ja hüperaktiivsuse häire (ADHD) sarnasele käitumisele3 ja geeniekspressioonile.1,2 nikotiini kokkupuude võib mõjutada nikotiinisõltuvuse ja vaimse tervisega seotud endofenotüüpe. Näiteks oleme näidanud, et kokkupuude nikotiiniga moduleerib kontekstuaalset hirmu tingimist, mis on hipokampusest sõltuva hirmu õppimise mudel, mis on seotud haavatavusega vaimse tervise häirete suhtes, nagu traumajärgne stressihäire (PTSD) ja sõltuvus.{5}} Nikotiini mõju kontekstuaalsele hirmu õppimisele moduleerib hipokampus.15,16 Oleme leidnud, et äge nikotiini ekspositsioon suurendab hipokampusest sõltuvat hirmu õppimist,15,17 kahjustab kontekstuaalse hirmu väljasuremist,18,19 ja suurendab kontekstipõhise hirmu spontaanset taastumist pärast seda. väljasuremine.18 Siiski ei ole uuritud isapoolse nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelisi mõjusid nendele fenotüüpidele. Lisaks ei ole üheski varasemas uuringus iseloomustanud nikotiini mitme põlvkonna mõju kolinergilisele funktsioonile. Mitme põlvkonna pärand viitab fenotüüpidele, mis tekivad vahetult kokkupuutuvatele indiviididele järgnevas põlvkonnas, samas kui põlvkondadevaheline pärand koosneb põlvkondadevahelisest epigeneetilise teabe iduliini vahendatud pärandist ilma otsese keskkonnamõjuta, mis viib fenotüübilise variatsioonini.11 Siin uurisime mõlemat mitme põlvkonna vahelist põlvkonda. ja isa nikotiiniga kokkupuute põlvkondadeülesed mõjud kontekstuaalsele ja vihjatud hirmu õppimisele F1 ja F2 põlvkonnas, samuti nikotiini isemanustamisele, hipokampuse nikotiini atsetüülkoliini retseptori (nAChR) seondumisele, hipokampuse kolinergilisele funktsioneerimisele, hipokampuse geeniekspressioonile ja metüülimisele hipokampuse DNA-s F1 põlvkond. Me oletame, et isa nikotiini ekspositsioon mõjutab hirmu seisundit, hipokampuse geeniekspressiooni ja funktsiooni järglastel ja vanasjärglastel.

cistanche ekstrakti mõju

2 MEETODID JA MATERJALID

2.1 Õppeained

Katsealused olid isased ja emased C57BL/6J hiired (vanuses 8–20 nädalat, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Kõik loomad, välja arvatud haaremikasvatuseks mõeldud pidamised, peeti rühmas 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga ning ad libitum juurdepääsuga toidule ja veele. Iseseisva manustamise ajal piirati katsealuste toitu 85–90 protsendini nende vabalt toidetud kehakaalust ja vett anti ad libitum. Kõik käitumistestid toimusid ajavahemikus 9:00 AM kuni 18:00. Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt NIH laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile ning need kiideti heaks Penn State'i ülikooli, Temple'i ülikooli või California ülikooli Irvine'i IACUC komiteede poolt.

2.2 Isa kokkupuude nikotiiniga

Isased (8 nädalat) said 0,9 protsenti steriilset soolalahust või nikotiinvesiniktartraati (12,6 mg/kg/päevas, vaba alusmass – Fisher Scientific, Waltham, MA või MP Biomedical, Santa Ana, CA), mis oli lahustatud 0,9% steriilne soolalahus, manustatakse subkutaanselt osmootsete minipumpade kaudu (Alzet, mudel 1004, Durect, Cupertino, CA) 28 päeva jooksul. See annus tekitab plasma nikotiini ja kotiniini taseme, mis on võrreldav mõõdukate suitsetajate omaga.20,21

2.3 F1 ja F2 hiirte genereerimine

Nikotiini poolväärtusaeg hiirtel on ligikaudu 6 minutit.22 Varem on näidatud, et nikotiini ärajätmise mõju hajub 4 päeva pärast nikotiini eemaldamist.23-25 Seetõttu on nikotiiniravi ja nikotiiniravi vahel 4-päevane viivitus. aretus viidi ellu, et tagada nikotiini süsteemne eliminatsioon enne aretamist. Isased hiired paigutati F1 järglaste saamiseks 2 nädalaks puuridesse koos kahe naiivse C57BL/6 J emasloomaga (vanuses 8–20 nädalat). F2 hiired loodi naiivsete isaste F1 hiirte paaritamisel naiivsete emastega.

2.4 Hirmu konditsioneerimine

Hirmu leevendamise ja väljasuremise protseduure on üksikasjalikult kirjeldatud varem.19 Lühidalt, hiiri treeniti ja testiti mürasummutavates kambrites (18,8 × 20 × 18,3 cm, taustmüra 65 dB; MED Associates, St. Albans, VT). F1 ja F2 hiired olid hirmust tingitud kahe konditsioneeritud stiimuli (CS, 30 s, 85‐dB valge müra) ja tingimusteta stiimulite (USA, 2 s, 0,57-mA jalalöögid) paarid, mille vahe oli 120 sekundit. Et uurida nikotiini ägedat mõju F1 ja F2 hiirte hirmu leevendamisele, said järglased 2–4 minutit enne ägedat nikotiini (0,09 mg/kg, NIC vaba alusmass, ip; nikotiini vesiniktartraatsool, Fisher Scientific) või soolalahust (SAL) koolitustele ja testimistele. Kakskümmend neli tundi pärast treeningut viidi hiired 5 minutiks tagasi treeningkonteksti, et hinnata kontekstilist külmumist. Pärast kontekstuaalset testimist paigutati hiired erinevatesse kambritesse, et hinnata hirmu õppimist. Tingimuste suhtes pimedaks jäänud eksperimenteerijad hindasid külmumist, mida määratleti kui vabatahtliku liikumise puudumist peale hingamist, erapooletu ajaproovi võtmise meetodi abil.19 Võimalike laeefektide uurimiseks vihjetestide ajal sai eraldi F1-hiirte rühm identset koolitust ainult ühe CS‐US-ga. Samuti uuriti paaritamist ning kontekstuaalset hirmu väljasuremist ja spontaanset taastumist. Hirmu väljasuremine toimus viie järjestikuse seansi jooksul alates päevast pärast kontekstuaalset ja vihjatud hirmu testimist. Pärast viimast väljasuremisseanssi jäeti hiired 7 päevaks segamatult kodupuuridesse ja seejärel testiti neid spontaanseks taastumiseks uuesti treeningkontekstis. Et teha kindlaks, kas täheldatud erinevused hirmu tingimises olid tingitud erinevustest šokitundlikkuses, ärevuses või laiemas õppimise puudujäägis, testiti lisaks isas- ja emasloomadele NIC- ja SAL-Sired loomi avamaal, šokitundlikkust, kõrgendatud pluss labürinti. EPM) ja uudsed objektituvastusparadigmad (täielike meetodite ja tulemuste saamiseks vt tugiteavet).

2.5 Toidu ja intravenoosse nikotiini isemanustamine

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 graanulit seansi kohta kolme järgneva seansi jooksul), katsealused kateteriti kaelaveeni isofluraani (1% - 3%) / hapnikuauru anesteesia all, nagu eelnevalt kirjeldatud.26 Hiirtel lasti enne juurdepääsu operatsioonist taastuda rohkem kui 72 tundi. toidutasu saamiseks uuesti vastata. Toidule reageerimise taastamine tagab, et hiired on pärast intravenoosset operatsiooni piisavalt taastunud ja neil on normaalne operantreaktsioon pärast viivitust juurdepääsukambritele. Seejärel lubati hiirtel ise manustada intravenoosselt (IV) nikotiini 1-tunniste igapäevaste seansside käigus 6–7 päeva nädalas (nikotiini vesiniktartraatsool lahustatuna 0,9% steriilses soolalahuses, {{1}{101} {12}}}}.03 mg/kg/infusioon, vaba baasmass; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotiini manustati Razeli süstlapumbaga (Med Associates). Igal seansil oli kaks sissetõmmatavat hooba (üks aktiivne, üks mitteaktiivne). Aktiivse kangi reageerimiskriteeriumide täitmine andis tulemuseks IV nikotiini infusiooni (0.{{20}}3 ml infusioonimaht; graafik FR5TO20 sek). Mitteaktiivse kangi vastused registreeriti, kuid neil ei olnud kavandatud tagajärgi. Pärast kaheksat kogumisseanssi 0,03 mg/kg/infusiooni kohta lülitus infusiooniannus kuueks seansiks 0,1 mg/kg/infusioonile. Iga annuse puhul kasutati statistilisteks analüüsideks viimase kolme seansi keskmist tarbimist. Kateetreid loputati iga päev füsioloogilise steriilse soolalahusega (0,9% w/v), mis sisaldas hepariini (100 USP ühikut/ml). Kateetri läbitavust kontrolliti Brevitaliga (metoheksitalnaatrium, Eli Lilly, Indianapolis, IN) pärast nikotiini isemanustamise faasi. Et hinnata retsidiiviga seotud käitumist, testiti hiirtel iha inkubatsiooni pärast seanssi, mis järgnes vahetult pärast viimast 0,1 mg/kg/infusiooniannust IV nikotiini isemanustamise kohta; selles protseduuris lubatakse hiirtel reageerida aktiivsele kangile, kuid neile ei anta nikotiini infusioone. Esimesel algtaseme inkubatsiooniseansil (1. päev) paigutati hiired FR5TO20 sek skeemi alusel operantkambritesse koos kontingentse märgutule aktiveerimisega. Seejärel hoiti hiiri 20 päeva kodupuurides. Karskuse 21. päeval uuriti hiiri iha inkubatsiooni suhtes, kusjuures aktiivne kangi märgutuli edastati FR5TO20 sekundilise ajakava alusel. Uuringud viisid läbi katsetajad, kes olid rühmatingimuste suhtes pimedad, ja MedAssociates'i tarkvara salvestas automaatselt käitumisreaktsioonid.

2.6 Nikotiini atsetüülkoliini retseptori sidumine

Radioligandi sidumise test16 viidi läbi, kasutades 8-nädalaste NIC-Sired (5 M ja 10F) ja SAL-Sired (9 M ja 6F) F1 hiirte hipokampusi. Proovid homogeniseeriti lüüsipuhvriga (5 mM Tris pluss 5 mM EDTA pluss 5 mM EGTA), tsentrifuugiti 100 000 g juures 30 minutit 4 kraadi juures, resuspendeeriti lüüsipuhvris ja tsentrifuugiti uuesti. Pelletid resuspendeeriti Tris/10% sahharoosi puhvris ja inkubeeriti [3H]epibatidiiniga ([3H]EB) (~2 nM, 27,28 alusel) (spetsiifiline aktiivsus 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) 1 tund toatemperatuuril. [3H]EB valiti nAChR-i sidumiseks, kuna varasemad tulemused näitasid, et hipokampuse heteromeersed 4 2 nAChR-id vahendavad nikotiini mõju hirmu leevendamisele.17 Mittespetsiifilist seondumist hinnati 300 µM nikotiini (nikotiini vesiniktartraatsool) juuresolekul. lahustatud Tris puhvris, vaba aluse kontsentratsioon). [3H]EB-ga seotud nAChR-id filtreeriti (24-süvendiline rakukoguja, Brandel Co, Gaithersburg, MD) ja vedelikstsintillatsiooniloendur (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) mõõdeti filtri radioaktiivsust. Spetsiifiline seondumine, väljendatuna fmol/mg koe kohta, arvutati kui erinevus kogu ja mittespetsiifilise seondumise vahel.16

2.7 In vivo amperomeetrilised kolinergilised salvestused

Hipokampuse kolinergilise ülekande muutuste hindamiseks amperomeetria abil kasutati eraldi rühma naiivseid 10- kuni 20-nädalasi NIC-Sired ja SAL-Sired F1 hiiri. Keraamilised mikroelektroodid (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), 4 (15 × 333 μm) paarikaupa paigutatud plaatina salvestuskohaga (ülemine ja alumine), kaeti koliinoksüdaasiga (EC number 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO).29 Elektroodid elektropolümeriseeriti meta-fenüleendiamiiniga (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), et suurendada selektiivsust koliinivoolude tuvastamisel. Atsetüülkoliini (ACh) vabanemise tundliku indeksi saamiseks kasutati mikroelektroode, mille tundlikkus oli suurem või võrdne 3 pA/μM ja tuvastamispiir koliini puhul kuni 400 nM.30 Loomad tuimastati uretaaniga (1,2–1,5). g/kg, ip) ja ensüümiga kaetud mikroelektroodid langetati stereotaksiliselt dorsaalseks (A/P –1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V –2,3 mm) või ventraalseks (A/P –3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hipokampus. Ventraalset ja dorsaalset hipokampust hinnati eraldi, kuna need aitavad erinevalt kaasa kontekstuaalsele hirmule: ventraalsel hipokampusel (vHPC) on olulisem roll hirmu seostamisel ja väljendamisel, samas kui dorsaalne hipokampus (DHCP) on kontekstuaalse mälu jaoks kriitilise tähtsusega.31 Ag/ AgCl võrdluselektroodid implanteeriti kontralateraalsesse rostraalsesse ajukooresse.

Amperomeetrilised salvestused viidi läbi sagedusel 2 Hz, rakendades fikseeritud potentsiaali pluss 0,7 V, ja andmed digiteeriti (FAST-16 potentsiostaat, Quainton, Nicholasville, KY). Taustvoolud stabiliseeriti 60 minutiks, seejärel kanti ravimid hipokampusesse, kasutades elektroodi külge kinnitatud klaaskapillaari (otsa läbimõõt: 15 μm). Depolarisatsioonist põhjustatud ACh vabanemist mõõdeti kas lühikeste kaaliumi (KCl 70 mM; 100 NL) või NIC (1 mM vaba alus, nikotiintartraat; 100 NL) impulsside abil rõhul 2–10 psi iga 2 minuti järel. Salvestused tasakaalustati hipokampuse piirkonna (dorsaalne või ventraalne) ja ravimi (kaalium või NIC) osas. Koliini signaali amplituudid mõõdeti voolu muutusega ensüümiga kaetud kanali baasvoolust ja teisendati μM koliini ekvivalentideks in vitro kalibreerimise põhjal. Artefaktide kõrvaldamiseks võeti kasutusele eneserefereerimine, lahutades valvurikanalitest voolud.29 Mikroelektroodide paigutust kontrolliti koronaalsete hipokampuse lõikude Nissli värvimisega (joonis S1). Statistilise analüüsi jaoks kasutati kahe vastuse keskmisi ühe ravimiga manipuleerimise ja looma kohta.

2.8 Statistiline analüüs

Statistilised võrdlused viidi läbi kasutades SPSS (IBM, Armonk, NY) või GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Kõrvalekalded määrati 2 standardhälbe võrra keskmisest suuremate väärtustega. Kui tuvastati kõrvalekalle, lisatakse teave tulemuste jaotisesse. Olulisuse kriteeriumiks määrati=0,05. Algselt viidi läbi statistiline analüüs, mis hõlmas sugu kui tegurit kõigis katsetes, milles testiti nii isas- kui ka emaseid järglasi. Analüüsid kukkusid soo lõikes kokku, kui ei tuvastatud kolme- või kahesuunalist koostoimet seksiga (P > 0,05). Andmeid analüüsiti vastavalt vajadusele t-testi, ühesuunalise või kahesuunalise ANOVA abil. Olulistele peamistele või koostoimemõjudele järgnesid LSD post hoc võrdlused. Korduvate mõõtmiste ANOVA-dele järgnes Bonferroni post hoc võrdlus koos mitme võrdluse korrektsiooniga. Kui tuvastati ebavõrdsed dispersioonid, kasutati ebavõrdsete dispersioonide jaoks Welchi t-testi ja vabadusastmed ümardati allapoole.

2.9 RNA/DNA eraldamine

Täiskasvanud F1 hiired (8 nädala vanused; n=3 M ja 3 F rühma kohta) surmati emakakaela dislokatsiooni teel. Hippokampused lõigati kiiresti ventraalseteks ja dorsaalseteks osadeks (suhtes 1: 1), ühendati vasakult ja paremalt küljelt ning külmutati kiirkülmutatud kuival jääl. DNA ja RNA kaasisoleeriti ja puhastati, kasutades AllPrep DNA/RNA Mini komplekti (Qiagen, Valencia, CA). RNA ja DNA kontsentratsiooni ja kvaliteeti hinnati NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) ja Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) abil. RNA ekstraheerimiseks oli minimaalne RNA terviklikkuse arv (RIN) 8,5.

2.10 Transkriptoomianalüüsi kaudu

RNA sekveneerimisraamatukogud valmistasid Hucki instituudid Bioteaduste Genomics Core Facility's (Penn State University) 150 bp ühe otsa lugemiseks, kasutades Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) ja järjestatakse Illumina HiSeq 2500 kiirkäivitusrežiimis (kolm järjestikust käitamist ligikaudu 10 miljoni lugemisega proovi kohta). FASTQ-failide kvaliteeti kontrolliti FASTQC abil ja nende keskmine lugemise kohta oli Phredi kvaliteediskoor üle 30 (st järjestusviga alla 0,1 protsendi). FASTQ-failid joondati hiire võrdlusgenoomiga (mm10; UCSC genoomibrauser), kasutades Galaxy Project33 TopHat (v2.1.0)32. Mansetinööpe ja Cuffmerge (v2.2.1.0)34 kasutati kaardistatud lugemistest transkriptide kokkupanemiseks ja transkriptsioonifailide liitmiseks lõplikuks transkriptsiooni koostamiseks. Vale avastamise määra (FDR) korrigeeritud P väärtused arvutati diferentsiaalse geeniekspressiooni jaoks NIC-Sired ja SAL-Sired proovidest, kasutades Cuffdiffi (v2.2.1.3),34 standardse FDR-i piirväärtusega 0,05,35. Transkriptoomide andmestikud salvestati. geeniekspressiooni omnibusile.

2.11 Rikastamise analüüs

Erinevalt ekspresseeritud geene analüüsiti leidlikkuse raja analüüsi abil (IPA, käivitatud detsember 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36, et paljastada assotsiatiivsete bioloogiliste võrkude võimalik rikastamine. Käivitusparameetrid määrasid maksimaalselt 35 molekuli geenivõrgu kohta ja piirdusid imetajate kesknärvisüsteemi kudede või rakuliinidega. Rikastamise statistiline olulisus määrati parempoolse Fisheri täpse testiga, mida korrigeeriti mitme testimise jaoks.

2.12 Bisulfiti sihipärane järjestamine

DNA metüülimise analüüsiks kasutati RNA-ga kaasisoleeritud DNA-d (vt punkt 2.9). RNA-seq tuvastas vHPC-s ja DHCP-s vastavalt 952 ja 162 erinevalt ekspresseeritud geeni. Nendest kombineeritud loenditest 1010 ainulaadset geeni valiti vesiniksulfit-seq rikastamiseks, kasutades kohandatud SeqCap Epi rikastamissüsteemi (Roche, Pleasanton, CA, USA; tabel S1).38 Sihtvesiniksulfit. sekveneerimine viidi läbi Penn State Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility. Raamatukogud koostati KAPA Hyper Prep komplekti (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) abil. Naatriumvesiniksulfitiga muundatud raamatukogud amplifitseeriti ja rikastati valitud genoomsete piirkondade jaoks, kasutades kohandatud püüdmissondi komplekti (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Püütud DNA sekveneeriti Illumina HiSeq 2500 abil, kasutades 100 nt paarisotsa lugemist. FASTQ-failide kvaliteeti kontrolliti FASTQC abil. Illumina adapteri jadad eemaldati ja madala kvaliteediga alused kärbiti Trimmomaticu abil.39 Madala kvaliteediga aluste kärpimine viidi läbi libiseva akna lähenemisega, kui nelja aluspaari akna keskmine kvaliteet langes alla 20 läve. minimaalne lugemispikkus 35. Pärast kärpimist oli FASTQ-failide keskmine lugemise kohta Phredi kvaliteediskoor suurem kui 30 (st vähem kui 0,1 protsendi järjestusviga). Kärbitud lugemised kaardistati hiire võrdlusgenoomiga (mm10), kasutades Bismarkis rakendatud Bowtie240.41 Bismarki metüül_ekstrakti kasutati CpG metüülimise teabe eraldamiseks ja metüülimise aruannete koostamiseks. MethylKit42 kasutati erinevalt metüleeritud piirkondade (DMR) analüüsimiseks. Metüleerimise olek võeti kokku 500 aluspaari mittekattuvate akende kaudu ja viidi läbi diferentsiaalmetüülimise analüüs standardse FDR-iga 0, 05, 35. Andmekogumid on deponeeritud Gene Expression Omnibus'i.

Tistanche ekstrakti eelised

3 TULEMUST

3.1 Isa nikotiin suurendab kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist ja muudab F1 ja F2 põlvkonna hiirte kontekstuaalse hirmu tingimise ägeda nikotiini võimenduse.

NIC-Sired ja SAL-Sired F1 isased ja emased hiired olid pärast ägedat SAL-i või NIC-i manustamist hirmust tingitud (0.09 mg/kg ip, joonis 1A). Täielik algtaseme, CS-eelse ja CS-i külmumise analüüs on lisatud tugiteabele. Kolmesuunaline kontekstuaalse külmutamise ANOVA koos isaravi, ägeda uimastiravi ja soo kui teguritega näitas olulist isa × äge ravimiravi koostoimet (F(1,36)=32.75, P < .{{27)="" }}01).="" kuna="" soo="" ja="" isa="" või="" ägeda="" uimastiravi="" vahel="" ei="" esinenud="" olulist="" koostoimet,="" viidi="" läbi="" kahepoolne="" anova,="" mis="" langes="" sooüleseks="" kokkuvarisemiseks="" ja="" mis="" näitas="" olulist="" isaravi="" ×="" äge="" ravimiravi="" koostoime="" (f(1,40)="20.96)." ,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" võrdlused="" näitasid,="" et="" soolalahusega="" töödeldud="" nic-sired="" f1="" hiirtel="" ilmnes="" suurenenud="" kontekstuaalne="" hirm="" võrreldes="" soolalahusega="" töödeldud="" sal-sired="" f1="" hiirtega="" (t20="2.73," p="">< 0,05).="" kooskõlas="" varasemate="" leidudega="" 43="" põhjustas="" äge="" nic="" annuses="" 0,09="" mg/kg="" sal-sired="" hiirtel="" kontekstipõhise="" hirmu="" paranemist="" (t22="2.99," p="">< 0,01).="" kuid="" äge="" nic="" annuses="" 0,09="" mg/kg="" halvendas="" kontekstuaalset="" hirmu="" konditsioneerimist="" nic-sõõriga="" hiirtel="" (t18="3.36," p="">< 0,01).="" üldiselt="" olid="" konteksti="" külmutamise="" tasemed="" nic-sired="" nic-hiirtel="" võrreldavad="" sal-sired="" sal-hiirtel="" täheldatuga="" mõlema="" annuse="" 0,09="" mg/kg="" juures="" (p=""> 0,05).

Lisaks testiti isaseid ja emaseid NIC- ja SAL-sired loomi põrutustundlikkuse (joonis S2), kõrgendatud pluss labürindi (EPM, joonis S3), avatud välja ja uudsete objektituvastusparadigmade osas (joonis S4, täielike meetodite kohta vaadake tugiteavet). ja tulemused). Kui välja arvata NIC-Sired emased EPM-is (kellel esines suurenenud ärevuselaadne käitumine) ja NIC-Sired-loomad šokitundlikkusega (kellel oli vähenenud vokaalne reaktiivsus šokile, mis ei segaks suurenenud hirmu õppimise mitme põlvkonna fenotüüpi), pole erinevusi. tuvastati NIC- ja SAL-sired hiirte vahel.

JOONIS 1 Isa nikotiin suurendab kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist ja nõrgendab hirmu konditsioneerimise ägedat nikotiini võimendamist. Kontekstuaalne külmutamine oli NIC-Sired plus SAL-i puhul oluliselt kõrgem võrreldes SAL-Sired plus SAL-i kontrollidega. Äge nikotiin annuses 0,09 mg/kg suurendas kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist SAL-Sired'i puhul, kuid vähendas oluliselt kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist NIC-Sired'i loomadel (n=10-12 rühma kohta). B, kontekstuaalne külmutamine oli oluliselt kõrgem NIC-grandsire pluss SAL-i puhul võrreldes SAL-grandsire plus SAL-kontrollidega (n=9-11 rühma kohta). Vearibad näitavad keskmise standardviga (SEM), *P <>

Et teha kindlaks, kas nõrgenenud kontekstuaalne hirmu konditsioneerimine jätkus ka järgmises põlvkonnas (F2), aretati naiivsetest F1 isastest hiirtest NIC-vanaisa ja SAL-vanaisa isased ja emased F2 hiired. Täielik algtaseme, CS-eelse ja CS-i külmumise analüüs on lisatud tugiteabele. Kolmesuunaline kontekstuaalse külmutamise ANOVA viidi läbi, kasutades sõltumatute teguritena vanaisaravi, ägedat uimastiravi ja sugu (joonis 1B). Kuna sugu ja isa või ägeda uimastiravi vahel olulisi koostoimeid ei esinenud, viidi läbi kahesuunaline ANOVA, mis langes sooüleselt. Leiti isa oluline põhimõju (F(1,37)=9.88, P < .01)="" ja="" post="" hoc="" võrdlused="" näitasid,="" et="" nic-vanaisa="" hiirtel="" ilmnes="" võrreldes="" kontekstuaalse="" hirmuga="" tugevdatud="" mõju.="" sal-grandsire="" hiirtega="" (t39="3,04," p="">< 0,01).="" lisaks="" oli="" sal-vanaisa="" hiirtel,="" kellele="" manustati="" akuutset="" nic-d,="" suurenenud="" kontekstuaalne="" hirmu="" konditsioneerimine="" (t19="2.41," p="0.026)," kuid="" äge="" nic="" ei="" suurendanud="" kontekstuaalset="" hirmu="" konditsioneerimist="" nic-vanaisa="">

JOONIS 2 Isapoolne nikotiin parandab hoiatatud hirmu ja hirmumälu spontaanset taastumist. Võimalike ülemmäära mõjude uurimiseks vihjetestide ajal läbis eraldiseisev F1-hiirte rühm identset koolitust ainult ühe CS-USA sidumisega. NIC-Sired hiirtel suurendati nii kontekstuaalset kui ka vihjatud hirmu tingimist võrreldes SAL-Sired hiirtega, keda treeniti 1 CS-USA sidumisega (n=8-10 rühma kohta). B, isa kokkupuude nikotiiniga ei mõjutanud kontekstuaalse hirmu väljasuremist, kuid suurendas hirmumälu spontaanset taastumist 7 päeva pärast viimast väljasuremisseanssi (n=8-10 rühma kohta). Vearibad näitavad keskmise standardviga (SEM), *P <>

3.2 Isapoolne nikotiin suurendab F1 põlvkonna hiirte hirmu tekitamist

Et uurida, kas laeefekt välistas grupi erinevuste tuvastamise vihjatud hirmu konditsioneerimisel (vt tugiteavet), koolitati eraldi rühma F1 hiiri ühe CS-USA sidumisega. Selles kohordis leiti NIC-sired hiirtel (t6=2.41, P < 0,05)="" kontekstuaalse="" hirmu="" tingimise="" (t7="3.21," p="">< 0,05)="" ja="" vihjatud="" hirmu="" tingimise="" paranemist.="" 05;="" joonis="">

3.3 Isa nikotiin suurendab kontekstuaalse hirmumälu spontaanset taastumist F1 põlvkonna hiirtel

Seejärel testiti F1 hiirte rühma, kes said ühe CS-USA sidumise, väljasuremise ja kontekstuaalse hirmumälu spontaanse taastumise suhtes. F1 NIC-sired hiirtel ilmnes normaalne hirmu väljasuremine, kuid kontekstuaalse hirmumälu paranes spontaanselt, võrreldes SAL-Sired hiirtega (t7=3.38, P < 0.05;="" joonis="">

3.4 Isapoolne nikotiin vähendab nikotiini isemanustamist

Enne nikotiini isemanustamise koolitust analüüsiti katsealuste võimet õppida toidutasu saamiseks operatiivset ülesannet ja erinevusi ei täheldatud (tugiteave, joonis S5). Et testida isa nikotiiniga kokkupuute võimalikke mõjusid nikotiini tugevnemisele F1 järglastel, hinnati nikotiini intravenoosset manustamist (0,03 mg/kg/infusioon) kahesuunalise segadisaini ANOVA abil, mis tuvastas. seansi põhiefekt (F(7,119)=13,60, P < .001)="" ja="" seanss="" ×="" isaravi="" interaktsioon="" (f(7,119)="5,00," p="">< .001).="" post="" hoc="" testid="" ei="" näidanud="" aga="" statistiliselt="" olulisi="" erinevusi="" rühmade="" vahel="" kaheksal="" omandamise="" seansil="" (joonis="" 3a).="" seejärel="" analüüsiti="" aktiivsete="" ja="" mitteaktiivsete="" kangivajutuste="" arvu,="" et="" teha="" kindlaks,="" kas="" rühmad="" säilitasid="" omandamise="" ajal="" aktiivse="" hoova="" eelistuse="" seansi="" ajal="" (joonis="" 3b),="" mis="" tuvastas="" seansi="" peamise="" mõju="" (f(7,238)="" {{20}="" },18,="" p="">< 0,001)="" ja="" seanss="" ×="" isaravi="" interaktsioon="" (f(21,238)="11,40," p="">< 0,001).="" post="" hoc="" analüüs="" näitas,="" et="" nikotiini="" isemanustamise="" esimesel="" päeval="" olid="" rühmad="" erinevad.="" nic-siredi="" rühmal="" oli="" suurem="" aktiivne="" kangi="" vajutamine="" võrreldes="" sal-siredi="" rühmaga.="" see="" mõju="" võib="" tähendada="" kas="" suuremat="" uimastiotsingu="" käitumist="" esimesel="" kokkupuutepäeval,="" järjekindlust="" toidutasu="" saamiseks="" ja/või="" kognitiivse="" paindlikkuse="" vähenemist="" üleminekul="" toidult="" ravimile.="" see="" erinevus="" aga="" edasiste="" seansside="" jooksul="" ei="" püsinud.="" sal-sired="" hiirtel="" oli="" järjekindel="" statistiliselt="" oluline="" eelistus="" aktiivse="" hoova="" suhtes="" passiivsele="" kangile="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" kuid="" nic-sired="" hiirtel="" ei="" olnud="" seda="" eelistust="" seansside="" 3="" kuni="" 8="">

JOONIS 3 Isapoolne nikotiin vähendab nikotiini isemanustamist. NIC- ja SAL-sired isastel hiirtel (n=9-10 rühma kohta) ei erinenud iga seansi eest saadud infusioonide koguarv hankimisperioodil 0 0,03 mg/kg/infusiooniannus. B Omandamise ajal erines aktiivsete ja mitteaktiivsete kangivajutuste arv esimesel seansil märkimisväärselt, NIC-Sired hiirte nikotiinil oli suurem arv aktiivseid kangivajutusi võrreldes SAL-Sired hiirtega. Kuid järgnevate seansside jooksul vähenes NIC-Sired hiirte reageerimine, mille tulemusel ei esinenud olulisi erinevusi nende aktiivse ja mitteaktiivse kangivajutuste arvu vahel 3. kuni 8. seansside vahel. Seevastu SAL-Siredi loomadel oli aktiivse kangi suhtes statistiliselt oluline eelistus. üle nende passiivse kangi. C, nikotiini infusioonide keskmine arv kolme viimase omandamise seansi jooksul ei erinenud oluliselt NIC- ja SAL-Sired hiirtel. D, Mõõduka annuse 0,1 mg/kg/infusiooni korral manustati NIC-Sired hiired ise oluliselt väiksema arvu nikotiini infusioone. E, iha inkubeerimise hindamine näitas, et SAL-Sired hiirtel on pärast 21-päevast abstinentsi märgatavalt suurenenud reageerimine varem aktiivsele kangile. Vearibad näitavad keskmise standardviga (SEM), *P <>

Võimalike rühmade erinevuste edasiseks uurimiseks, kontrollides samal ajal varieeruvust omandamise algfaasis, uuriti nikotiini infusioonide keskmist arvu viimase kolme seansi jooksul, mil katsealused näitasid nikotiini suhtes järjekindlamaid vastuseid (joonis 3C). Rühmad ei erinenud oluliselt nikotiini infusioonide keskmise arvu poolest (P > .05). Seejärel viidi hiired üle nikotiini infusiooniannusele 0,1 mg/kg/infusioon, mida varem näidati olevat eelistatud täiskasvanud C57BL6/J hiirtel.44 Selle annusega manustati NIC-Sired hiired ise väiksema arvu infusioone (t{ {7}},20, P < 0,05;="" joonis="" 3d).="" iha="" käitumise="" inkubeerimiseks,="" mida="" peetakse="" abstinentsi="" ajal="" suurenenud="" narkootikumide="" otsimise="" mõõdupuuks,="" tuvastas="" kahesuunaline="" segadisaini="" anova="" koos="" seansi="" ja="" isaraviga="" seansi="" peamise="" mõju="" (f(1,17)="" {{16}="" },90,="" p="">< ,001).="" kui="" sal-sired="" loomadel="" ilmnes="" 21.="" karskusepäeval="" inkubatsiooniefekt="" suurema="" reaktsiooniga="" võrreldes="" 1.="" päevaga,="" siis="" nic-sired="" hiirtel="" ei="" ilmnenud="" nikotiini="" otsimise="" käitumise="" suurenemist="" (p=""><>

3.5. Isa kokkupuude nikotiiniga muudab hipokampuse kolinergilist seondumist ja funktsiooni

Hippokampuse kõrge afiinsusega heteromeerne nAChR seondumine oli NIC-sired F1 hiirtel ülesreguleeritud (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" },043,="" nic-sired="1,34" ±="" 0,044).="" üks="" uuritav="" (nic-sired)="" eemaldati,="" kuna="" seondumisväärtused="" olid="" kaks="" standardhälvet="" keskmisest="">

Kaaliumi ja nikotiini poolt esilekutsutud ACh voolude amperomeetrilisi salvestusi hinnati F1 dHPC ja vHPC puhul. Soolise valimi ebaühtlase suuruse tõttu ei kaasatud sugu nendesse analüüsidesse esialgse tegurina. KCl depolarisatsiooniga esile kutsutud kolinergilised signaalid ei erinenud SAL- ja NIC-sired hiirtel dHPC-s (P > 0,05; joonis 4A); nikotiini lokaalne manustamine põhjustas aga kolinergiliste signaalide amplituudide olulise vähenemise NIC-sired hiirtel (t8=2.33, P < .05;="" joonis="" 4c).="" vhpc="" puhul="" vähenes="" ach="" vabanemine="" nic-sired="" hiirtel="" pärast="" kcl="" (t8="2.60," p="">< 0,05;="" joonis="" 4b)="" või="" nikotiini="" (t8="2.98," p="">< 0,05)="" manustamist="" joonis="" fig="">

JOONIS 4 Isapoolne nikotiin vähendab kolinergilist signaaliülekannet hipokampuses. KCl-indutseeritud terminaalse depolarisatsiooni poolt esile kutsutud dHPC populatsiooni koliini signaalid. Olulisi erinevusi NIC- ja SAL-sired loomade vahel ei tuvastatud (n=5 rühma kohta). B, KCl-indutseeritud terminaalse depolarisatsiooni poolt esile kutsutud vHPC populatsiooni koliini signaalid vähenesid NIC-sired hiirtel. C, Nikotiini poolt esile kutsutud populatsiooni dHPC koliini signaalid vähenesid NIC-Sired hiirtel. D, Nikotiini poolt esile kutsutud populatsiooni vHPC koliini signaalid vähenesid NIC-Sired hiirtel. Seksi mõju kolinergilisele signaalile ei täheldatud. Vearibad näitavad keskmise standardviga (SEM), *P <>

3.6 Isa kokkupuude nikotiiniga muudab erinevalt dorsaalset ja ventraalset hipokampuse geeniekspressiooni

F1 hipokampuse transkriptoomi analüüs RNA-sekveneerimise abil näitas vHPC-s 952 erinevalt ekspresseeritud geeni (FDR=0.05; tabel S2). Nendest geenidest 612 oli NIC-Sired hiirtel allareguleeritud ja 340 ülesreguleeritud. dHPC-s ekspresseeriti NIC-sired hiirtel erinevalt ainult 162 geeni võrreldes SAL-Sired hiirtega (FDR=0.05). Nendest 162 geenist oli 86 alareguleeritud ja 76 ülesreguleeritud. VHPC ja dHPC vahel kattusid sada kolm muudetud geeniekspressiooniga geeni.

3.7. Isa kokkupuude nikotiiniga muudab närvisüsteemi arenguga seotud transkriptsiooniradasid

VHPC-s tuvastas IPA analüüs populaarseima võrgustiku "Neuroloogilised haigused, organismikahjustused ja kõrvalekalded, rakkude surm ja ellujäämine" (skoor=41, tabel S3) ja teine ​​​​suurim võrgustik "Närvisüsteemi areng ja talitlus, kudede morfoloogia, neuroloogiline haigus" (skoor=23). Molekulaarsete ja rakuliste funktsioonide viis parimat kategooriat olid: "Raku morfoloogia" (88 molekuli), "Raku koosseis ja organisatsioon" (79 molekuli), "Raku areng" (96 molekuli), "Raku funktsioon ja hooldus" (79 molekuli), ja "Cellular Growth and Proliferation" (87 molekuli). Kõige populaarsemad füsioloogilise süsteemi areng ja funktsioonid olid närvisüsteemi areng ja talitlus (175 molekuli) ning mõned parimad haiguste ja häirete funktsioonid hõlmavad neuroloogilisi haigusi (teine, 191 molekuli) ja psühholoogilisi häireid (neljas, 90 molekuli). ) (tabel S4).

Täiendavalt IPA tulemustele andis Enrichri kasutav rikastamisanalüüs täiendavaid tõendeid rakkude kasvu ja arengu muutuste kohta vHPC-s, kasutades parimaid GO bioloogilisi termineid, sealhulgas "RNA splaissimine", "vastus voltimata valgule" ja "rakkude kasvu reguleerimine" ja " valgu stabiliseerimine" (tabel S5). Vastavalt tuvastati "spliceosomaalne kompleks" GO rakulise terminina. KEGG raja analüüs Enrichri kaudu osutas lisaks splaissosoomide toimimisele ja MAPK signaalimisele kui potentsiaalselt mõjutatud radadele.

Vaatamata vHPC-ga võrreldes oluliselt lühemale erinevalt ekspresseeritud geenide loendile dHPC-s, tuvastati sarnased dHPC-ga rikastatud teed ja terminid (tabelid S3 ja S4). IPA analüüs tuvastas populaarseima võrgustiku „Käitumine, neuroloogilised haigused, organismikahjustused ja kõrvalekalded” (skoor=24) ja teine ​​kõrgeim võrgustik „Neuroloogilised haigused, organismikahjustused ja kõrvalekalded ning psühholoogilised häired (skoor=20). .

Viis parimat molekulaarsete ja rakuliste funktsioonide kategooriat dHPC-s olid "Raku areng" (29 molekuli), "Rakkude kasv ja proliferatsioon" (29 molekuli), "Raku morfoloogia" (27 molekuli), "Raku koosseis ja organisatsioon" (23 molekuli) ja "Cellular Function and Maintenance" (25 molekuli). "Närvisüsteemi areng ja talitlus" tuvastati taas füsioloogilise süsteemi arengu ja funktsioonide klassifikatsioonis (teine, 44 molekuli) kõige rikastatud terminina. Haiguste ja häirete funktsioonide klassifikatsiooni enim rikastatud terminid hõlmasid "neuroloogilist haigust" (1., 51 molekuli) ja "psühholoogilisi häireid" (viies, 31 molekuli). Enrichri kasutav rikastusanalüüs tuvastas dHPC jaoks võrreldes vHPC-ga mitu erinevat GO bioloogilist terminit, sealhulgas "neuronite surma reguleerimine" ja "aju areng" (tabel S5), mis täiendab IPA molekulaarset ja rakulist funktsiooni "Rakusurm ja ellujäämine".

dHPC ja vHPC vahel kattuvate erinevalt ekspresseeritud transkriptide funktsionaalse rolli edasiseks uurimiseks hinnati mõlema piirkonna ühiseid diferentseeritult ekspresseeritud geene (kokku 103). Kahe piirkonna kattuvad erinevalt ekspresseeritud transkriptid olid kõik alla- või ülesreguleeritud samas suunas, mis viitab ühistele muutustele transkriptsiooniteedes ajupiirkondades NIC-ga hiirtel. IPA tuvastatud viis parimat molekulaarsete ja rakuliste funktsioonide kategooriat olid "Rakkude surm ja ellujäämine" (17 molekuli), "Raku liikumine" (10 molekuli), "Rakkudevaheline signaalimine ja interaktsioon" (17 molekuli), "Rakkude kasv" and Proliferation" (18 molekuli) ja "Cell Morphology" (17 molekuli) (tabel S4)

DHPC ja vHPC jaoks ainulaadseid erinevalt ekspresseeritud geene analüüsiti seejärel IPA-s eraldi, et testida kahe piirkonna lahknevaid neurobioloogilisi kohandusi (tabel S6). Unikaalsete vHPC ainulaadsete dHPC analüüside vahel ei kattunud ükski rikastatud kanooniline rada. VHPC-le ainulaadsed rikastatud kanoonilised teed (kokku 44) hõlmasid "kaltsiumi signaaliülekannet" ja "glükokortikoidi retseptori signaalimist", samas kui populaarseimad dHPC kanoonilised teed (kokku kaheksa) hõlmasid "kilpnäärmehormooni metabolismi" ja "retinoehappe vahendatud apoptoosi signaalimist". VHPC-le ainulaadsed rikastatud haigused ja funktsioonid (kokku 295) hõlmasid "[Hipokampuse] Ammoni sarve moodustumist" ja "Rakuliste väljaulatuvate osade kogust", samas kui ainulaadselt dHPC-ga rikastatud haiguste ja funktsioonide terminid (kokku 111) hõlmasid "valgeaine põletikku" ja "demüeliniseerumist". ."

3.8. Isa kokkupuude nikotiiniga muudab hipokampuse DNA metüülimist

Viidi läbi suunatud DNA metüülimise analüüs, et teha kindlaks, kas muutunud DNA metüülimine vastavates regulatoorsetes piirkondades põhjustas diferentsiaalset geeniekspressiooni NIC-Sired F1 järglastel. Sihtmärgid hõlmasid 1114 erinevalt ekspresseeritud geeni, mis tuvastati kas dHPC-s või vHPC-s. vHPC-s tuvastati 11 erinevalt metüleeritud piirkonda (DMR), millest kaheksal oli suurenenud metüülimine ja kolmel vähenenud metüülimine (tabel 1). 11 DMR-st 10 asusid piirkondades, mis olid seotud vHPC-s muutunud ekspressiooniga geeniga. dHPC-s tuvastati 30 DMR-i, millest 15 näitas suurenenud metüülimist ja 15 näitasid metüülimise vähenemist. 30-st DMR-ist 29 asusid piirkondades, mis olid seotud geeniga, mille ekspressioon dHPC-s oli muutunud.

BenTistanche ehhinakosiidi efit

4 ARUTELU

Epigeneetiliste protsesside parem mõistmine koos hiljutiste andmetega, sealhulgas praeguste leidudega, on vaidlustanud traditsioonilise arusaama pärimisest. Ainuüksi genotüübist erinevad tegurid võivad määrata fenotüübid järgmistes põlvkondades ja ühe põlvkonna kokkupuuteid ei pruugita järglastelt eraldada. Käesolev uuring viitab sellele, et nikotiiniga kokkupuute kahjulikud tervisemõjud võivad ületada individuaalse kokkupuute ja mõjutada järgnevaid põlvkondi. Tuvastasime C57BL / 6J hiirtel C57BL / 6J hiirtel esineva eelarvamusega isa nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelise mõju Pavlovi hirmu konditsioneerimisele, mille tulemuseks on tugevamad hirmumälestused F1 ja F2 järglastel. Isa kokkupuude nikotiiniga vähendas ka nikotiini isemanustamist ja nõrgendas retsidiiviga seotud käitumist, mis viitab suuremale vastumeelsusele nikotiini suhtes. Nende käitumuslike erinevuste toetuseks täheldati mitme põlvkonna muutusi hipokampuse kolinergilises funktsioonis ja epigeneetilistes protsessides. Need tulemused koos viitavad muutustele närvisüsteemi funktsioonis nikotiiniga kokkupuutunud hiirte järglastel, mille tulemuseks on muutunud käitumuslikud fenotüübid.

Nikotiiniga kokku puutunud isaste hiirte F1 ja F2 järglastel ilmnes parem kontekstuaalne ja vihjatud hirmu konditsioneerimine. Vaatamata erinevustele kontekstuaalse hirmu väljasuremises NIC- ja SAL-Sired F1 hiirte vahel, näitasid NIC-Sired hiirtel kontekstuaalsete hirmumälestuste spontaanset taastumist. Oluline on see, et NIC- ja SAL-sired hiirte löögitundlikkuses ei leitud erinevusi, mis võiksid põhjustada suurenenud hirmu. Täiustatud hirmu konditsioneerimine võib viidata õppeprotsesside üldisele täiustamisele, mitte õppimishirmule spetsiifilisemate protsesside moduleerimisele. Siiski ei täheldatud NIC-Sired hiirtel muutusi uudsete objektide äratundmises, operantse toidu treenimises ega avatud väljas liikumises, kuigi tuvastati NIC-Sired emaste hiirte suurenenud EPM avatud käe aja soospetsiifiline mõju. Kuigi see ei välista võimalikke muudatusi teistes õppesüsteemides või kognitiivsetes protsessides, näitavad need leiud koos, et hirmuõpe võib olla tundlikum isa nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelise mõju suhtes. Veelgi enam, need leiud viitavad muutunud kolinergilisele funktsioonile NIC-Sired loomadel. Nikotiin moduleerib kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist. Kui äge nikotiin suurendab kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist,15,45 kroonilisest nikotiinist loobumine häirib kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist.16,21 Käesolevas uuringus suurendas äge nikotiin soolalahusega töödeldud hiirte F1 ja F2 hiirte kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist. Seevastu äge nikotiin häiris kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist NIC-Sired hiirtel ja ei avaldanud mõju NIC-vanaisa hiirtele, mis võib viidata muutunud kolinergilisele funktsioonile hipokampuses.

Isapoolse nikotiiniga kokkupuute mõju järgnevale nikotiini isemanustamisele F1 põlvkonnas viitab samuti häiritud kolinergilisele funktsioonile. Väiksema annusega IV nikotiini isemanustamise ajal ei erinenud rühmad nikotiini infusioonide arvu poolest, kuigi NIC-Siredi rühmas leiti aktiivsete kangivajutuste arvu suurenemist. See viitab sellele, et NIC-Sired hiired võisid olla järjekindlad toidutasu saamiseks ja/või vähenenud kognitiivne paindlikkus toidult ravimile reageerimisel. Siiski väärib ka märkimist, et rühmad ei erinenud iha inkubeerimise 1. päeval, mis tähistab väljasuremise seanssi (nt nikotiini infusioonid seansi ajal puuduvad), ja seega näib see efekt olevat ilmnenud ka tugevdajate kasutamisel. lülitatud, kuid mitte tugevdaja puudumisel kustutamisseansi ajal. NIC-Sired hiirtel ilmnes ka vähenenud nikotiini isemanustamine mõõdukas annuses, mis on kooskõlas hiljutise tööga alkoholi, kokaiini ja opioidide manustamise vähenemise kohta, mis on seotud vanemate alkoholi, kokaiini ja morfiini kokkupuutega (nt Vassoler et al,46 arvustanud Goldberg ja Gould47). Täheldatud nikotiini isemanustamise vähenemise põhjuseks võib olla tundlikkuse vähenemine nikotiini rahuldustpakkuva toime suhtes ja/või suurenenud tundlikkus nikotiini aversiivsete mõjude suhtes. Tõepoolest, rühmad erinesid mõõdukas nikotiiniannuses, kuid mitte madalamas nikotiiniannuses, mis toetab arusaama, et suurema annuse korral on suurenenud aversiivne reaktsioon. Huvitaval kombel avastasime NIC-Sired hiirtel ka 21. päeval iha inkubatsiooni puudumise pärast mõõduka annuse manustamist, mis viitab sellele, et nikotiini otsimise käitumise vähenemine võib olla seotud vastumeelsusega seotud mäluga nikotiini suhtes. Kuigi mitmesugused närvisubstraadid võivad olla nende mõjude aluseks nikotiini tarbimisele ja retsidiividega seotud reageerimisele, leidis hiljutine uuring, et DNA metüültransferaasi vähenemine hipokampuse CA1 piirkonnas vähendas morfiini isemanustamist.48 See leid koos kolinergilise hipokampuse funktsiooni teadaoleva funktsiooniga õppimis- ja mäluprotsessid, toetab veelgi nikotiini poolt vahendatud töötlemise katkemist NIC-Sired hiirte hipokampuses.

Samamoodi näitasid NIC-sired hiirtel suurenenud hipokampuse kõrge afiinsusega nAChR-i seondumist. Samuti leidsime kaaliumi poolt esilekutsutud ACh vabanemise vähenemise vHPC-s ja nikotiini poolt esile kutsutud ACh vabanemise vähenemist nii NIC-Sired loomade dHPC-s kui ka vHPC-s. Muutused depolarisatsioonist põhjustatud ACh vabanemises peegeldavad muutunud kolinergilist funktsiooni retseptori sidumisest allavoolu, samas kui muutused nikotiini poolt esile kutsutud ACh vabanemises peegeldavad muutunud nAChR funktsiooni. Need andmed on kooskõlas varasemate leidudega ülesreguleeritud kõrge afiinsusega nAChR-i seondumise kohta, mis järgneb nAChR-i funktsiooni vähenemisele.49 Kuna NIC-sired hiirte vHPC-s muutus nii kaaliumi kui ka nikotiini poolt esilekutsutud ACh vabanemine, võib vHPC olla tundlikum selle suhtes. isa nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna mõju. Teadaolevalt moduleerib DHPC kontekstuaalset hirmu tingimist.31,50 vHPC pärssimine häirib nii vihjatud kui ka kontekstuaalset hirmu seisundit51,52 ja vHPC kolinergilised kahjustused kahjustavad hirmu tingimist.53

Ürdi tsitanche

Samuti oleme näidanud, et nikotiini otsene infusioon dHPC-sse suurendab kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist, samas kui infusioon vHPC-sse häirib kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist.15 vHPC võib samuti moduleerida kontekstuaalsete hirmumälestuste spontaanset taastumist, kuna vHPC-eelse vooluringi inaktiveerimine vähendab kontekstuaalsete hirmumälestuste spontaanset taastumist. 54 Kuigi isa nikotiiniga kokkupuude võib mõjutada ka teisi hirmu konditsioneerimisega seotud ajupiirkondi, nagu amygdala,55, viitavad need leiud koos praeguste andmetega sellele, et muutused vHPC funktsioonis võivad põhjustada NIC-Sired hiirte hirmu muutumist. . Me oletasime, et isa nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna mõju võib olla seotud muutustega transkriptsiooni efektorites, mis toimivad nendest närvisüsteemidest ülesvoolu. F1 põlvkonna hiirte genoomi hõlmav transkriptsiooniline järjestus vHPC-s ja dHPC-s tuvastas 1114 erinevalt ekspresseeritud geeni NIC- ja SAL-Sired-hiirte vahel. See erinevus oli suurem vHPC-s (952) võrreldes dHPC-ga (162), mis on kooskõlas vHPC suurema muutusega võrreldes dHPC kolinergilise funktsiooniga ja muutustega nii kontekstuaalses kui ka vihjatud hirmu tingimises. Järgnev radade analüüs viitas ulatuslikele muutustele glükokortikoidide signaaliülekande ja neuraalse arengu / plastilisusega seotud transkriptsiooniteedes mõlemas hipokampuse piirkonnas.

VHPC-le omaste võimalike kohanduste tuvastamiseks viidi läbi raja analüüs, kasutades ainult kummagi hipokampuse alampiirkonna spetsiifilisi transkripte. Ükski rikastatud IPA kanooniline rada ei kattunud vHPC ja dHPC vahel, mis on funktsionaalselt erinevad hipokampuse alampiirkonnad.31 Kui dHPC ja vHPC vahel kattunud geenid eemaldati, hõlmasid vHPC ainulaadsed ülevalt rikastatud kanoonilised rajad "ainulaadset glükokortikoidi retseptori signaalimist", mis viitab , täiendav muutus glükokortikoidide toimimises selles piirkonnas võrreldes dHPC-ga. Eesmärgiga tuvastada ülesvoolu epigeneetilised regulaatorid, mis võivad mõjutada geeniekspressiooni, teostasime sihitud DNA metüülimise sekveneerimise, kasutades RNA-sekveneerimisest tuvastatud dHPC ja vHPC erinevalt ekspresseeritud geenide koostatud loendit. Üllataval kombel leidsime ainult 11 DMR-i vHPC-s ja 30 DMR-i dHPC-s NIC- ja SAL-Sired-i loomade vahel. Kuigi see on ootamatu, arvestades palju suuremat erinevalt ekspresseeritud transkriptide arvu vHPC-s, on DNA metüülimine vaid üks paljudest regulatiivsetest teguritest, mis võivad mõjutada geeniekspressiooni, ja DNA metüülimine ei too järjekindlalt kaasa muutunud geeniekspressiooni.56 11 vHPC DMR-ist seitse ilmnesid metüülimismustrid, mis olid kooskõlas diferentsiaalse transkriptsiooni suunaga (vähenenud transkriptsioon suurenenud DNA metüülimisega ja suurenenud transkriptsioon vähenenud metüülimisega). Erinevalt metüleeritud geenid vHPC-s hõlmasid Fkbp5, Ksr1 ja Pnpla2. Huvitaval kombel katkes Fkbp5 ja Ksr1 transkriptsioon ühes PTSD-i käitumuslikus hiiremudelis57, kus hiired puutusid kokku elektrilise jalalöögiga ja esitasid seejärel olukorra meeldetuletusi. Fkbp5 kodeerib glükokortikoidi retseptori šaperooni, mille toimimist on seostatud halvasti kohaneva pikaajalise stressireaktsiooniga PTSD ja muude ärevushäiretega inimestel.

Täpsemalt näitavad inimuuringud, et Fkbp5 metüülimine ja transkriptsioon korreleeruvad PTSD sümptomite tõsidusega, nii et suurenenud metüülimine ja vähenenud transkriptsioon ennustavad raskemat PTSD sümptomoloogiat.59,60 Fkbp5 ekspressioon moduleerib HPA-telje funktsioneerimist, mis arvatakse vahendavat selle osalust PTSD.59,61 Meie avastus hirmumälu paranenud spontaanse taastumise kohta koos glükokortikoidi signaaliülekandega seotud transkriptsiooniradade düsregulatsiooniga NIC-sired loomadel võib viidata suurenenud haavatavusele PTSD-sarnaste fenotüüpide suhtes. DHPC-s olid DMR-mustrid suures osas vastuolus RNA-sekveneerimisega leitud diferentsiaalse transkripti ekspressiooni suunaga, mis viitab sellele, et muutused vHPC DNA metüülimises, mis on põhjustatud isapoolsest nikotiiniga kokkupuutest, on geeniekspressiooni mõjutamise seisukohalt olulisemad kui dHPC-s. See on kooskõlas meie poolt tuvastatud suurema arvu erinevalt ekspresseeritud transkriptide ja rohkem liialdatud muutustega kolinergilises ülekandes NIC-Sired vHPC-s võrreldes dHPC-ga. Meie sihipärane sekveneerimise lähenemisviis võis piirata võimet tuvastada võimalikku transkriptsiooniregulatsiooni distaalselt metüülitud järjestuste abil. Tulevased uuringud, sealhulgas kogu genoomi hõlmava DNA metüülimise, histooni modifikatsioonide ja väikese RNA ekspressiooni analüüs, annavad nende leidude täielikuma tõlgenduse.

Meie nikotiiniga kokkupuute disaini potentsiaalne piirang on keskendumine isapoolsele nikotiiniga kokkupuutele, et uurida nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelist mõju. Kuigi teistes uuringutes, milles leiti, et pärast isa kokkupuudet narkootikumidega, sealhulgas kokaiiniga46 ja morfiiniga,62 leidsid mitmed/ülesed fenotüübid, ei leitud emahoolduses erinevusi, on võimalik, et isa kokkupuude nikotiiniga võib mõjutada emahooldust. Tulevased uuringud, mis uurivad mõju emahooldusele, on õigustatud. Kuna meie praegune fookus oli isa kokkupuutel, peaks tulevane töö võrdlema ka isa ja ema kokkupuute mõju. Üldiselt annavad praegused leiud uudse arusaama nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelisest mõjust, mida toetab kasvav kirjandus, mis iseloomustab ravimitega kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadevahelisi mõjusid (nagu on läbi vaadatud Goldbergis ja Gouldis47). See uuring oli esimene, mis testis kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist nikotiiniga kokkupuutunud meeste F1 ja F2 järglastel ning tuvastas suurenenud hirmumälu teket ja hirmumälestuste spontaanset taastumist. See uuring oli ka esimene, mis tuvastas F1 nikotiiniga kokkupuutunud järglaste muutunud nikotiini isemanustamise ja iha inkubatsiooni.

NIC-Sired hiirtel leiti diferentsiaalne metüülimine geenides, mis on seotud PTSD ja HPA-telje düsregulatsiooniga, ning samaaegsed häired stressiga seotud transkriptsiooniteedes. Isa nikotiini seostati ka vähenenud hipokampuse kolinergilise funktsiooniga ja suurenenud hipokampuse nAChR seondumisega. Huvitaval kombel näitavad PTSD-ga patsiendid, kes ei suitsetanud, oluliselt suuremat mesiotemporaalset kortikaalset kõrge afiinsusega nAChR-i sidumist63 ning PTSD-d seostatakse suurema hirmu tekitamise ja kustunud hirmumälestuste spontaanse taastumisega.64 Meie tulemused näitavad koos, et nikotiiniga kokkupuutel võib olla mitme põlvkonna mõju. järglaste vastuvõtlikkuse suurenemine PTSD-sarnaste sümptomite suhtes. See leid koos muude hiljutiste leidudega, mis näitavad nikotiiniga kokkupuute mitme põlvkonna mõju kognitiivsele paindlikkusele2, viitavad sellele, et nikotiiniga kokkupuute negatiivsed tervisemõjud loovad laiema võrgu, kui seni arvati.

Cistanche ekstrakt

VIITED

1 Dai J, Wang Z, Xu W jt. Isa nikotiini ekspositsioon määratleb erineva käitumise järgnevas põlvkonnas mmu-miR-15b hüpermetüleerimise kaudu. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE jt. Isaste hiirte kokkupuude nikotiiniga põhjustab mitme põlvkonna järeltulijate käitumishäireid. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Hüperaktiivsuse põlvkondadevaheline ülekanne ADHD hiiremudelis. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Muutuv avalik pilt suitsetamisest Ameerika Ühendriikides: 1964-2014. Vähiepidemiooli biomarkerid Eel. 2014;23(1):32-36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Elektrooniliste sigarettide kasutamine keskkooliõpilaste seas ja selle seos sigarettide kasutamise ja suitsetamisest loobumisega, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 ja 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG jt. Kroonilise nikotiini pikaajaline mõju emotsionaalsele ja kognitiivsele käitumisele ning hipokampuse rakkude morfoloogiale hiirtel: täiskasvanute ja noorukite nikotiiniga kokkupuute võrdlused. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Seos sigarettide suitsetamise ja ärevushäirete vahel noorukieas ja varases täiskasvanueas. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM jt. Epigeneetiline mehhanism vahendab nikotiini arengumõju neuronite struktuurile ja käitumisele. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Koliin leevendab täiskasvanute õppimise puudujääke ja pöörab ümber kromatiini remodelleerumisfaktorite epigeneetilise modifikatsiooni, mis on seotud noorukite nikotiini kokkupuutega. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239-248.

10. Lind A. Epigeneetika arusaamad. Loodus. 2007; 447:396-398.

11. Skinner MK. Keskkonna epigeneetiline transgeneratiivne pärand ja somaatiline epigeneetiline mitootiline stabiilsus. Epigeneetika. 2011; 6:838-842.

12. Davis JA, Gould TJ. Assotsiatiivne õppimine, hipokampus ja nikotiinisõltuvus. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9-19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikotiinisõltuvus ja psühhiaatrilised häired. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. nAChR-i düsfunktsioon kui skisofreenia ja kaasuva nikotiinisõltuvuse tavaline substraat: praegused suundumused ja perspektiivid. Schizophr Res. 2016; 171:1–15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotiiniretseptorid dorsaalses ja ventraalses hipokampuses moduleerivad erinevalt kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist. Hipokampus. 2012; 22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Geneetiline taust mõjutab kroonilisest nikotiinist loobumise mõju õppimisele ja kõrge afiinsusega nikotiini atsetüülkoliini retseptori seondumisele dorsaalses ja ventraalses hipokampuses. Psühhofarmakoloogia (Berl). 2013; 225 (1): 201–208.

17. Davis JA, Gould TJ. DHBE ja MLA mõju nikotiini poolt indutseeritud kontekstuaalse hirmu konditsioneerimise võimendamisele C57BL/6 hiirtel. Psühhofarmakoloogia (Berl). 2006; 184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Noorukieas ja noorukieas hiired on vähem tundlikud ägeda nikotiini mõjude suhtes väljasuremisele ja spontaansele taastumisele. Brain Res Bull. 2018;138:50-55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Äge nikotiin lükkab hiirtel edasi kontekstuaalse hirmu väljasuremist. Behav Brain Res. 2014; 263:133-137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikotiini keemia, ainevahetus, kineetika ja biomarkerid. In: Nikotiini psühhofarmakoloogia. Berliin, Heidelberg: Springer; 2009:29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Kroonilisest nikotiini manustamisest loobumine kahjustab C57BL / 6 hiirtel kontekstuaalset hirmu. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Võrdlev uuring nikotiini ja selle metaboliitide jaotumise kohta kolmes sisearetatud hiirte tüves. Drug Metab Dispos. 1984; 12:725-731.

23. Gould TJ, Portugali GS, Andre JM jt. Nikotiini ärajätmisega seotud defitsiidi kestus kontekstuaalses hirmu konditsioneerimises on paralleelne hipokampuse kõrge afiinsusega nikotiini atsetüülkoliini retseptori ülesreguleerimise muutustega. Neurofarmakoloogia. 2012;62:2118-2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Kroonilise nikotiini põhjustatud kontekstuaalse hirmu väljasuremise halvenemine ja kroonilisest nikotiinist loobumine on seotud hipokampuse nAChR ülesreguleerimisega. Neurofarmakoloogia. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Hiire spontaanse ja sadestunud nikotiini ärajätmise iseloomustus. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowleri CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenulaarse alfa5 nikotiiniretseptori subühiku signaalimine kontrollib nikotiini tarbimist. Loodus. 2011; 471:597-601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Heteromeersete neuronaalsete nikotiiniretseptorite kvantitatiivne analüüs roti hipokampuses. J Neurochem. 2010;115:625-634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Paralleelsed anksiolüütilised toimed ja neuronaalsete nikotiini atsetüülkoliini retseptorite ülesreguleerimine pärast kroonilist nikotiini ja varenikliini. Nicotine Tob Res. 2011;13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontaalsed beeta2 subühikut sisaldavad ja alfa7 nikotiini atsetüülkoliini retseptorid kontrollivad erinevalt glutamatergilist ja kolinergilist signaaliülekannet. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.

30. Parikh V, Starter M. Eesaju kolinergilised süsteemid ja tunnetus: uued teadmised, mis põhinevad koliini naelu kiirel tuvastamisel ensüümipõhiste biosensorite abil. In: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013: 257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Kas dorsaalne ja ventraalne hipokampus on funktsionaalselt erinevad struktuurid? Neuron. 2010;65(1):7–19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: transkriptoomide täpne joondamine insertsioonide, deletsioonide ja geenifusioonide juuresolekul. Genome Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M jt. Galaxy platvorm juurdepääsetavate, reprodutseeritavate ja koostööl põhinevate biomeditsiiniliste analüüside jaoks: 2016. aasta värskendus. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G jt. Transkripti kokkupanek ja kvantifitseerimine RNA-Seq abil näitab märkusteta transkripte ja isovormide vahetamist rakkude diferentseerumise ajal. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Controlling the false discovery rate in behavior gentics research. Behav Brain Res. 2001; 125 (1–2): 279–284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Põhjusliku analüüsi lähenemisviisid leidlikkuse raja analüüsis. Bioinformaatika. 2014;30(4): 523-530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD jt. Enrichr: põhjalik geenikomplekti rikastamise analüüsi veebiserveri 2016 värskendus. Nucleic Acids Res. 2016;44 (W1): W90-W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Sihtotstarbeline vesiniksulfiidi sekveneerimine, kasutades SeqCap epi rikastamissüsteemi. Meetodid Mol Biol. 2018;1708:383-405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: paindlik trimmer Illumina järjestuse andmete jaoks. Bioinformaatika. 2014;30(15):2114-2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Kiire tühikuga lugemise joondamine Bowtie 2. Nat meetodiga. 2012;9(4):357-359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: paindlik joondus- ja metüülimise kutsuja Bisulfite-Seq rakenduste jaoks. Bioinformaatika. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S jt. methylKit: terviklik R-pakett kogu genoomi hõlmavate DNA metüülimisprofiilide analüüsimiseks. Genome Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotiin suurendab kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist ja leevendab etanoolist põhjustatud puudujääke kontekstuaalses hirmu konditsioneerimises. Neurosci käitumine. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowleri CD, Kenny PJ. Nikotiini intravenoosne isemanustamine ja näpunäidetest põhjustatud taastamine hiirtel: nikotiini annuse mõju, ravimi infusiooni kiirus ja eelnev instrumentaalne koolitus. Neurofarmakoloogia. 2011;61(4):687-698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotiin suurendab kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist. Behav Brain Res. 1999; 102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Kokaiiniresistentsuse fenotüübi epigeneetiline pärand. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Isade kuritarvitamise narkootikumidega kokkupuute mitme põlvkonna ja põlvkondadeülene mõju käitumuslikule ja närvifunktsioonile. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W jt. DNMT3a hipokampuse CA1-s on otsustava tähtsusega morfiini isemanustamise omandamisel rottidel. Addict Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Nikotiini kolinergiliste retseptorite sidumissaidid ajus: regulatsioon in vivo. Teadus. 1983; 220 (4593): 214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hippokampuse kahjustused põhjustavad Morrise veelabürindi sisearetatud hiirtel õppimishäireid ja konditsioneeritud hirmu ülesandeid. Neurosci käitumine. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventraalne hipokampus ja hirmu konditsioneerimine rottidel: erinevad anterograadsed hirmuamneesiad pärast N-metüül-D-aspartaadi või selle mittekonkureeriva antagonisti MK-801 infusiooni ventraalsesse hipokampusesse. Behav Brain Res. 2001;126(1-2):159-174.

52. Maren S, Holt WG. Hippokampus ja Pavlovi hirmu konditsioneerimine rottidel: muskimooli infusioonid ventraalsesse, kuid mitte dorsaalsesse hipokampusesse kahjustavad tingimusliku külmumise omandamist kuulmis-tingimuslikuks stiimuliks. Neurosci käitumine. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Broca kolinergiliste projektsioonide mediaalse vaheseina ja ventraalse hipokampuse diagonaalsete ribade katkemine häirib kuulmishirmu mälu. Neurobiol Learn Mem. 2018; 152:71-79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Prelimbilisesse ajukooresse projitseerivate ventraalsete hipokampuse rakkude rajaspetsiifiline aktiveerimine vähendab hirmu uuenemist. Neurobiol Learn Mem. 2019; 161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Lateraalne amügdaloidtuum: amügdala sensoorne liides hirmu konditsioneerimisel. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. DNA metüülimise funktsioonid: saared, alguskohad, geenikehad ja muu. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X jt. Piirkonnast ja ajast sõltuv geeniregulatsioon PTSD-taolise hiiremudeli mandelkehas ja eesmises tsingulaarses ajukoores. Mol Aju. 2019;12(1):25.

58. Sideaine EB. FKBP5, glükokortikoidi retseptori kaassaperooni roll afektiivsete ja ärevushäirete patogeneesis ja ravis. Psühhoneuroendokrinoloogia. 2009;34 (lisa 1): S186-S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM jt. PTSD riski ja vastupidavuse geneetilised markerid Maailma Kaubanduskeskuse rünnakute ellujäänute seas. Dis markerid. 2011;30(2-3):101-110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F jt. Epigeneetilised biomarkerid kui PTSD-ga võitlusveteranide psühhoteraapia järgsete sümptomite paranemise ennustajad ja korrelatsioonid. Front Psych. 2013; 4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA jt. Posttraumaatilise stressihäirega seotud geeniekspressiooni mustrid pärast kokkupuudet Maailma Kaubanduskeskuse rünnakutega. Biol Psühhiaatria. 2009; 66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF jt. Ärevusetaolise käitumise areng hipokampuse IGF-2 signaaliülekande kaudu vanemate morfiiniga kokkupuute järglastel: rikastatud keskkonna mõju. Neuropsühhofarmakoloogia. 2014;39(12):2777-2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S jt. beeta2 Nikotiinse atsetüülkoliini retseptori kättesaadavus traumajärgse stressihäire korral. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB jt. Väljasuremismälu meeldejätmise neurobioloogiline alus posttraumaatilise stressihäire korral. Biol Psühhiaatria. 2009;66(12):1075-1082.