2. osa: Uudne lähenemine endoteeli eellasrakkude ringlevate endoteeli eellasrakkude regeneratiivse potentsiaali suurendamiseks lõppstaadiumis neeruhaigusega patsientidel

Rohkem infot. Kontakttina.xiang@wecistanche.com

3. Tulemused

3.1.Patsiendi demograafia

Selles uuringus osalenud kontroll- ja ESKD-patsiendirühmad on loetletud tabelis 1. ESKD patsientide demograafilised parameetrid, sealhulgas keha pikkus ja kaal, dialüüsi vintage, haiguste etioloogia ja alkoholi tarbimine, registreeriti ja koguti Monash Healthi, Claytoni, Victoria, Austraalia meditsiinilistest dokumentidest.

Kuigi epc-kultuuride hilised kultuurid kõigilt n =9 tervetelt patsientidelt saadi edukalt (saagikusest ~1,5±0,3× 10° rakke/ml verd), saadi andmeid n=6-7 eraldi patsiendist saadud kultuuridest ravirühma kohta, et viia lõpule erinevad läbiviidud analüüsid. Kuid ainult viis EPC kultuuri n = 11 ESKD patsiendi saadud vereproovidest küpsesid hilisteks EPC-deks (saagikusest ~ 2,2±0,3×10 ° rakud / ml verd), millest saadi andmeid n = 3-5 eraldi patsiendi saadud kultuuridest ravirühma kohta. Lisaks ESKD patsientidelt saadud EPCcolonies'e arv (4.3±1.9;p<0.01 vs.="" epccolonies="" derived="" from="" patients)was="" significantly="" lower="" than="" those="" obtained="" from="" healthy="" patients="" (19.3±8.6;="" n="4" samples="" per="">

Klõpsake siin, et tutvuda kõrbe ženšenni tsistanche'iga

3.2. Kontrollpatsientidest saadud EFC-de funktsionaalne analüüs

Tervetelt meestelt saadud ja kultiveeritud hilised EPC-d väljendasid RXFP1 retseptorit oma rakupinnal, nagu on näidatud joonisel 1A. Hilised EPC-d näitasid proliferatiivse võimsuse märkimisväärset suurenemist (~43%) pärast 24 tunni möödumist (joonis 1B); EPC-indutseeritud torude moodustumine (vastavalt toru pikkusele (~ 45%) ja harude, ristmike ja võrgusilmade arvule (~ 60-90%) pärast 4 h (joonis 1C) ja EPC-indutseeritud haavade paranemist (~ 60%)pärast 8 h (joonis 1D), võrreldes töötlemata rakkudega, kui seda stimuleerib 10ng / ml RLX (kõik p<0.05 vs.unstimulated="" cells),="" but="" not="" by="" 25%="" bm-msc-cm="" or="" 1="" ng/ml="">

Hämmastavalt suurendas 25% BM-MSC-CM ja 10 ng/ml RLX kombineeritud mõju EPCproliferatsiooni veelgi (~ 1,3-kordselt;p<0.001 vs.25%="" bm-msc-cm="" or="" 10="" ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 1b),="" epc-induced="" tube="" formation="" (including="" tube="" length="" (by~65%)and="" the="" number="" of="" branches,="" junctions="" and="" meshes="" (by~1.1-2.4-fold;="" figure="" 1c)="" over="" the="" same="" time-period="" and="" epc-induced="" wound="" healing="" (by="" ~87-88%)="" after="" 4-8="" h=""><0.01 vs.25%bm-msc-cm="" after="" 8="" h;="" figure="">

Võrdluseks, 20% loote veiste seerum (positiivne kontroll)stimuleeris EPC vohamist (~60%)pärast 24 h (p<0.001 vs.="" unstimulated="" cells;="" figure="" 1b)="" but="" failed="" to="" stimulate="" epc-induced="" capillary="" tube="" formation="" (figure="" 1c).="" based="" on="" these="" findings="" from="" healthy="" patient-derived="" epcs,="" the="" effects="" of="" 25%="" bm-msc-cm="" and/or="" 10="" ng/ml="" rlx="" were="" then="" evaluated="" on="" eskd="" patient-derived="">

Joonis 1.BM-MSC-st saadud CM ja/või RLX-i mõju patsiendi tervele epc elujõulisusele/vohamisele, angiogeneesile ja haavade paranemisele. Leiti, et CD34t hilised EPC-d tervete meespatsientide verest ekspresseerivad kongnaadi RLX retseptorit RXFP1; skaalariba =50 μm (A).EPC vohamine 24 tunni (24 h) järel n =7patsient-tuletatud EPC-st rühma kohta (B); EPC-vahendatud torude moodustumine (määratakse torude kogupikkusest, harude arvust, ristmike arvust ja võrgusilmade arvust) pärast 4 h alates n = 6 patsiendi poolt saadud EFC-st rühma kohta (C) ja EPC-vahendatud haavade paranemine pärast 4 h ja 8 h n = 6patsient-tuletatud EPC-st rühma kohta (D), määrati vastuseks 20% loote veiste seerumile (FBS; positiivne kontroll); 25% BM-MSC-CM(25% CM), RLX [1 ng/ml (RLX-1)või 10ng/ml (RLX-10)]või 25% CM ja RLX-1 või RLX-10 koosmõjud. Haavade täielik sulgemine saavutati ravimata EFC-de abil 24 tunni jooksul. Näidatakse representatiivseid kujutisi töötlemata EFC-de ja EPC-de kapillaaride torude moodustumisest, mida töödeldakse ainult 25% CM-ga või koos RLX-10 (C) ja haavade sulgemisega töötlemata EFC-dest ning nendest, mida ravitakse 25% CM +RLX-10(D-ga). Iga ribagraafiku veeru värvilised ringid tähistavad iga rühma üksikuid andmepunkte. Andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Tukey post-hoc test, et võimaldada rühmade vahel mitut võrdlust.*p<><><0.001 vs.untreated=""><><001, *=""><0001vs.25%cm-treated><><0.001 vs.rlx1-treated=""><><0.001 vs.rlx-10-treated=""><><0.01 y.25%cm+rlx-1-treated="">

3.3. ESKD patsientidelt saadud EPC funktsionaalsed analüüsid

Nagu eelnevalt kirjeldatud, küpsesid ainult viis EPC kultuuri n = 11 ESKD patsiendi saadud vereproovidest hilinenud EPC-deks, millest andmed saadi n = 3-5 eraldi patsiendist saadud kultuuridest / ravirühmadest. Need ESKD patsiendist saadud EPCd väljendasid endiselt RXFP1(mis viitab sellele, et nad võivad reageerida ka RLX-ravile; Joonis 2A), kuid oli vähendanud elujõulisust ja proliferatiivset suutlikkust (~70%; p< 0.01="" vs.="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients)="" compared="" to="" their="" counterparts="" isolated="" and="" grown="" from="" normal="" patients="" (figure="" 2b).="" interestingly,="" the="" addition="" of="" 20%="" fbs="" (positive="" control)and="" all="" treatments="" evaluated,="" stimulated="" epc="" proliferation="" (by~1.2-1.6-fold)="" after="" 24="" h,="" almost="" back="" to="" levels="" that="" were="" measured="" from="" untreated="" epcs="" from="" normal="" patients(all="" no="" different="" from="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients;="" figure="" 2b).10="" ng/ml="" rlx="" alone="" promoted="" epc-mediated="" tube="" length,="" number="" of="" junctions="" and="" number="" of="" meshes="" after="" 4h="" (all="" by~1-2.5-fold),="" whereas="" all="" three="" measures="" in="" addition="" to="" the="" number="" of="" branches="" were="" further="" increased="" by="" the="" combined="" treatment="" (all="" by~3.1-4.2-fold;="" all=""><0.05 vs.25%bm-msc-cm="" or="" 10ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 2c).="" epc-induced="" wound="" healing="" in="" vitro="" from="" eskd="" patients="" took="" longer="" to="" achieve="" compared="" to="" that="" from="" healthy="" patients="" but="" was="" more="" rapidly="" stimulated="" by="" 10="" ng/ml="" rlx(by~54%)or="" the="" combination="" therapy="" (by="" ~63%)="" to="" almost="" complete="" closure="" after="" 24="" h="" (figure="">

Joonis 2. BM-MSC-st saadud CM ja/või RLX mõju V staadiumi ESKD patsiendi poolt saadud EPC elujõulisusele/vohamisele, angiogeneesile ja haava paranemisele. Samuti leiti, et ESKD meessoost patsientide verest saadud hilised EPC-d väljendavad RXFP1; skaalariba = 50 um (A). EPC vohamine 24 tunni pärast (24 h) määrati n = 4 patsiendi poolt saadud EPC-st rühma kohta vastuseks 20% FBS-ile (positiivne kontroll), 25% BM-MSCCM-ile (25% CM), RLX -le [10 ng/ml (RLX-10)] või 25% CM+RLX-10 kombineeritud toimele. Võrdluseks on lisatud ka tervetelt meespatsientidelt saadud ravimata epc-de andmed (esitatud joonisel 1B). EPC-vahendatud toru moodustumine (määratud torude kogupikkusest, harude arvust, ristmike arvust ja võrgusilmade arvust) pärast 4h alates n = 3 patsiendi poolt saadud EPC-d rühma(C) ja EPC-vahendatud haava paranemise kohta pärast 24h n = 5 patsiendi poolt saadud EPC-d rühma kohta (D) määrati vastuseks 25% BM-MSC-CM(25% CM), RLX[10 ng/ml (RLX-10)] või kombineeritud mõjule 25% CM +RLX-10. Näidatakse esinduslikke pilte torude moodustumisest(C) ja haavade sulgemisest (D) igast neljast analüüsitud rühmast. Iga ribagraafiku veeru värvilised ringid tähistavad iga rühma üksikuid andmepunkte; samal ajal kui on näidatud kumulatiivne % haavade paranemise sulgemine igast üle 24 tunni uuritud ravirühmast (C).*p<><><0001 vs="" untreated=""><><001 vs.25%cm-treated="" cells;=""><0.05,><0.01 vs.rlx-10-treated="">

4. Arutelu

Varasemad uuringud on näidanud, et ESKD patsientidel on ESKD-de arv vähenenud, mis on korrelatsioonis haigustest põhjustatud suremuse olulise suurenemisega. Samuti teatati, et pikaajaline hemodialüüs, mida peetakse ESKD peamiseks raviks, võib samuti aidata suurendada seda ESKD-indutseeritud EPC-de kadu patsientidel. Kuid teised uuringud on samuti teatanud, et ESKD patsientide hemodialüüs ei suutnud taastada ainult EFC-de võimet paljuneda ja migreeruda in vitro võrreldes tervetel patsientidel saadud EPC-dega. Need kombineeritud leiud andsid alust arvata, miks on hädasti vaja mõjureid, mis võiksid parandada Epc levikut ja funktsiooni. Kuna allogeensete ravimite EPCyield'i laiendamine on osutunud mõnevõrra raskeks ja aeganõudvaks, pakkus meie uuring välja uudse ravi, kombineerides BM-MSC-st saadud CM-i ja RLX-i, et suurendada EPC levikut ja suurenenud EPC-de funktsionaalseid võimeid in vitro, keskendudes peamiselt kontseptsiooni tõestusuuringule otsese kliinilise tõlke jaoks, et moduleerida EFC in vivo regeneratiivset suutlikkust. Esimest korda näitas see uuring terapeutilist potentsiaali kombineerida BM-MSC-CM-i ja RLX-iga, et edendada inimese EPCde elujõulisust, proliferatiivset ja regeneratiivset suutlikkust.

Selles uuringus näitasime varajaste ja hiliste EPC-de edukat isoleerimist ja iseloomustamist tervete ja ESKD patsientide verest, mis koguti väikesest kogusest verest (umbes 5-40 ml). Enamikus varasemates uuringutes on epc-de isoleerimiseks kasutatud umbes 50 ml perifeerset verd algmahuna [24-26]. Mõnes uuringus ei märgitud EPC isolatsiooniks vajaliku vere algmahtu. Lisaks tuvastati hilised EPC-d vastavalt nende morfoloogiale, nende väga proliferatiivsele võimele ja nende kolooniate moodustumisvõimele 20 ml perifeersest verest, mis viitab sellele, et epc-de saamiseks, mis võivad paljuneda, oli vaja vähemalt 20 ml perifeerset verd. Selles uuringus, kuigi ESKD patsientide valiminumbrid pärinesid kontrollalustega võrreldes väikesest kohordist, mille algmaht oli ~5 ml perifeerset verd, tuvastasime, et EPC saagikus ei olnud mitte ainult madal, vaid ei saanud alati läbida diferentseerumise progresseerumist hilistesse EPC kolooniatesse. Lisaks täheldati varajasi EFC-sid tervislikust kontrollist kultuuripäevadel 6.–10. päeval, samas kui hilised epc-d ilmusid pärast 14–28 päeva kultuuris. Need tähelepanekud olid kooskõlas varasemate aruannetega [25]. Mitmed tegurid võivad aidata kaasa PBMCde diferentseerimisele või muutumisele varajasteks ja hilisteks majanduspartnerluslepinguteks.

Kuigi ainuüksi BM-MSC-d võivad põhjustada neerus reparatiivset toimet põletikuvastase, apoptootilise, antioksüdandi, angiogeense toime ja EPC-de stimuleerimise kaudu, on nende tüvirakkude terapeutiline efektiivsus krooniliste haiguste tingimustes tõsiselt ohustatud 30. Samuti on näidatud, et BM-MSC-del on suurem renoprotektiivne toime paljudes erinevates katsemudelites ja neid hinnatakse praegu erinevates kliinilistes uuringutes [31]. Vähem uuringuid on siiski uurinud MSC-de angiogeenset rolli fibrootilistes mudelitesneeruhaigus. Ühes uuringus teatati MSC mõjust neeru veresoontele, kus kasvufaktoritega rikastatud BM-MSC konditsioneeritud meedia, nagu VEGF, HGF ja IGF-1, suutis suurendada Aordi EÜ kasvu ja vohamist. Lisaks täheldati Alporti tõve prekliinilise mudeli (geneetiline seisund, mida iseloomustavad neeru mikrovaskulaarsed kõrvalekalded ja funktsionaalne puudulikkus) uuringus, et MSC-CM-ga ravitud hiired väljendasid vegfr mRNA kõrget taset neerudes, kuid mitte ringluses, ning samuti paranesidNeeruEÜ levik in vitro.

Varasemas uuringus leiti, et tsütokiinid ja kasvufaktorid nabanööri-MSC CM-s suurendasid oluliselt torude arvu ja inimese nabanööri vaskulaarsete endoteelirakkude (HUVEC) haavade taastumise protsenti in vitro. Selle omaduse aluseks olev mehhanism tuvastati tsütokiinide SDF-1-CXCR4 ja MCP-1 suurenenud väljenduse kaudu, mis suurendas HUVEC-de migratsioonikiirust, et sulgeda haavade paranemise analüüsides tekkinud haavapiirkond. Kuid arvestades meie varasemaid uuringuid, mis näitasid, et ainuüksi 100% BM-MSC-CM võib oluliselt stimuleerida EPC vohamise, kapillaaride torude moodustumise, angiogeneesi ja haavade paranemise meetmeid, samas kui BM-MSC-CM tiitrimine 25% -ni vähendas neid mõjusid, kasutas praegune uuring 25% BM-MSC-CM kasutamist, et optimaalselt oleks võimalik kindlaks määrata 25% CM ja RLX-i võimalikud sünergilised mõjud.

RLX näitab oma angiogeenset potentsiaali, indutseerides VEGF-i ja põhilise fibroblasti kasvufaktori (bFGF) hiirte haavakohtades. Lisaks on näidatud, et RLX suurendab inimese luuüdi-EPC-st saadud rakusisest NO-d ja hiirte rännet, mis viitab sellele, et RLX võib soodustada angiogeneesi in vivo. Siiski täheldati, et RLX ei olnud otseselt seotud ECdega, vaid pigem indutseeris angiogeneesi oma võime kaudu edendada kasvutegureid, mis mängivad rolli haavade paranemisel. Vastupidi, see uuring näitas, et EFC-de elujõulisust/vohavust, torude moodustumist ja haavade paranemise võimet suurendas oluliselt 10 ng/ml RLX-i manustamine, mis on kooskõlas varasemate leidudega[18]. Lisaks täheldati, et nii varajased kui ka hilised EPC-d väljendasid RXFP1 retseptorit, mis näitas, et RLX suudab otseselt seonduda oma retseptoriga EPCproliferatsiooni ja EPC-indutseeritud angiogeneesi in vitro.

Varasemad uuringud meie laborist on näidanud, et BM-MSC-de ja RLX-i kombineerimine tõhusalt nõrgestatud või ümberpööratud organpõletikja fibroos obstruktiivse nefropaatia muriinimudelites [15], hüpertensiivneCKDvõi krooniline allergiline hingamisteede haigus (AAD)[37] in vivo. Selle uuringu tulemused on nüüd neid tulemusi laiendanud, et näidata, et BM-MSC-st saadud CM-i ja RLX-i kombineeritud mõju võib suurendada inimese ESKD patsiendist saadud EPC-de elujõulisust ja vohamiskiirust in vitro (normaalsetel patsientidel mõõdetud tasemetele) ja nende rakkude võimet edendada angiogeneesi. Seda näitas kombineeritud ravi suurenenud võime soodustada EPC-indutseeritud kapillaaride torude moodustumist ja haavade paranemist võrreldes ainult CM-iga. Sellega seoses on võimalik, et RLX-i NO-vahendatud vaskulogeenset toimet, mille tulemuseks oli EPC numbri RLX(at 10ng/ml) indutseeritud suurenemine ja EPC vahendatud haavade paranemine, suurendati sünergiliselt angiogeensete vahendajate (nagu VEGF ja bFGF) EPC-d soodustava toimega, mida BM-MSC-CM sekreteerib ja stimuleerib RLX. Vaatamata selle uuringu ex vivo iseloomule ja analüüsitud ESKD patsiendi tuletatud EPC kultuuride väikesele arvule, olid hinnatud kombineeritud ravi sünergilised eelised selgelt ilmsed.

5. Järeldused

Kuna allogeensete ravimite EPC saagikuse laiendamine on osutunud keeruliseks ja aeganõudvaks, võib see uudne ravi olla ESKD-haigete raviks suur lubadus. Üldiselt on selle uuringu tulemused suure kliinilise tähtsusega, eriti ESKDpatsientide puhul, kus ringlevate EPC-numbrite kadumine aitab kaasa kasvu ja angiogeneesi halvenemisele, ebasoodsatele kardiovaskulaarsetele tulemustele ja sellega seotud suremusele. Lisaks, kuna ESKD patsiendid surevad sagelivaskulaarsed haigused(ateroskleroos, insult, perifeerne vaskulaarne haigus) [40], see kombineeritud ravi võib pakkuda uudset vahendit vaskulaarse haiguse progresseerumise aeglustamiseks nendel patsientidel. Veelgi enam, uue ravi väljatöötamine, mis võib aeglustada CKD-de progresseerumist, säästab tervishoiusüsteemi miljardeid dollareid neeru asendusravis. Kuna nii MSC-sid kui ka RLX-sid hinnatakse juba kliiniliselt, saab seda kombineeritud ravi sisaldavaid uudseid strateegiaid inimkatsete jaoks kiirendada.